蛋白质制备及含量测定(凯氏定氮法)
简述凯氏定氮法测定蛋白质的步骤
简述凯氏定氮法测定蛋白质的步骤
氏定氮法测定蛋白质是一种主要用于测定样品中蛋白质浓度的
常用方法，他能够快速、准确可靠地测量蛋白质氮含量，且使用简单方便，且是目前测定蛋白质浓度的主要方法之一。
1、样品制备
首先，将准备好的蛋白质样品放入容器中，最好使用提取液中的核酸分子进行提取，例如可使用聚乙二醇（PEG）、乙二胺（EDTA）、卤化氢等溶剂进行提取。
2、提取液稀释
将蛋白质样品提取液进行稀释，然后加入助剂，其助剂有：
0.2mol/L NaOH、半胱氨酸、磷酸钠以及咪唑等，以上助剂可溶解蛋白质结构，以保证准确的测定。
3、样品定量
将提取液分析仪中的样品放入詹氏定氮比色皿中，根据样品的特性和要求，制备足量的样品，一般比色皿的最大容量为2ml，样品的实际容量可以根据测定的蛋白质浓度来确定，容量一般为0.5ml-1ml。
4、添加试剂
在詹氏定氮比色皿中添加酸定碳测定试剂，一般使用20ml的酸定碳试剂，其中包含有HCl、MgS04、KCl等成分，将样品搅拌均匀，然后放置室温适当位置，使其反应均匀完成。
5、放入分析仪
在分析仪中，将搅拌好的詹氏定氮比色皿放入分析仪中，并根据
设备的说明书正确设置，然后经过校准测量的手段，进行蛋白质浓度的测定。
6、数据分析
最后，将测量得到的数据分析，对蛋白质浓度的测定结果进行分析，判断样品的实际浓度，以得出准确的测定结果。
总之，凯氏定氮法测定蛋白质是一种快速、准确可靠的方法，但在进行测定时，应充分考虑所使用试剂的性质、操作过程等，以保证测定结果的准确性。
此外，在进行测定时，应将样品放在室温环境下，以保证反应的迅速完成，同时，还可以根据需要，定期进行校准，以得出有效的测定结果。
凯氏定氮法测定蛋白质含量公式
凯氏定氮法测定蛋白质含量公式凯氏定氮法的测定原理是将样品中的蛋白质进行消解，使其中的氮元素转化为氨气，并通过蒸发和漏斗等装置将产生的氨气收集起来。
然后通过酸碱滴定的方法，测定收集到的氨气中的氮含量。
最终根据氮元素与蛋白质的质量比例关系，计算出样品中蛋白质的含量。
1.准备样品：将待测样品按照要求进行制备和处理，通常需要将样品打碎并且充分混合均匀。
2.消解样品：将样品中的蛋白质进行完全消解，一般使用硫酸和过氧化钾的混合液进行消解。
消解过程中需要控制温度和时间，以确保样品中的蛋白质能够完全转化为氨气。
3.收集氨气：消解完成后，将产生的氨气通过蒸发和漏斗等装置进行收集。
蒸发装置通过热水浴等方式将溶液中的水蒸发掉，使得氨气能够更容易收集。
收集装置通过使用酸碱指示剂对氨气进行滴定，在氨气出现的过程中颜色发生变化，从而判断样品中的氮含量。
4.酸碱滴定：使用酸碱指示剂对收集到的氨气进行滴定。
首先需要将氨气溶解在含有酸碱指示剂的溶液中，然后通过滴定的方式，逐渐加入含有酸或碱的溶液，直到颜色发生变化。
从溶液中滴下的酸碱溶液的体积可以表示样品中氮的含量。
根据凯氏定氮法的测定原理和操作步骤，可以得到凯氏定氮法测定蛋白质含量的计算公式：蛋白质含量（%）=（每毫升加入的酸碱滴定液（mL）-空白试验的酸碱滴定液（mL））*N*14.007/样品质量（g）其中，N为酸碱滴定液的标准浓度，单位为mol/L；14.007为氮元素的摩尔质量，单位为g/mol。
需要注意的是，在进行凯氏定氮法测定蛋白质含量时，除了样品中的蛋白质外，还可能会存在其他含氮化合物，如核酸、氨基酸等。
因此，需要根据实际情况进行相关修正，以准确测定样品中的蛋白质含量。
总结起来，凯氏定氮法是一种常用的测定蛋白质含量的方法，通过将样品中的蛋白质进行消解、氨气收集和酸碱滴定的步骤，可以计算出样品中蛋白质的含量。
在具体操作过程中，需要严格控制实验条件，并根据实际情况对测定结果进行修正，以确保结果的准确性。
凯氏定氮法测定面粉中的粗蛋白质含量
凯氏定氮法测定面粉中的粗蛋白质含量实验凯氏定氮法测定面粉中的粗蛋白质含量一、实验目的与要求：1.掌控微量凯氏法测定蛋白质总氮量的原理及操作方式技术。
2.掌握凯氏定氮法的样品消化、蒸馏、吸收及滴定等基本操作技能与含氮量的计算。
二、实验原理样品与浓硫酸和催化剂一同冷却消化，并使蛋白质水解，其中c、h构成co2、h2o逸出，而样品中的有机氮转变为氨与硫酸融合成硫酸铵回到酸液中。
然后将消化液碱化，酿造，并使氨游离，用水蒸气滤出，用硼酸稀释。
稀释氨后的硼酸再以标准盐酸溶液电解所分解成的硼酸铵，根据标准盐酸溶液消耗量可以排序出来总氮量，再换算为粗蛋白含量。
2nh2-(ch2)2-cooh+13h2so4=(nh4)2so4+6co2↑+12so2↑+16h2o(nh4)2so4+2naoh=2nh3↑+na2so4+2h2o2 nh3+4h3bo3=(nh4)2b4o7+5h2o(nh4)2b4o7+2hcl+5h2o=2nh4cl+4h3bo3三、样品：面粉四、仪器与试剂仪器：凯氏烧瓶、微量凯氏定氮装置、微量滴定管、加热套1000w试剂：所有试剂均用不含氮的蒸馏水配制。
1.消化试剂：浓h2so4硫酸铜(液态)硫酸钾(液态)2.2%硼酸(h3bo3)溶液:10g硼酸（化学纯）溶解于500m1热水中，摇匀备用。
二组配500ml3.40%naoh溶液4.0.0100mol/l盐酸标准溶液5.混合指示剂:临用时，把溶解于95％乙醇的0.l％溴甲酚绿溶液10毫升和溶于95％乙醇的0.l％甲基红溶液2毫升混合而成(比例5：1)．(公用)五、测定方法1、样品消化：1精确称取面粉1.0~1.2g左右于定量滤纸上，纸盒不好，插进潮湿的定氮烧瓶中（勿附着在瓶壁上），重新加入0.5gcuso4、6gk2so4及25ml浓硫酸，提数粒玻璃珠，轻轻容器后，用电炉以小火冷却，等待泡沫暂停产生后，加强火力，至液体变小蓝绿色透明化后，再继续冷却微沸30分钟。
简述凯氏定氮法测定蛋白质的步骤
简述凯氏定氮法测定蛋白质的步骤
凯氏定氮法(Kjeldahl法)指的是用硫酸和氨水解液在催化剂的作用下将原料中蛋白质氮转化为氨，并把氨催化时形成的氢气反应吸收后，再以酸-碱滴定法滴定
氨气含量，从而计算出蛋白质氮含量，这种方法就是凯氏定氮法测定蛋白质的步骤。
凯氏定氮法测定蛋白质的步骤如下：
一、样品制备：将取得的样品(乳品、肉品或是其他类型的食物)分割、切碎成
相对细小的粉末，并确保碎片充足或浸入，然后将样品制成稀疏的悬浮液。
二、催化：将处理后的悬浮液放入定氮瓶中，使用有机催化剂，如甲酸钠、钠
邻苯二甲酸、钠邻苯三甲酸等，催化后的悬浮液中的蛋白质被氧化，形成氨气和水溶性的有机化合物。
三、氨气吸收：将催化后的悬浮液加入硫酸，使悬浮液放入高温循环气流，温
度由110℃升高至200℃，然后将催化后的悬浮液中的氨气吸收到硫酸中，使样品
中的氨气进入硫酸中，形成硫酸氨溶液。
四、滴定：将硫酸氨溶液滴定，可以使用酸性和碱性滴定，将硫酸氨溶液与
0.1mol/L的NaOH或HCl滴定，当滴定结束时，酸性滴定液变蓝色，而碱性滴定液
变红色，可以通过比较颜色的深度计算出氨气的浓度
五、计算：根据计量表可以计算出每升催化液中氨气含量，从而得出样品中蛋
白质的氮量。
总之，凯氏定氮法能够有效地测定蛋白质的氮量，是国际上最为普遍使用的蛋
白质分析方法。
岁的定氮法的步骤一般都是相同的，但是根据具体实验的不同，可能会有部分小的差别，而且我们在催化剂的选择上也需要多加慎重、针对性的考虑，以达到理想的测试效果。
凯氏定氮法检测奶粉中蛋白质质量控制及注意事项
凯氏定氮法检测奶粉中蛋白质质量控制及注意事项凯氏定氮法是一种常用的检测蛋白质含量的方法，特别适用于奶制品中蛋白质的测定。
该方法基于样品中蛋白质含氮量的测定，以计算出样品中蛋白质含量。
下面给出具体操作方法及注意事项。
1. 基本操作方法（1）样品制备将适量的奶粉称量置于干燥试管中，加入适量的去离子水，并摇均。
样品质量应在1-5g之间，加水量约为5-10mL之间。
（2）加入试剂利用滴定管，将凯氏试剂（含铜硫酸和氢氧化钠）滴入样品中，直至完全反应。
反应时需要注意有无泡沫出现。
（3）消除泡沫试管加热，中小火持续沸腾2-5分钟。
在加热过程中，需轻轻振摇试管，以消除产生的泡沫。
（4）冷却制成的样品置于水浴中冷却或自然冷却至室温。
（5）去离子水洗涤取适量去离子水入试管，加热振摇，将试管内残留的试剂冲洗出来。
重复冲洗3次，排除影响测量的干扰物。
2. 注意事项（1）试管中需加入足够的试样。
过少的试样会影响测量结果，产生误差。
（2）准确计算样品的质量。
质量不足时，需添加适量的水，过多则会影响检测结果。
（3）做定量加药时，精准操作。
加压过猛会产生大量泡沫，造成污染，影响测定结果。
（4）在加热过程中，需用玻璃棒轻轻振摇试管，以消除产生的泡沫。
否则泡沫会影响样品的都组成分析。
（5）冷却试管时，避免试管与水浴接触。
否则会导致不同温度部分的不同反应时间，进而影响测量数据的准确性。
（6）在洗涤过程中，去离子水务必多次换水。
残留的试剂会影响下一次的测量。
3. 结论通过凯氏定氮法测定样品中的蛋白质含量，能够判断奶粉的质量。
此方法灵敏、准确，可进行批次对比，规范生产过程，确保产品质量。
在实验操作过程中，需注意以上注意事项，以确保数据准确。
蛋白质含量测定(凯氏定氮法)
食物中蛋白质含量测定（凯氏定氮法）一.目标与请求1.进修凯氏定氮法测定蛋白质的道理.2.控制凯氏定氮法的操纵技巧,包含样品的消化处理.蒸馏.滴定及蛋白质含量盘算等.二.试验道理蛋白质是含氮的化合物.食物与浓硫酸和催化剂配合加热消化,使蛋白质分化,产生的氨与硫酸联合生成硫酸铵,留在消化液中,然后加碱蒸馏使氨游离,用硼酸接收后,再用盐酸尺度溶液滴定,依据酸的消费量来乘以蛋白质换算系数,即得蛋白质含量.因为食物中除蛋白质外,还含有其它含氮物资,所以此蛋白质称为粗蛋白.三.仪器与试剂硫酸铜（CuSO4·5H20）硫酸钾硫酸（密度为 1.8419g/L）硼酸溶液（20g/L）氢氧化钠溶液（400g/L） 0.01mol/L盐酸尺度滴定溶液.混杂指导试剂：0.1%甲基红乙溶液液1份,与0.1%溴甲酚绿乙醇溶液5份临用时混杂.微量定氮蒸馏装配：如图3- 所示.图3- 微量凯氏定氮装配1.电炉;2.水蒸气产生器（2L平底烧瓶）;3.螺旋夹a;4.小漏斗及棒状玻璃塞（样品进口处）;5.反响室;6.反响室外层;7.橡皮管及螺旋夹b;8.冷凝管;9.蒸馏液接收瓶.四.试验步调1.样品消化称取样品约2.00g（±0.001g）,移入湿润的100mL凯氏烧瓶中,参加0.2g硫酸铜和6g硫酸钾,稍摇匀后瓶口放一小漏斗,参加20mL浓硫酸,将瓶以450角斜支于有小孔的石棉网上,应用万用电炉,在通风橱中加热消化,开端时用低温加热,待内容物全体炭化,泡沫停滞后,再升高温度保持微沸,消化至液体呈蓝绿色澄清透明后,持续加热0.5h,取下放冷,当心加20mL水,放冷后,无损地转移到100mL容量瓶中,加水定容至刻度,混匀备用,即为消化液.试剂空白试验：取与样品消化雷同的硫酸铜.硫酸钾.浓硫酸,按以上同样办法进行消化,冷却,加水定容至100mL,得试剂空白消化液.2.定氮装配的检讨与洗涤检讨微量定氮装配是否装好.在蒸气产生瓶内装水约三分之二,加甲基红指导剂数滴及数毫升硫酸,以保持水呈酸性,参加数粒玻璃珠（或沸石）以防止暴沸.测定前定氮装配如下法洗涤2~3次：从样品进口入加水适量（约占反响管三分之一体积）通入蒸汽煮沸,产生的蒸汽冲洗冷凝管,数分钟后封闭夹子a,使反响管中的废液倒吸流到反响室外层,打开夹子b由橡皮管排出,如斯数次,即可应用.3.碱化蒸馏量取硼酸试剂20mL于三角瓶中,参加混杂指导剂2~3滴,并使冷凝管的下端拔出硼酸液面下,在螺旋夹a封闭,螺旋夹b开启的状况下,精确汲取10.0mL样品消化液,由小漏斗流入反响室,并以10mL蒸馏水洗涤进样口流入反响室,棒状玻塞塞紧.使10mL氢氧化钠溶液倒入小玻杯,提起玻塞使其徐徐流入反响室,用少量水冲洗立刻将玻塞盖坚,并加水于小玻杯以防漏气,开启螺旋夹a,封闭螺旋夹b,开端蒸馏.通入蒸汽蒸腾10min后,移动接收瓶,液面分开凝管下端,再蒸馏2min.然后用少量水冲洗冷凝管下端外部,取下三角瓶,预备滴定.同时汲取10.0mL试剂空白消化液按上法蒸馏操纵.4.样品滴定以0.01mol/L盐酸尺度溶液滴定至灰色为终点.5.数据记载五.成果盘算式中 X——样品蛋白质含量（g/100g）;V1——样品滴定消费盐酸尺度溶液体积（mL）;V2——空白滴定消费盐酸尺度溶液体积（mL）;c——盐酸尺度滴定溶液浓度（mol/L）;0.0140 ——][Lmolc 尺度滴定溶液相当的氮的质HCl()000/.1量（g）;m——样品的质量（g）;F——氮换算为蛋白质的系数,一般食物为 6.25;乳成品为6.38;面粉为5.70;高梁为 6.24;花生为 5.46;米为5.95;大豆及其成品为5.71;肉与肉成品为6.25;大麦.小米.燕麦.裸麦为 5.83;芝麻.向日葵5.30.盘算成果保存三位有用数字.六.留意事项及解释1.本法也实用于半固体试样以及液体样品检测.半固体试样一般取样规模为2.00g~5.00g;液体样品取样10.0mL~25.0mL（约相当氮30mg~40mg）.若检测液体样品,成果以g/100mL暗示.2.消化时,若样品含糖高或含脂及较多时,留意控制加热温度,以免大量泡沫喷出凯氏烧瓶,造成样品损掉.可参加少量辛醇或液体白腊,或硅消泡剂削减泡沫产生.3.消化时应留意扭转凯氏烧瓶,将附在瓶壁上的碳粒冲下,对样品完整消化.若样品不轻易消化至澄清透明,可将凯氏烧瓶中溶液冷却,参加数滴过氧化氢后,再持续加热消化至完整.4.硼酸接收液的温度不该超出40℃,不然氨接收削弱,造成检测成果偏低.可把接收瓶置于冷水浴中.5.在反复性前提下获得两次自力测定成果的绝对差值不得超出算术平均值的10%。
凯氏定氮法测定蛋白质含量
凯氏定氮法测定蛋白质含量简介凯氏定氮法（Kjeldahl method）是一种常用的测定蛋白质含量的方法，它通过将样品中的有机氮转化为氨，然后将氨转化为氨基氮，再由氨基氮计算得出蛋白质的含量。
这个方法的优点是稳定可靠，适用于各种类型的样品。
实验原理凯氏定氮法的实验原理如下：1.样品预处理：将待测样品进行预处理，去除样品中的非氮有机物。
这样可以确保凯氏定氮方法只测定到蛋白质中的氮。
2.消化反应：将预处理后的样品与硫酸相结合，加热至沸腾。
在这个过程中，有机氮将被转化为氨。
3.碱化反应：将消化后的样品中的硫酸中和，加入过量的氢氧化钠溶液，使样品呈碱性。
4.蒸馏捕收：将碱化后的样品进行蒸馏，捕集捕集样品中的氨。
5.滴定：将捕集到的氨溶液与酸反应，使用盐酸或硫酸等强酸进行滴定，直至中和反应结束，测定出反应过程中消耗的酸的体积。
6.计算：根据滴定所消耗的酸的体积，计算出样品中的氨的量，再根据氨和蛋白质含氮的摩尔比例，计算出样品中蛋白质的含量。
实验步骤以下是凯氏定氮法测定蛋白质含量的实验步骤：1.准备样品：根据实验需要，准备待测样品。
样品的选择应根据实验目的和样品的特性进行。
2.样品预处理：将样品经过细碎、研磨等处理，去除样品中的非氮有机物。
3.消化反应：将预处理后的样品与浓硫酸相结合，加热至沸腾。
消化时间一般为2小时。
4.碱化反应：将消化后的样品中的硫酸中和，加入过量的氢氧化钠溶液，使样品呈碱性。
5.蒸馏捕收：将碱化后的样品进行蒸馏，捕集捕集样品中的氨。
6.滴定：将捕集到的氨溶液与酸反应，使用盐酸或硫酸等强酸进行滴定，直至中和反应结束。
7.计算：根据滴定所消耗的酸的体积，计算出样品中的氨的量，再根据氨和蛋白质含氮的摩尔比例，计算出样品中蛋白质的含量。
实验注意事项1.在进行样品消化时，必须控制好加热温度，避免样品的溢出和烧焦。
2.在进行滴定时，应注意控制滴液的速度，避免过量的酸滴入。
3.实验过程中需注意个人安全，避免触及强酸和强碱。
蛋白质测定-凯氏定氮法
反应室中溶液的颜色
硼酸吸收液的颜色
[注意] ①加NaOH一定要过量，此时溶液生成深蓝色或黑色沉淀
②为防止样液中氨气逸出。一是要水封，二要夹紧废液蝴蝶
夹后再通蒸汽，三要注意接头处有无松漏现象
③ 冷凝管下端先插入硼酸吸收液液面以下才能蒸馏。 吸收液温度不应超过40℃，避免氨气逸出，若超过时 可置于冷水浴中使用。
提高溶液沸点，从而加快有机物分解
浓硫酸 氧化作用：有机物质氧化分解为H2O和CO2
样品预处理
样品充分混匀
固体试样 0.2~2g 半固体试样 2~5g 液体试样 10~25g
直接消化
样品称量、消化
1.000g奶粉 0.2g硫酸铜 6g硫酸钾 20mL浓硫酸 玻璃珠
轻摇
小火加热炭化 至泡沫完全停止
大火加热 保持瓶中液体微沸
若要测定样品的蛋白氮,则需要向样品中加入三氯乙酸溶 液,使其最终浓度为5%,然后测定未加入三氯乙酸的样品
及加入三氯乙酸溶液后样品中的含氮量,进一步计算出蛋 白质含量:
蛋白氮=总氮-非蛋白氮
准确称取某乳粉样品0.800克，经凯氏法消化定容至100ml， 移 取 5ml 消 化 液 进 行 蒸 馏 ， 用 20ml 硼 酸 吸 收 ， 再 用 0.05000mol/lHCl滴定，结果消耗5.00ml，试计算该乳粉的 蛋白质含量？
实验
奶粉中蛋白质的测定 ——凯氏定氮法
【基础知识】
蛋白质概述
蛋白质是食品营养价值的重要指标，含N是蛋白质区 别其他有机化合物的主要标志。大多数蛋白质含氮量
接近，一般来说，pro的平均含氮量为16%，即一份 氮相当于6.25份蛋白质，此数值称为蛋白质系数。
注意：
不同种类食品的蛋白质系数有所不同，如玉米、荞麦、 青豆、鸡蛋等为6.25，花生为5.46，大米为5.95，大 豆及其制品为5.71，小麦粉为5.70、全小麦、大麦、 燕麦、裸麦和小米是5.83；硬果类为5.30；牛乳及其 制品为6.38。
蛋白质制备及含量测定(凯氏定氮法)
实验六蛋白质制备及含量测定—微量凯氏（Mirco-Kjeldahl ）定氮法一、实验目的要求1、了解蛋白质提取的一般方法和原理2、了解蛋白质含量测定的常用方法3、学习微量凯氏定氮法的原理4、掌握微量凯氏定氮法的操作技术，包括样品的消化、蒸馏、滴定、含氮量的计算及蛋白质含量的换算等。
二、实验原理1、蛋白质的提取与制备蛋白质的提取与制备方法与生物材料的类型及蛋白质的存在部位有关。
如果是胞内蛋白，首先必须要进行细胞破碎。
细胞破碎的方法与细胞的类型有关，包括物理破碎（研磨、超声波等）、化学破碎（化学溶剂处理）、酶法破碎等。
如果是胞外蛋白，可以根据相应蛋白质的性质进行提取分离纯化。
如果待提取的蛋白质是具有生物活性的蛋白质如酶，则在样品处理、提取及分离纯化过程中需注意防止蛋白质的变形失活，如在低温下操作、选择适当的缓冲体系等。
2、蛋白质含量测定蛋白质含量测定的方法很多，如：紫外吸收法、双缩脲法、考马斯亮蓝染色法（Bradford法）、Folin酚法、微量凯氏定氮法等。
3、凯氏定氮生物材料的含氮量测定在生物化学研究中具有一定的意义，如蛋白质的含氮量约为16％，测出含氮量则可推知蛋白含量。
生物材料总氮量的测定，通常采用微量凯氏定氮法。
凯氏定氮法由于具有测定准确度高，可测定各种不同形态样品等两大优点，因而被公认为是测定食品、饲料、种子、生物制品、药品中蛋白质含量的标准分析方法。
其原理如下：（1）消化：有机物与浓硫酸共热，使有机氮全部转化为无机氮——硫酸铵。
为加快反应，添加硫酸铜和硫酸钾的混合物；前者为催化剂，后者可提高硫酸沸点。
这一步约需2〜3h,视样品的性质而定。
天然的含氮有机物（如蛋白质，核酸及氨基酸等）与浓硫酸共热时，其中的碳、氢二元素被氧化成二氧化碳和水；蛋白质分解,而有机氮则变成氨（无机氮）, 并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。
此时程称之为“ 消化”。
但是,这个反应进行得比较缓慢,通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高反应的沸点, 并加入硫酸铜作为催化剂, 以促进反应的进行。
凯氏定氮法测定蛋白质原理及操作
一、概述蛋白质是生命活动中不可或缺的重要物质，其含量的测定在生物化学研究和食品加工领域具有重要意义。
针对蛋白质含量的测定方法有许多种，其中凯氏定氮法是一种经典且常用的测定方法，本文将就凯氏定氮法测定蛋白质的原理及操作进行详细介绍。
二、凯氏定氮法原理1. 基本原理凯氏定氮法是通过测定样品中氨基氮的含量来间接测定蛋白质含量的方法。
蛋白质是由氨基酸构成的，而氨基酸中含有氮元素，故可以通过测定样品中氮元素的含量来推算出样品中蛋白质的含量。
2. 操作步骤（1）样品的预处理：将待测样品进行适当的预处理，通常是将样品中的有机物燃烧成气体，从而将其中的氮元素转化为氮气。
（2）氮气的收集：收集样品燃烧产生的氮气，通常是通过化学吸收剂的吸收来将氮气纯化。
（3）氮气的测定：将纯化后的氮气进行定量测定，得出氮气的含量。
（4）蛋白质含量的计算：根据氮气的含量，通过一定的计算公式来推算出样品中蛋白质的含量。
三、凯氏定氮法操作注意事项1. 样品的选择选择代表性好的样品进行测定，避免样品中含有其他干扰物质，影响测定结果的准确性。
2. 仪器的使用严格按照仪器的操作说明进行操作，保证测定过程的准确性和精确度。
3. 数据的处理对测定得到的数据进行严格的处理，计算过程中不应出现错误，以确保蛋白质含量的测定结果准确可靠。
四、凯氏定氮法测定蛋白质的优缺点1. 优点（1）测定范围广：凯氏定氮法可以适用于各种类型的样品，包括食品、饲料、生物组织等。
（2）测定结果可靠：经过严格的样品预处理和操作步骤，测定结果具有较高的准确性和精确度。
2. 缺点（1）操作繁琐：凯氏定氮法的操作步骤相对繁琐，需要较长的操作时间。
（2）不适用于含氮杂质的样品：如果样品中含有其他氮元素化合物的干扰物质，则可能影响凯氏定氮法的测定结果。
五、结语凯氏定氮法作为一种经典且常用的蛋白质测定方法，其原理和操作步骤相对简单明了，但需要严格遵守操作规范，以确保测定结果的准确性和可靠性。
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实验六蛋白质制备及含量测定——微量凯氏（Mirco-Kjeldahl）定氮法一、实验目的要求1、了解蛋白质提取的一般方法和原理2、了解蛋白质含量测定的常用方法3、学习微量凯氏定氮法的原理4、掌握微量凯氏定氮法的操作技术，包括样品的消化、蒸馏、滴定、含氮量的计算及蛋白质含量的换算等。
二、实验原理1、蛋白质的提取与制备蛋白质的提取与制备方法与生物材料的类型及蛋白质的存在部位有关。
如果是胞内蛋白，首先必须要进行细胞破碎。
细胞破碎的方法与细胞的类型有关，包括物理破碎（研磨、超声波等）、化学破碎（化学溶剂处理）、酶法破碎等。
如果是胞外蛋白，可以根据相应蛋白质的性质进行提取分离纯化。
如果待提取的蛋白质是具有生物活性的蛋白质如酶，则在样品处理、提取及分离纯化过程中需注意防止蛋白质的变形失活，如在低温下操作、选择适当的缓冲体系等。
2、蛋白质含量测定蛋白质含量测定的方法很多，如：紫外吸收法、双缩脲法、考马斯亮蓝染色法（Bradford法）、Folin酚法、微量凯氏定氮法等。
3、凯氏定氮生物材料的含氮量测定在生物化学研究中具有一定的意义，如蛋白质的含氮量约为16％，测出含氮量则可推知蛋白含量。
生物材料总氮量的测定，通常采用微量凯氏定氮法。
凯氏定氮法由于具有测定准确度高，可测定各种不同形态样品等两大优点，因而被公认为是测定食品、饲料、种子、生物制品、药品中蛋白质含量的标准分析方法。
其原理如下：（1）消化：有机物与浓硫酸共热，使有机氮全部转化为无机氮——硫酸铵。
为加快反应，添加硫酸铜和硫酸钾的混合物；前者为催化剂，后者可提高硫酸沸点。
这一步约需2～3h，视样品的性质而定。
天然的含氮有机物（如蛋白质，核酸及氨基酸等）与浓硫酸共热时，其中的碳、氢二元素被氧化成二氧化碳和水；蛋白质分解，而有机氮则变成氨（无机氮），并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。
此时程称之为“消化”。
但是，这个反应进行得比较缓慢，通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高反应的沸点，并加入硫酸铜作为催化剂，以促进反应的进行。
甘氨酸的消化过程可表示如下：NH2-CH2 -COOH + 3H2SO4→NH3 + 2CO2↑+ 3SO2↑+ 4H2O2 NH3 + H2SO4→(NH4)2 SO4或2 NH2-CH2 -COOH + 7H2SO4→(NH4)2 SO4 + 4CO2↑+ 6 SO2↑+ 8H2O （2）加碱蒸馏：浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，借水蒸汽将产生的氨蒸馏到一定量、一定浓度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后，氨与溶液中的氢离子结合，生成铵根离子。
(NH4)2 SO4 + 2NaOH →Na2SO4 + 2NH3 +2H2ONH3 + H3BO3→NH4H2BO3或2NH3 + 4H3BO3→(NH4)2 B4O7 + 5H2O（3）滴定：硼酸吸收氨后，氨与溶液中的氢离子结合，生成铵离子，使溶液中氢离子浓度降低。
然后用标准无机酸滴定，直至恢复溶液中原来氢离子浓度为止，最后根据所用标准酸的当量数物质的量（相当于待测物中氨的物质的量）计算出待测物中的含氮量，再折算为粗蛋白含量。
NH4H2BO3 + HCl →NH4Cl + H3BO3或(NH4)2 B4O7 + 2HCl + 5H2O →2NH4Cl + 4H3BO3滴定时用甲烯蓝和甲基红混合指示剂，其指示范围为pH5.2~5.6，将NH4H2BO3的绿色滴至原来H3BO3的紫色即为终点。
本法适用于0.2~1.0mg（2.0 mg）氮量测定。
相对误差应小于2%。
图3－1 微量凯氏蒸馏装置示意图1.热源2. 烧瓶3. 玻璃管4. 橡皮管5．玻璃杯6. 棒状玻塞7. 反应室8. 反应室外壳9. 夹子10. 反应室中插管11. 冷凝管12. 锥形瓶13. 石棉网图3－2 改进型微量凯氏定氮蒸馏装置1.水蒸气发生器2. 反应室3. 水蒸气排气孔4. 排水排气孔5．外源水入口6. 进样口7. 加样漏斗8. 冷凝器9. 冷凝器出口10. 自来水入口11. 通气室12. 通气室出口13. 通气室出口14. 排水柱15. 排水柱入口16. 排水柱入口17. 冷凝水和废水出口三、主要实验试剂和器材1、试剂（1）消化液（过氧化氢∶浓硫酸∶水＝3∶2∶1）（2）硫酸钾—硫酸铜混合物：硫酸钾与硫酸铜（CuSO4·5H2O）以3：1（W/W）的配比混合研磨成粉末。
（3）30%氢氧化钠溶液（4）2%硼酸（5）混合指示剂（田氏指示剂）的配制：方法一：取50mL0.1%甲烯蓝无水醇溶液与200mL0.1%甲基红无水乙醇溶液混合配成，贮于棕色瓶备用，这种指示剂酸性时为紫色，碱性时为绿色，变色范围窄且灵敏。
或方法二：0.1%溴甲酚绿乙醇溶液10mL与0.1%甲基红乙醇溶液2mL混和即成。
本指示剂的变色范围为pH 5.2 → 5.4 → 5.6紫红色灰色绿色（6）0.0100 mol·L-1HCl[（7）硼酸－指示剂混合液：取100mL2%硼酸溶液，滴加混合指示剂贮备液，摇匀后溶液呈现紫红色即可。
（约加1mL左右混合指示剂）]2、待测样品市售面粉3、主要器材（1）分析天平（2）凯氏烧瓶100mL（×2）（3）容量瓶（50mL）（4）刻度吸管（1mL、2mL）（5）凯氏定氮蒸馏装置（6）微量滴定管（3mL、5mL，可读至0.02mL）（7）锥形瓶（50~100mL）四、操作方法1、样品处理液体样品（如血清）可以直接消化，而固体样品中的含氮量是100克该物质（干重中所含氮的克数）来表示（%）。
因此在定氮前，应将固体样品中的水份除掉。
一般样品干燥的温度都采用105℃，因为非游离的水都不能在100℃以下烘干。
在称量瓶中称入一定量的面粉样品，然后置105℃的烘箱内干燥4小时。
用坩埚将称量瓶放入干燥器内，待降至室温后称重，按上述操作继续烘干样品。
每干燥1小时后，称量一次，直到两次称量的数量不变，即达恒重（±0.0002g）。
精确称取0.1g左右的干燥面粉作为本次实验的样品。
2、消化取2个100毫升的凯氏烧瓶，向第一号烧瓶内加0.1g面粉样品。
注意，加样品时应直接送至烧瓶底部，切勿沾于瓶口或瓶颈上，向2号烧瓶加入0.1毫升蒸馏水作空白对照。
在每个烧瓶内加入硫酸钾—硫酸铜混合物约0.2g，消化液（浓硫酸）5mL，玻璃珠1粒，摇匀。
将烧瓶约60度角固定在铁架上，每个瓶口放一小漏斗，在通风厨内的电炉上消化。
在消化开始时，应控制火力，不要使液体冲到瓶颈。
待瓶内水汽蒸完，硫酸开始分解并放出SO2白烟后，适当加强火力，使瓶内液体微微沸腾，大约维持2 ~ 3h继续消化（待消化液变成褐色后，为了加速完成消化，可将烧瓶取下，稍冷，将30％过氧化氢溶液1 ~ 2滴加到烧瓶底部消化液中，再继续消化，直到消化液由淡黄色变成透明淡蓝绿色，消化即告完成）。
直至消化液呈透明绿色为止。
消化完毕，待烧瓶内容物冷却后，加蒸馏水10毫升（注意慢加，边加边摇）。
冷却后将瓶内容物转入50毫升的容量瓶中，并用蒸馏水洗烧瓶数次，溶液一并倒入容量瓶，最后定容至刻度摇匀，做上记号备用。
注意事项（1）小心加样，切勿使样品沾污凯氏烧瓶口部、颈部。
（2）消化时，须斜放凯氏烧瓶（45°左右）。
火力先小后大，避免黑色消化物溅到瓶口、瓶颈壁上。
本次实验消化液已经制备好，备用。
从蒸馏开始做。
3、蒸馏（1）凯氏定氮装置的安装：首先固定主体（蒸汽发生器和反应室），高度适合于热源加热；然后用橡皮管将各相应部位连接，放上自由夹；最后长橡皮管连接自来水和出水口。
（2）蒸馏器的洗涤：仪器应先经一般洗涤，再经水蒸气洗涤。
洗涤方法：蒸气发生器中加入一定量水（以排水高度为宜）加热烧开（注意：热源切勿靠近橡皮管，防止将橡皮管烧化）。
向反应室中加入蒸馏水，水即自动吸出（虹吸）；或移开蒸汽发生器的热源片刻；或打开自由夹②，使得冷水进入蒸汽发生器，都可使反应室中的水自动吸出（如果几种措施都无效，检查装置本身是否有问题如存在裂痕等）。
反复清洗3～5次。
检验是否洗涤干净：将一只盛有5mL 2％硼酸液和1 ~ 2滴指示剂的锥形瓶置于冷凝管下端，使冷凝管管口插入液体中，蒸馏数分钟，如硼酸液颜色不变，表明仪器已洗净。
否则继续洗涤直至洗净为止。
[（3）滴定标准样品：标准硫酸铵溶液先用标准硫酸铵溶液（0.3毫克氮/毫升）试验2~3次。
蒸馏器洗净后，开放水龙头，使水进入蒸汽发生器，水放至球部即可。
取3个50毫升的锥形瓶，各准确加入10毫升硼酸（内加有混合指示剂）。
用表面皿复盖备用。
加样：用吸量管吸取1mL标准硫酸铵溶液，细心地由加样漏斗倾入反应室，再用蒸馏水1毫升清洗漏斗。
取一个盛有硼酸—混合指示剂的锥形瓶，置于冷凝管下端，使冷凝器管口下端浸没在硼酸溶液液面下，用量筒从漏斗加入30%氢氧化钠8mL，随即将自由夹夹紧，并往漏斗加入少量蒸馏水封闭。
蒸馏：用酒精灯加热（应用挡风板将灯围拢，维持火力恒定），沸腾不可高于虹吸管口以免整齐发生器溶液从虹吸管倒吸，待第一滴蒸馏液从冷凝柱下端滴下时起，继续蒸馏5分钟，然后将锥形瓶放低，使导管离开液面再蒸2分钟，并用少量蒸馏水冷凝管口外壁，蒸馏完毕，取下锥形瓶，随即将蒸馏器洗净。
]（3）样品消化液及空白的蒸馏取50mL 锥形瓶数个，各加5mL 2％硼酸溶液和1 ~ 2滴指示剂，用表面皿覆盖备用。
用吸量管分别吸取5mL/10mL样品消化液按上述操作步骤进行蒸馏。
a.首先关闭冷凝水，打开自由夹2，使蒸汽发生器与大气相通。
将锥形瓶放在冷凝器下端，浸没于液面下。
b.移取5mL/10mL样品消化液小心加入反应室。
将准备好的30%氢氧化钠8mL加入，关闭自由夹1，加水封。
c.关闭自由夹2，打开冷凝水（不要过猛）d.加热蒸汽发生器，开始蒸馏。
当观察到锥形瓶中由紫色→绿色（2～3min），蒸馏3min。
放低锥形瓶，继续蒸馏1min，用少量蒸馏水洗涤冷凝管下端外侧。
取下锥形瓶，以表面皿覆盖。
以备滴定。
蒸馏完毕，应立即洗涤反应室，方法同前，清洗3～5次。
继续进行10mL 空白消化液蒸馏。
蒸馏全部结束后，将反应室清洗干净，废水排出。
（4）滴定：蒸馏完毕，分别用0.0100mol·L-1标准盐酸溶液滴定样品消化液蒸馏的锥形瓶内溶液和空白消化液蒸馏的锥形瓶内溶液至绿色变为淡紫色，记录所用盐酸的量，分别为V1和V2。
注意事项（1）必须仔细检查凯氏定氮仪的各个连接处，保证不漏气。
（2）凯氏定氮仪必须事先反复清洗，保证洁净。
（3）蒸馏时，小心加入消化液。
加样时最好将火力拧小或撤去或将蒸汽发生器与大气相通，避免加入的消化样液发生倒吸。
蒸馏时，切忌火力不稳，否则也将发生倒吸现象。
（4）蒸馏后应及时清洗定氮仪。
（5）凯氏法的优点是适用范围广，可用于动植物的各种组织，器官及食品等成组复杂样品的测定，只要细心操作都能得到精确的结果。