3种高密度脂蛋白胆固醇检测方法的比较

3种高密度脂蛋白胆固醇检测方法的比较

郭林潘逸茹v熊菁孙仁勇v v

(上海医科大学肿瘤医院检验科上海200032;v华东医院检验科上海200040;

v v上海复旦张江生物医学有限公司上海201203)

近年来国内外对H DL-C的测定方法均进行了广泛的研究[1~3]。国内临床上普遍所用的是磷钨酸钠-镁沉淀法或聚乙二醇沉淀法,该方法准确度、稳定性均较好,试剂价格低廉,但操作步骤多,在血清中需加入沉淀剂,使血清LDL和VLDL发生沉淀,然后再用酶法测定血清中的HDL-C。而酶修饰法、多聚阴离子遮蔽法等避免了沉淀步骤,样品无需处理,可以直接测定血清中的H DL-C,这些方法简便了实验室的常规工作[4~6]。为了对新的HDL-C方法进行临床评价,我们对磷钨酸钠-镁沉淀法(PAT/MgCl2)、多聚阴离子遮蔽法(PPD)和酶修饰法(PGME)进行了比较,对其准确性、稳定性、线性范围、特异性进行了分析,并对此3种方法对甘油三酯、胆红素和血红蛋白的干扰影响进行了测评。

材料和方法

样品临床常规检测血清标本。血标本在室温中静置1~2h,在室温下离心10min(1500r/ min),收集血清。

试剂总胆固醇和甘油三酯测定试剂、HDL-C磷钨酸沉淀法试剂,由上海复旦张江生物医药有限公司出品;化学遮蔽法H DL-C测定试剂,由日本第一化学株式会社出品;酶修饰法HDL-C测定试剂,由德国宝灵曼公司出品。

仪器日立-7060全自动生化分析仪。

甘油三酯和胆固醇测定方法具体操作按厂家说明书进行(酶法终点法)。

磷钨酸沉淀法取血清200与500L l沉淀剂混合,在室温静置10min,然后以6000r/min离心10 min,取上清液按胆固醇酶法终点法在日立-7060上测定。

酶修饰法该试剂盒为双试剂,试剂1含有表面活性剂和硫酸葡聚糖,能减少乳糜微粒和VLDL 对胆固醇试剂的反应;试剂2含有经PEG修饰过的胆固醇脂酶和胆固醇氧化酶,以及过氧化物酶、4-氨基安替比啉及D H BS。经PEG修饰过的酶能选择性地作用于HDL。操作时首先将4L l血清与300 L l试剂1混合,37e孵育5min,然后加100L l试剂2,反应时间为10min,主波长为600nm,副波长为700nm。

化学遮蔽法该试剂为双试剂,试剂1含有多聚阴离子和MgCl2,能选择性地与乳糜微粒、VDLD、LDL结合发生遮蔽作用,使胆固醇检测试剂只能作用于H DL。试剂2中含有常规的胆固醇检测试剂,在2~8e保存可稳定12个月以上。操作时血清为3L l,加入300L l的试剂1,37e5min,然后加入试剂2,主波长为550nm,副波长为700nm。

结果

重复性试验丹麦耐可明公司的质控血清(包括高、中、低3个值)为检测对象,我们对3种方法的精确度进行了比较,结果均符合要求,26d的天内误差在0.62%~0.82%,20d的天间误差在1.83%至2.4%,误差均在允许范围内。结果见表1。

表13种方法的精密度比较

Tab1Compar ation of thr ee assa ys.pr ecision

Control

serum

HDL-C Value

123

CV%i n Day

(n=26)

123

CV%Day to Day

(n=20)

123 High4204224280.620.710.78 1.942.32.4 Middle3203193160.640.710.81 1.842.32.4 Low2602702660.730.710.82 2.252.32.4

1.PAT/MgCl2

2.PGME

3.PPD

特异性试验我们将不同浓度的LDL-C加入到HDL-C的标本中去,检测结果表明3种方法均有良好的特异性。在LDL-C浓度高达2000 mg/L时,对磷钨酸沉淀法、化学遮蔽法均没有明显影响(分别为+3%和+4%),而对酶修饰法测定结果有一定的影响(+10%)。再将不同浓度VLDL-

C加入到H DL-C标本中去,VLDL-C浓度高达400mg/L时,磷钨酸沉淀法和化学遮蔽法均有良好的特异性(+3%和+4%),而400mg/L的VLDL-

C已经影响到酶修饰法的特异性,偏差为+18%。结果见图1、2。

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上海医科大学学报

J Shanghai Med Univ1999May,26(增刊)

线性试验 将收集的临床高值血清标本做梯度稀释,分别为250、500、750、1000、1500、1800、2000、2300、2500mg/L,检测结果表明磷钨酸沉

淀法和酶修饰法均可达1600mg,检测最低限度分别为5.0和4.8mg/L,化学遮蔽法的线性可达1

700mg/L,最低限度为4.7mg/L 。结果见图3

。

图1 3种方法对LDL-C 的特异性Fig 1 Specificity of three assays

to LDL-C

图2 3种方法对VLDL-C 的特异性Fig 2 Specificity of three assaysto

VLDL-C

图3 3种方法线性比较Fig 3 Compar ation of three assays .

linety

回收率测定 在已知值H DL-C(200、300、400mg/L)的血清标本中,分别加入超速离心提纯的HDL-C 各200mg/L,分别用3种不同的检测试剂盒检测结果,我们发现均有良好的回收率。结果见表2。

抗干扰性能 我们将不同浓度的血红蛋白、胆红素、甘油三酯加入到HDL-C 标本中,检测结果与对照组进行比较。当甘油三酯浓度至22g/L 时,对3种方法均没有明显的干扰作用,但当血红蛋白浓度高达8g/L 时,对酶修饰法和化学遮蔽法有一定的干扰作用(分别为+15%和+12%)。当胆红素浓度为450mg/L 时,对3种方法均有一定的干扰(分别为-22%、-26%、-20%)。结果见图4。

表2 HDL-C 的回收率测定

Tab 2 Determina tion of HDL-C .s r eser val r ate

Method Measure value Measure value after supplemental HDL-C Reserval

rate(%)PAT/MgCl 2

202408103308522107406618106PGME

2063949431350696.540460299PPD 198417109.5302516107413

630

108.5

图4 抗甘油三酯(a)、胆红素(b)、血红蛋白(c)干扰测定

Fig 4 Determination of anti 2interfer ence with tr iglycoride(a),bilir ubin(b),hemoglobin(c)

讨 论

在90年代以前国际上通用磷钨酸沉淀法或聚乙二醇沉淀法测定HDL-C,虽然这些方法的准确性相当好,其准确度接近于超速离心测定法,但由于操作时步骤较多,临床化验操作不便。90年代始,国际上出现了H DL -C 测定的一步法技术,使HDL-C 的测定更加简便,更适用于自动化操作[7]。本研究发现,不管是酶修饰法、化学遮蔽法还是磷钨酸沉淀法,均有良好的线性范围,其中化学遮蔽法的线性范围达1700mg/L,敏感度为4.6mg,与磷钨酸沉淀法完全相似,不管是天内误差还是天间误差,均在相当低的范围内,且具有同等的测定精密度

(CV%为0.62%~2.3%)。

本研究检测了酶修饰法和化学遮蔽法的特异性,在检测标本中分别加入VDLD 、LDL,结果表明当VLDL 浓度为400mg/L 时,酶修饰法的测定值偏高18%,化学遮蔽法偏高3%,后者与磷钨酸沉淀法(+4%)接近。当LDL 浓度为2000mg/L 时,酶修饰法测定值增高10%,化学遮蔽法测定值增高2%,磷钨酸沉淀法测定值增高1%。后两种方法均表现出优良的特异性。

血清中的血红蛋白、胆红素和甘油三酯均有可能干扰HDL-C 的测定。我们发现血红蛋白浓度高达8g 时,对酶修饰法和化学遮蔽法有一定的干

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