蛋白质含量测定 凯氏定氮法
实验二_蛋白质含量的测定-凯氏定氮法1
实验二_蛋白质含量的测定-凯氏定氮法1一、实验原理蛋白质是生物体内重要的营养成分，因此测定样品中蛋白质含量是生物学领域中的一项基础性工作。
凯氏定氮法是测定蛋白质含量的一种常用方法。
由于蛋白质中氮元素的含量较高，因此凯氏定氮法以氮元素计算蛋白质含量，具有简便、准确、重现性好等特点，广泛应用于蛋白质含量的测定中。
该法的基本原理是：将待测样品中蛋白质水解后，将产生的氨基酸再通过氧化还原反应以生成气态氨，利用碱性铜离子氧化氨生成蓝色化合物，蓝色化合物的浓度与样品中氮的含量成正比，从而计算出样品中蛋白质的含量。
二、实验仪器和试剂1. 仪器：水浴器、移液器、分析天平。
2. 试剂：包括0.1mol/L NaOH、1% CuSO4、1% KNaC4H4O6、1% Na2SO4、 Na2CO3和测定氯离子的盐酸铵铁Ⅲ溶液等。
三、实验步骤1. 准备样品：首先将待测样品去除水分，将10mg的样品放入烘箱中加热到60℃，持续4h使其干燥。
取出后冷却，称取约10mg-20mg样品，转移到干净、干燥的燃烧器中。
2. 水解：加入3ml的6mol/L HCl，进行加热水解。
将燃烧器放到水浴器中，加入适量的水，然后用酒精灯或燃气灯加热至沸腾。
持续水解1h，注意不要使燃烧器干燥，需要时加入适量的水。
3. 去除氨：过滤水解液，将滤液倒入容量瓶中，并加入足量的NaOH溶液，使pH值达到9-10。
再加入10ml的Na2SO4溶液，混匀。
然后将瓶口拔开，将瓶口放在水浴器中并加入适量的NaOH溶液，使瓶内的氨气完全挥发，待液面稳定后用盖子盖好。
4. 确定还原态铜离子的数量：取一定量的0.1mol/L NaOH溶液，加入CuSO4和KNaC4H4O6，混匀后加入约1g的Na2CO3，加水定容，制成标准CuSO4溶液。
5. 滴定：取出约5ml水解液，放入锥形瓶中加清水至刻度线，加入50μl的盐酸铵铁Ⅲ溶液，混匀。
用标准CuSO4溶液滴定至液体颜色由黄变蓝。
蛋白质制备及含量测定（凯氏定氮法）分析
蛋⽩质制备及含量测定（凯⽒定氮法）分析实验六蛋⽩质制备及含量测定——微量凯⽒（Mirco-Kjeldahl）定氮法⼀、实验⽬的要求1、了解蛋⽩质提取的⼀般⽅法和原理2、了解蛋⽩质含量测定的常⽤⽅法3、学习微量凯⽒定氮法的原理4、掌握微量凯⽒定氮法的操作技术，包括样品的消化、蒸馏、滴定、含氮量的计算及蛋⽩质含量的换算等。
⼆、实验原理1、蛋⽩质的提取与制备蛋⽩质的提取与制备⽅法与⽣物材料的类型及蛋⽩质的存在部位有关。
如果是胞内蛋⽩，⾸先必须要进⾏细胞破碎。
细胞破碎的⽅法与细胞的类型有关，包括物理破碎（研磨、超声波等）、化学破碎（化学溶剂处理）、酶法破碎等。
如果是胞外蛋⽩，可以根据相应蛋⽩质的性质进⾏提取分离纯化。
如果待提取的蛋⽩质是具有⽣物活性的蛋⽩质如酶，则在样品处理、提取及分离纯化过程中需注意防⽌蛋⽩质的变形失活，如在低温下操作、选择适当的缓冲体系等。
2、蛋⽩质含量测定蛋⽩质含量测定的⽅法很多，如：紫外吸收法、双缩脲法、考马斯亮蓝染⾊法（Bradford法）、Folin酚法、微量凯⽒定氮法等。
3、凯⽒定氮⽣物材料的含氮量测定在⽣物化学研究中具有⼀定的意义，如蛋⽩质的含氮量约为16％，测出含氮量则可推知蛋⽩含量。
⽣物材料总氮量的测定，通常采⽤微量凯⽒定氮法。
凯⽒定氮法由于具有测定准确度⾼，可测定各种不同形态样品等两⼤优点，因⽽被公认为是测定⾷品、饲料、种⼦、⽣物制品、药品中蛋⽩质含量的标准分析⽅法。
其原理如下：（1）消化：有机物与浓硫酸共热，使有机氮全部转化为⽆机氮——硫酸铵。
为加快反应，添加硫酸铜和硫酸钾的混合物；前者为催化剂，后者可提⾼硫酸沸点。
这⼀步约需2～3h，视样品的性质⽽定。
天然的含氮有机物（如蛋⽩质，核酸及氨基酸等）与浓硫酸共热时，其中的碳、氢⼆元素被氧化成⼆氧化碳和⽔；蛋⽩质分解，⽽有机氮则变成氨（⽆机氮），并进⼀步与硫酸作⽤⽣成硫酸铵。
此时程称之为“消化”。
但是，这个反应进⾏得⽐较缓慢，通常需要加⼊硫酸钾或硫酸钠以提⾼反应的沸点，并加⼊硫酸铜作为催化剂，以促进反应的进⾏。
蛋白质含量测定微量凯氏(Kjeldahl)定氮法
５ ． 试样准备
５．１ 样液：ｌｇ卵清蛋白溶于９ｍｇ ｍＬ－１的ＮａＣｌ液 并稀释至ｌ００ｍＬ 如有不溶物ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ离心取上清液
备用 ５．２ 硫酸钾 硫酸铜 ３ １ ｗ ｗ 混匀研成粉末 ５．３ ３０ｍｇ ｍＬ－１氢氧化钠溶液 ３ＯｇＮａＯＨ溶于蒸馏水 释至ｌ００ｍＬ ５．４ ２０ｍｇ ｍＬ－１硼酸溶液 ２ｇ硼酸溶于蒸馏水 释至１Ｏ０ｍＬ 混合指示剂 １ｍｇ ｍＬ－１的甲基红酒精溶液和１ｍｇ ｍＬ－１的甲烯蓝酒精溶液按４ ｌ比例 ｖ ｖ 混合 本指示剂在ｐＨ５．２时为紫红色 ｐＨ４．５时为暗蓝 或灰色 色 ｐＨ５．６时为绿色 变色点 ｐＩ为５．４ ５．６ ０．０１ｍｏｌ Ｌ－１标准盐酸溶液：用恒沸盐酸准确稀释
２．２．２ 直接法 用硼酸作为氨的吸收溶液 结果使溶液中［Ｈ ］降低 混合指示剂 ＰＨ４．３ ５． ０ 由黑紫色变为绿色 再用标准酸来滴定 使硼酸恢复到原来的氢离子浓度为止 指示剂 出现淡紫色为终点 此时所耗的盐酸量即为氨的量
ＮＨ２ Ｈ３Ｂ０４ ＮＨ４Ｈ２Ｂ０４ ＮＨ４Ｈ２Ｂ０４ ＨＣｌ ＮＨ４Ｃｌ Ｈ３Ｂ０４
ＮＨ４０Ｈ ＮＨ Ｈ Ｏ
ＮＨ３ ＨＣｌ ＮＨ４Ｃｌ
中和程度用滴定法来判断 分回滴法和直接法两种
２．２．１ 回滴法 用过量的标准酸吸收氨 其剩余的酸可用标准ＮａＯＨ滴定 由盐酸量减去滴定 所耗ＮａＯＨ的量即为被吸收的氨之量 此法采用甲基红作指示剂
ＹＹＳＷＤＢ００９２蛋白质含量测定微量凯氏定氮法
YY-SW-DB-0092
蛋白质 含量测定 微量凯氏（ Ｋ ｊ ｅ ｌ ｄ ａ ｈ ｌ ） 定氮法
１． 范围
本方法采用微量凯氏（Ｋｊｅｌｄａｈｌ）定氮法测定蛋白质的含量 本方法适用于各类蛋白质 测定范围０．２毫克 ２．０毫克的氮
凯氏定氮法测定蛋白质含量
凯氏定氮法测定蛋白质含量简介凯氏定氮法（Kjeldahl method）是一种常用的测定蛋白质含量的方法，它通过将样品中的有机氮转化为氨，然后将氨转化为氨基氮，再由氨基氮计算得出蛋白质的含量。
这个方法的优点是稳定可靠，适用于各种类型的样品。
实验原理凯氏定氮法的实验原理如下：1.样品预处理：将待测样品进行预处理，去除样品中的非氮有机物。
这样可以确保凯氏定氮方法只测定到蛋白质中的氮。
2.消化反应：将预处理后的样品与硫酸相结合，加热至沸腾。
在这个过程中，有机氮将被转化为氨。
3.碱化反应：将消化后的样品中的硫酸中和，加入过量的氢氧化钠溶液，使样品呈碱性。
4.蒸馏捕收：将碱化后的样品进行蒸馏，捕集捕集样品中的氨。
5.滴定：将捕集到的氨溶液与酸反应，使用盐酸或硫酸等强酸进行滴定，直至中和反应结束，测定出反应过程中消耗的酸的体积。
6.计算：根据滴定所消耗的酸的体积，计算出样品中的氨的量，再根据氨和蛋白质含氮的摩尔比例，计算出样品中蛋白质的含量。
实验步骤以下是凯氏定氮法测定蛋白质含量的实验步骤：1.准备样品：根据实验需要，准备待测样品。
样品的选择应根据实验目的和样品的特性进行。
2.样品预处理：将样品经过细碎、研磨等处理，去除样品中的非氮有机物。
3.消化反应：将预处理后的样品与浓硫酸相结合，加热至沸腾。
消化时间一般为2小时。
4.碱化反应：将消化后的样品中的硫酸中和，加入过量的氢氧化钠溶液，使样品呈碱性。
5.蒸馏捕收：将碱化后的样品进行蒸馏，捕集捕集样品中的氨。
6.滴定：将捕集到的氨溶液与酸反应，使用盐酸或硫酸等强酸进行滴定，直至中和反应结束。
7.计算：根据滴定所消耗的酸的体积，计算出样品中的氨的量，再根据氨和蛋白质含氮的摩尔比例，计算出样品中蛋白质的含量。
实验注意事项1.在进行样品消化时，必须控制好加热温度，避免样品的溢出和烧焦。
2.在进行滴定时，应注意控制滴液的速度，避免过量的酸滴入。
3.实验过程中需注意个人安全，避免触及强酸和强碱。
蛋白质含量的测定微量凯氏定氮法
实验准确性保证
1
确保使用的试剂和器具清洁无污染，避免误差。
2
在实验过程中，要严格控制反应温度和时间，确 保反应完全。
3
为保证准确性，建议进行多次重复实验，取平均 值。
实验失败的可能原因及解决方法
原因1
样品消化不完全。解决方法：检查样品是否符合要求，调整消化 条件（如温度、时间、试剂用量等）以确保消化完全。
原因2
蒸馏过程中出现故障。解决方法：检查蒸馏装置是否正常，确保冷 凝水畅通，及时排除故障。
原因3
滴定操作不当。解决方法：加强滴定操作训练，确保操作规范，减 小误差。
06
结论
微量凯氏定氮法的优缺点
优点
微量凯氏定氮法是一种准确、可靠的蛋白质含量测定方法，具有较高的精密度和准确度。该方法操作 简便，试剂用量少，适用于对样品量要求较小的实验。此外，微量凯氏定氮法还可以测定其他氮含量 较高的物质，如氨基酸、肽等。
价值
微量凯氏定氮法的应用价值主要体现在以下几个方面： 首先，在食品工业中，该方法可用于检测食品中蛋白质 的含量，确保产品的质量和安全；其次，在药品行业中 ，微量凯氏定氮法可用于检测药品中蛋白质的含量，保 证药品的质量和有效性；此外，在生物制品领域，该方 法可用于检测蛋白质药物的含量和纯度，为生物制品的 质量控制提供有力支持。因此，微量凯氏定氮法的应用 具有广泛的实际意义和价值。
结果的表示和误差分析
结果表示
测定结果以百分数表示，保留小数点后一位。
误差分析
误差来源可能包括试剂不纯、称样误差、滴定误差等，为减小误差，应选择高纯度试剂，提高称样精度，加强滴 定操作训练。
05
实验注意事项
凯氏定氮法测定蛋白质含量
1、按图装好凯氏定氮装置。向蒸汽发生器中的水中 加数滴甲基红指示剂、几滴H2SO4及数粒沸石
2、移取10.0ml样品消化液，经进样口注入反应室内，用 少量水冲洗进样口，然后加入10ml 50% NaOH溶液于反 应室内，塞好玻璃塞，防止氨的逸出。从开始回流记时， 蒸馏4min，移动冷凝管下口使其离开接收液面。再蒸馏， 用纯水洗冷凝管下口，洗液流入吸收液内。 三、NH3的标定 用0.05mol.L-1HCl标准溶液滴定至暗红色为终点。 四、蛋白质含量的计算 蛋白质（%）=总氮量（%）×6.25
反应式为： H2SO4==SO2+H2O+[O]
R. CH.COOH+[O]==R.CO.COOH+NH3 NH3 R.CO.COOH+[O]==nCO2+mH2O
3 2 4 4 2 ，收集于 4 2.在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出 NH H3BO3 溶液 3 中。
2NH +H SO ==(NH ) SO
2008年当奥运圣火熄灭以后，我国各地的新闻版 面相继都在大篇幅的报道关于“大头娃娃”的新 闻。 根据医院的诊断，这些婴儿所患的都是营养不良 综合征，而扼杀这些幼小生命的“元凶”，正是 蛋白质等营养元素指标严重低于国家标准的劣质 婴儿奶粉。
导致“大头娃娃”出现的一个原因就是我们 在食品蛋白质检验过程中存在的问题：通常 我们利用凯氏定氮法测定食品中的氮含量， 再利用以下公式计算出食品中的蛋白质含量
四．解决凯氏定氮法弊端
解决问题的根本方法，是直接测试食品中的真蛋白
质含量。因为，如果能够一次直接测定食品中真蛋白质含 量，以真蛋白质含量为标准，那么就堵住了市场监管上的 漏洞，使伪劣产品无所遁形。因此添加假蛋白质物质，如
蛋白质测定凯氏定氮法
蛋白质测定凯氏定氮法
凯氏定氮法是一种常用的蛋白质测定方法，用于测定各种蛋白质或其他有机氮类物质的含量。
它由古斯塔夫·凯氏于1956年提出，是一种快速、可靠的蛋白质测定方法，它克服了传统Kjeldahl法中所涉及的大量容易导致氮测定误差的复杂操作，使蛋白质的检测准确度得到显著改善。
凯氏定氮法主要是将样本中的氮类物质进行分解，分解得到的氮以其化合物的形式分离出来并经过反应成含氮组分，最后由计量检验反应产物，以估算样本中氮的含量，以及有机
氮复合物的含量，以计算出蛋白质的含量。
凯氏定氮法只建议使用石膏亲水溶剂进行一定容积的氢氟酸分解，分解液进入另外一个高容积的溶液，氮作为硝酸铵来反应，最后氮量用碘估算，根据此样本的蛋白质含量的估算。
凯氏定氮法具有易于操作、准确度高等优点，为蛋白质含量测定提供了快速有效的方法，可用于研究各种蛋白质的组成、结构、功能及其它生理活性成分的研究，也可用于蛋白质
的质量管理等研究。
然而，凯氏定氮法也有一些缺点，反应产物有可能发生多余反应，并可影响实验结果的准
确性，若样品中含有有机物对氮的结果也会产生影响。
此外，氢氟酸的分解可能会引起安
全问题，因此需要注意安全操作。
总之，凯氏定氮法是一种有效、可靠的蛋白质测定方法，在科研和实验室检测中有广泛的应用，但也应注意质量控制、注意安全操作等方面的问题，以保证原始数据的可靠性和准确性。
凯氏定氮法测定蛋白质含量
凯氏定氮法测定蛋白质含量【凯氏定氮法测定蛋白质含量】引言：蛋白质是生物体中非常重要的一类有机物质，它在细胞结构、代谢调节、酶催化等方面都起到至关重要的作用。
因此，准确测定蛋白质的含量对于研究生物体的生理功能和代谢过程十分重要。
凯氏定氮法是一种常用的测定蛋白质含量的方法，它利用蛋白质中的氮元素与含氮化合物反应，通过测定反应生成物中的氨基氮含量来确定蛋白质的含量。
本文将一步一步地介绍凯氏定氮法测定蛋白质含量的原理、实验步骤以及注意事项。
一、原理：凯氏定氮法的原理基于蛋白质是含有较高比例的氮元素的化合物。
测定蛋白质的含量可以通过测定样品中氨基氮的含量来实现，其中氨基氮与蛋白质的含量呈线性关系。
凯氏定氮法的核心步骤是将蛋白质样品与含有氧化剂的酸溶液一起加热，使蛋白质中的氮元素被氧化转化为氨基氮，然后用氨盐指示剂反应形成带有颜色的化合物，最后通过比色分析来测定蛋白质中氮元素的含量。
二、实验步骤：1. 实验前准备：根据实验需求准备蛋白质样品、凯氏试剂、氨盐指示剂等。
2. 样品制备：将蛋白质样品称取适量，加入酸性溶液中溶解，使其完全溶解。
注意保持溶液的酸性，并避免样品中的氨基酸被过度氧化。
3. 氮元素的氧化：将样品溶液与凯氏试剂混合，在适当的温度下加热，使样品中的氮元素被氧化转化为氨基氮。
反应时间根据样品的性质而定，一般为1-2小时。
4. 反应结束：冷却样品溶液，使其达到室温。
反应结束后，样品中的蛋白质会被转化为氨基氮。
5. 比色分析：将反应溶液与氨盐指示剂进行反应，形成带有颜色的化合物。
然后使用分光光度计测定化合物的吸光值。
通过与标准曲线进行比较，可以确定样品中氨基氮的含量，进而计算出蛋白质的含量。
三、注意事项：1. 样品的选择：样品的选择取决于实验的目的，可以是纯蛋白质样品，也可以是含有蛋白质的复杂混合物。
样品的含量和浓度应该适当，以保证实验结果的准确性。
2. 温度和时间的控制：样品与凯氏试剂的加热温度一般为75-105摄氏度，反应时间根据样品的性质而定。
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食品中蛋白质含量测定（凯氏定氮法）
一、目的与要求
1、学习凯氏定氮法测定蛋白质的原理。
2、掌握凯氏定氮法的操作技术，包括样品的消化处理、蒸馏、滴定及蛋白质含量计算等。
二、实验原理
蛋白质是含氮的化合物。
食品与浓硫酸和催化剂共同加热消化，使蛋白质分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，留在消化液中，然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，再用盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量来乘以蛋白质换算系数，即得蛋白质含量。
因为食品中除蛋白质外，还含有其它含氮物质，所以此蛋白质称为粗蛋白。
三、仪器与试剂
硫酸铜（CuSO4·5H20）硫酸钾硫酸（密度为L）硼酸溶液（20g/L）
氢氧化钠溶液（400g/L）L盐酸标准滴定溶液。
混合指示试剂：%甲基红乙溶液液1份，与%溴甲酚绿乙醇溶液5份临用时混合。
微量定氮蒸馏装置：如图3-所示。
图3-微量凯氏定氮装置
1、电炉；
2、水蒸气发生器（2L平底烧瓶）；
3、螺旋夹a；
4、小漏斗及棒状玻璃塞（样品入口处）；
5、反应室；
6、反应室外层；
7、橡皮管及螺旋夹b；8、冷凝管；9、蒸馏液接收瓶。
四、实验步骤
1、样品消化
称取样品约（±），移入干燥的100mL凯氏烧瓶中，加入硫酸铜和6g硫酸钾，稍摇匀后瓶口放一小漏斗，加入20mL浓硫酸，将瓶以450角斜支于有小孔的石棉网上，使用万用电炉，在通风橱中加热消化，开始时用低温加热，待内容物全部炭化，泡沫停止后，再升高温度保持微沸，消化至液体呈蓝绿色澄清透明后，继续加热，取下放冷，小心加20mL水，放冷后，无损地转移到100mL容量瓶中，加水定容至刻度，混匀备用，即为消化液。
试剂空白实验：取与样品消化相同的硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸，按以上同样方法进行消化，冷却，加水定容至100mL，得试剂空白消化液。
2、定氮装置的检查与洗涤
检查微量定氮装置是否装好。
在蒸气发生瓶内装水约三分之二，加甲基红指示剂数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠（或沸石）以防止暴沸。
测定前定氮装置如下法洗涤2~3次：从样品进口入加水适量（约占反应管三分之一体积）通入蒸汽煮沸，产生的蒸汽冲洗冷凝管，数分钟后关闭夹子a ，使反应管中的废液倒吸流到反应室外层，打开夹子b 由橡皮管排出，如此数次，即可使用。
3、碱化蒸馏
量取硼酸试剂20mL 于三角瓶中，加入混合指示剂2~3滴，并使冷凝管的下端插入硼酸液面下，在螺旋夹a 关闭，螺旋夹b 开启的状态下，准确吸取样品消化液，由小漏斗流入反应室，并以10mL 蒸馏水洗涤进样口流入反应室，棒状玻塞塞紧。
使10mL 氢氧化钠溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其缓缓流入反应室，用少量水冲洗立即将玻塞盖坚，并加水于小玻杯以防漏气，开启螺旋夹a ，关闭螺旋夹b ，开始蒸馏。
通入蒸汽蒸腾10min 后，移动接收瓶，液面离开凝管下端，再蒸馏2min 。
然后用少量水冲洗冷凝管下端外部，取下三角瓶，准备滴定。
同时吸取试剂空白消化液按上法蒸馏操作。
4、样品滴定
以L 盐酸标准溶液滴定至灰色为终点。
5、数据记录
五、结果计算 10010100
0140.0)(21⨯⨯⨯⨯⨯-=F m c V V X 式中 X ——样品蛋白质含量（g/100g ）；
V 1——样品滴定消耗盐酸标准溶液体积（mL ）； V 2——空白滴定消耗盐酸标准溶液体积（mL ）；
c ——盐酸标准滴定溶液浓度（mol/L ）；
——盐酸]/000.1)([L mol HCl c 标准滴定溶液相当的氮的质量（g ）；
m ——样品的质量（g ）；
F ——氮换算为蛋白质的系数，一般食物为；乳制品为；面粉为；
高梁为；花生为；米为；大豆及其制品为；肉与肉制品为
；大麦、小米、燕麦、裸麦为；芝麻、向日葵。
计算结果保留三位有效数字。
六、注意事项及说明
1、本法也适用于半固体试样以及液体样品检测。
半固体试样一般取样范围为~；液体样品取样~（约相当氮30mg~40mg ）。
若检测液体样品，结果以g/100mL 表示。
2、消化时，若样品含糖高或含脂及较多时，注意控制加热温度，以免大量泡沫喷出凯氏烧瓶，造成样品损失。
可加入少量辛醇或液体石蜡，或硅消泡剂减少泡沫产生。
3、消化时应注意旋转凯氏烧瓶，将附在瓶壁上的碳粒冲下，对样品彻底消化。
若样品不易消化至澄清透明，可将凯氏烧瓶中溶液冷却，加入数滴过氧化氢后，再继续加热消化至完全。
4、硼酸吸收液的温度不应超过40℃，否则氨吸收减弱，造成检测结果偏低。
可把接收瓶置于冷水浴中。
5、在重复性条件下获得两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。