活性氧自由基对心肌细胞损伤效应研究
心肌缺血再灌注损伤中细胞焦亡的研究进展
国际免疫学杂志2021年1月第44卷第1期丨m j hnmUn 〇U a n .2021,V 〇1.44，N 〇. 1• 71 ••综述•心肌缺血再灌注损伤中细胞焦亡的研究进展刘成兴林吉斌李大主华中科技大学同济医学院附属协和医院心内科，武汉43〇〇22 通信作者：李大主，E m a i l :lid a z h u h p @ s o h u . c o m ,电话：139****1110【摘要】细胞焦亡是近年来发现并被证实的一种新的细胞程序性死亡方式，它的特征是依赖半胱氨酸天冬氨酸酶丨（cysteinyl aspartate specific proteinase 1 ,caspase-l)并伴随大量炎症因子的释放。
细胞 焦亡参与了包括感染性疾病在内的多种疾病的病理生理过程作为一种新的调节性细胞死亡方式，近 年来细胞焦亡受到了广泛的关注。
新近研究发现，细胞焦亡也参与了心肌缺血再灌注损伤（myocardialiscliemia reperfusion injury,MIRI)过程，文摩:就M 丨R I 中细胞焦亡的研究进展进行综述.【关键词】细胞焦亡;心肌缺血再灌注损伤;炎性小体基金项目：国家自然科学基金（8〗670404,81700390)D O I ：10. 3760/cma.j. issn. 16734394.2021.01.012Research progress of cell pyroptosis in myocardial ischemia reperfusion injuryLiu Chengxing，Lin Jibin ,Li DazhuDepartment of Cardiology .Union Hospital ,Tongji Medical College ,Haazhong University o f Science and Technology ,Wuhan 430022, ChinaCorresponding author ： Li I)azhu , Email ： lidazkuhp@ sohu. com , Tel ： 13971091 1 10【Abstract 】 Cell pyroptosis is a newly found m o d e of regulated cell death and experimentally verified re-c-ently. I t i s characterized l )y i t s dependence on cysteinyl asparlale specific proteinase 1 (caspase-1 ) and the release of a large numb e r of inflammatory factors. Pyroptosis i s involved in the pathophysiological process of m a n y diseases including infectious diseases. As a new way of regulatory cell death, pyroptosis has attracted extensive attention in recent years. Recent studies have found that i t participates iq the pathological processes of myocardial ischemia reperfusion injury ( M I R I ) . This review summarized the research progress of cell pyroptosis in MIRI.【Key words 】Cell pyroptosis; Myocardial ischemia reperfusion injury; InflammasomeFund program ： National Natural Science Foundation of China( 81670404,81700390)D O I ： 10. 3760/cma. j . issn. 16734394. 2021.01.012上的模式识别受体（pattern recognition receptor ,P R R)识别并诱导相应的炎症反应过程，这些炎症细胞包括单核/巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞 等夂。
激活乙醛脱氢酶2的表达可减轻过氧化氢诱导的心肌细胞损伤
激活乙醛脱氢酶2的表达可减轻过氧化氢诱导的心肌细胞损伤曹瑞平;王文连;方婷婷;叶红伟;胡杰;高琴【摘要】目的探讨线粒体乙醛脱氢酶2(ALDH2)在过氧化氢(H2O2)诱导的心肌细胞氧化应激损伤中的变化.方法正常体外培养的H9C2心肌细胞,取对数生长期细胞建立H2O2氧化应激损伤模型,分为正常对照组、正常+ALDH2激动剂Alda-1组、H2O2损伤组、H2O2+ALDH2激动剂Alda-1组、H2O2+ALDH2抑制剂Daidzin组;MTT比色法测定各组心肌细胞活力,DHE荧光染色检测各组心肌细胞氧化应激水平,分光光度法和Western blotting法分别检测ALDH2活性及蛋白水平变化.结果与正常对照组相比,正常+ALDH2激动剂Alda-1组心肌细胞活力、氧化应激水平、ALDH2活性水平和蛋白表达均无明显变化(P＞0.05);H2O2损伤组心肌细胞活力明显下降,DHE荧光染色显示氧化应激水平明显升高,ALDH2活性和蛋白表达降低(P＜0.05);给予Alda-1激动ALDH2后,与H2O2损伤组相比,心肌细胞活力升高,氧化应激水平下降,ALDH2活性和蛋白表达均明显升高(P＜0.05);给予Daidzin阻断ALDH2后,与-2O2损伤组相比,心肌细胞活力、氧化应激水平、ALDH2活性水平和蛋白表达均无明显变化(P＜0.05).结论H2O2直接诱导H9C2心肌细胞ALDH2活性及蛋白表达下降;提高心肌ALDH2表达可减轻H2O2诱导的氧化应激损伤.【期刊名称】《南方医科大学学报》【年(卷),期】2018(038)008【总页数】5页(P938-942)【关键词】乙醛脱氢酶2;氧化应激;心肌损伤;过氧化氢【作者】曹瑞平;王文连;方婷婷;叶红伟;胡杰;高琴【作者单位】蚌埠医学院生理学教研室,安徽蚌埠233030;蚌埠医学院第一附属医院呼吸与危重症医学科,安徽蚌埠233004;蚌埠医学院生理学教研室,安徽蚌埠233030;蚌埠医学院生理学教研室,安徽蚌埠233030;蚌埠医学院生理学教研室,安徽蚌埠233030;蚌埠医学院生理学教研室,安徽蚌埠233030【正文语种】中文近年来研究表明，不同浓度的活性氧自由基（ROS）参与心肌的生理过程及病理损害[1]。
临床应用心肌缺血预适应与后适应的哲学理论
临床应用心肌缺血预适应与后适应的哲学理论【摘要】心肌缺血是一种常见的心血管疾病，在临床上具有重要意义。
预适应和后适应是心肌缺血时的两种不同保护机制。
预适应通过预先引导机体适应缺血环境，发挥自身保护作用；后适应则是在缺血发生后才启动保护机制。
两者在心肌缺血过程中起到重要作用，但又存在一定的区别与联系。
未来在临床实践中，预适应和后适应的理论将有广阔的应用前景，有望为临床治疗和疾病预防提供新的思路。
对于心肌缺血预适应和后适应的机制还有许多未知，未来的研究方向应着重探讨这些机制，为临床应用提供更深入的理论基础。
【关键词】心肌缺血、预适应、后适应、心肌保护机制、临床应用、哲学理论、实践应用、研究方向。
1. 引言1.1 背景介绍心肌缺血是心脏血液供应不足造成的病理状态，是冠心病的主要表现之一。
当冠脉供血量不能满足心肌的代谢需求时，就会发生心肌缺血，导致心肌细胞功能受损甚至死亡。
心肌缺血是心血管疾病的常见并发症，严重威胁患者的生命健康。
在临床实践中，预防和治疗心肌缺血一直是医学界关注的重要问题。
传统治疗方法主要包括药物治疗、介入治疗和手术治疗等，但效果有限，且存在一定的副作用。
寻找新的治疗策略对于改善心肌缺血的预后具有重要意义。
近年来，心肌缺血预适应和后适应的理论逐渐引起了研究者的关注。
预适应指通过一次适度的缺血再灌注来保护心肌免受后续缺血再灌注损伤，而后适应是指先经历一次缺血再灌注损伤后，心肌对后续缺血再灌注损伤变得耐受。
这两种适应机制为心肌缺血的防治提供了新的思路和策略。
1.2 研究意义心肌缺血预适应与后适应的哲学理论在临床应用中具有重要的研究意义。
了解心肌缺血预适应和后适应的机制有助于我们深入探究心肌缺血的发生过程和保护机制，从而为心脏疾病的预防和治疗提供新的思路和方法。
预适应和后适应作为两种心肌保护机制，研究其区别与联系可以帮助我们更好地理解心脏对缺血的应激反应，为开发新的心脏保护策略提供理论基础。
心肌缺血预适应和后适应的理论在临床实践中的应用前景巨大，可以为临床医生提供更有效的心肌保护策略，提高心脏病患者的生存率和生活质量。
自由基的危害
2、生活方式： 吸烟。每吸一口烟，吸入的自 由基是正常呼吸的20倍。 酗酒。乙醇使肝细胞受损，酶 系统破坏，抗氧化能力下降， 肝内自由基增加。
紧张情绪和过快的生活节奏 细胞代谢过程中产生过多的自由基，使大 脑和内脏中脂质过氧化，引发冠心病、高 血压； 应激反应使体内抗氧化营养素消耗增加， 清除多余自由基的能力下降，细胞群受损， 人有明显的疲劳感。
食品加工过于精细，破坏了原有的营养成分。
如精米精面中B族维生素的流失； 切碎后的蔬菜中水溶性维生素的流失； 果汁饮料中维生素C的流失等； 烹调加热过程中维生素被破坏等
续：
长期过饱食，消化系统的负担加重，物质 代谢过程中自由基产生增加，加速衰老； 饮水少，不能充分稀释进入消化道的有害 物质。
续：
营养保健措施 大量VC（5-30克/日）治疗，小量预防； VE能保护此酶活性，预防克山病； 补充硒制剂。
（五）脂肪肝
病因一、 过食高脂食物； 肝细胞氧化反应增强，自由基产生增加； 自由基损害线粒体，影响正常的能量代谢； 脂肪酸不能充分的被氧化，肝内脂肪沉积。
续：
病因二、 饮酒过度； 有毒有害物质破坏肝细胞的结构，抑制抗氧化 酶的活性； 脂蛋白合成障碍，自由基清除减少，造成肝内 脂肪沉积。
（3）小麦胚芽油营养胶囊 提供7种天然维生素E，生物活性高。 脂溶性维生素，清除脂链反应中产生的自 由基； 1个维生素E可以作用于1000个脂类分子。 与维生素C、谷胱甘肽过氧化物酶等协同 发挥作用。
VC和VE是如何相互作用的？
在脂类物质中，VC没有抗氧化的作用，但在 VE存在的情况下，VC可以发挥较高的抗氧化 作用。 两者共存时，VE可以对抗更多的脂质分子，而 且不被消耗。 抵御自由基时，VC先被消耗，只有VC被消耗 殆尽时，才会消耗VE。
心肌营养素1对心肌细胞缺氧复氧损伤的作用及信号机制的研究
率 明 显 降低 ， 粒 体 膜 电 位 下 降 ，ＮＯ ＮＡ 表 达 明 显 下 调 （ ＜ Ｏ ０ ） 与缺 氧 复 氧 组 比较 ， 线 ｅ ＳｍＲ Ｐ ．５ ； 营养 素 组 心 肌 细 胞
存 活 率 明 显升 高 ， 肌 细 胞 凋 亡 率 及 细 胞 内 Ｒ Ｓ明 显 减 少 ， 粒 体 膜 电 位 水 平 更 高 ， 酸 化 Ｐ ３ 蛋 白水 平 增 加 ， 心 ０ 线 磷 ＩＫ
物 检 测 心 肌 细 胞 线 粒 体 膜 电位 ， 氯 荧 光黄 双 乙酸 盐 检 测 细 胞 内 活 性 氧 （ 二 Ｒ０Ｓ） 用 流 式 细 胞 仪 检 测 心 肌 细胞 凋 亡 ，
率 。采 用 Ｒ － Ｃ 法检 测 心肌 细胞 内皮 型 一 氧 化 氮合 酶 （ ＮＯ ）ＩＲ ＴＰ Ｒ ｅ ｓ Ｔ ＮＡ 表 达 ， ｅｔ ｒ ｌ 检 测 磷 酸 化 磷 脂 酰 肌 Ｉ Ｗ ｓｅｎ ｂｏ ｔ 醇 ３激 酶 （ ＩＫ） 白 水 平 。 结 果 与 对 照组 比较 ， 氧 复 氧 组 心 肌 细 胞 凋 亡 率及 Ｒ０ Ｐ３ 蛋 缺 ｓ明 显 增 加 ， 心肌 细 胞 存 活 而
ｎ ｔ ｌ ａｓｗｅ ｅｄｖｄ ｄ ｉｔ ｉｅ ｇ ｏ ｐ ： ｒ ｕ ａａ ｔ ｒ ｉｉｅ ｎ ｏ ｆ ｒ ｕ ｓ ｇ ｏ ｐ工 ：ｏ ｔｏ ， ｒ ｕ Ｈ／ ｇ ｏ ｐ１ Ｈ／ ｒ ｖ ｃ ｎ ｒ ｌ ｇ ｏ ｐ１ Ｉ： Ｒ， ｒ ｕ １ １： Ｒ＋ＣＴ一 ＋ １ ＬＹ２ ４ ０ ｇ ｏ ｐＩ Ｈ／ ＋ Ｃ １ ｇ ｏ ｐＶ ： Ｒ ＋ ＣＴ一 ＋ ＤＭＳ Ｃａ ｉｍｙ ｃ ｔｓ ｓ ｒ ｉａ ａ ｅ ９ ０ ２， ｒ ｕ Ｖ： Ｒ Ｔ一 ， ｒ ｕ Ｈ／ １ Ｏ． ｄｏ ｏ ｙｅ ｕ ｖｖ ｌｒ ｔ
ｉｊ ｒ ｎ ｉｎ ｌ ｇｍｅｈ ｎｓ ｎ ｙ ａ ｄｓｇ ａｉ ｃ ａ ｉ ｎ ｎ ｍ
游离脂肪酸与组织细胞损伤相关性的研究进展
游离脂肪酸与组织细胞损伤相关性的研究进展袁涛(综述);赵建宁;包倪荣(审校)【摘要】游离脂肪酸（free fatty acids， FFA）是脂肪的代谢产物，能刺激中性粒细胞产生活性氧，如过氧化氢和次氯酸。
研究表明FFA与心肌、血管内皮、肝、肺等组织损伤密切相关。
红细胞损伤的机制则是细胞膜表面的多不饱和脂肪酸和胞内血红蛋白受到活性氧的氧化过程。
高浓度FFA可导致高活性反应分子氧簇活性氧生成增多，从而启动了氧化应激机制，活性分子可直接氧化和损伤脫氧核醣核酸、蛋白质、脂类等分子。
文中综述近年来对FFA与红细胞损伤之间相关性的研究进展，为研究氧化性贫血提供新方向。
%Free fatty acids generated from the metabolites of fat have been demonstrated to stimulate the neutrophils to produce reactive oxygen species ( ROS) such as hydrogen peroxide and chlorous peroxide .It has shown that free fatty acid is closely related with myocardial, vascular endothelium, liver, lung and other tissue damage.The mechanism of erythrocyte injury is oxidation of mem-brane polyunsaturated fatty acids and cytosolic hemoglobin by ROS .High levelsof free fatty acids can increase the formation of active reaction molecular ROS , thus initiating the oxidative stress reaction .Active molecules can oxalate and damage the DNA , protein, lipid and other molecules of RBC .It has revealed the relationship between free fatty acids and erythrocytes injury , which provided a new di-rection in the research of oxidative anemia .This article reviews the advances in the research of this subject in recent years .【期刊名称】《医学研究生学报》【年(卷),期】2014(000)009【总页数】4页(P994-997)【关键词】游离脂肪酸;红细胞损伤;活性氧;氧化应激【作者】袁涛(综述);赵建宁;包倪荣(审校)【作者单位】210002 南京，南方医科大学南京临床医学院南京军区南京总医院骨科;210002 南京，南方医科大学南京临床医学院南京军区南京总医院骨科;210002 南京，南方医科大学南京临床医学院南京军区南京总医院骨科【正文语种】中文【中图分类】Q20 引言游离脂肪酸(free fatty acid，FFA)在人体内的含量变化对心脏、肺、肝、肾等器官影响明显，且FFA对靶器官的作用主要是通过氧化应激反应。
MAPK+与糖尿病心肌细胞凋亡关系的研究进展
・糖尿病及并发症专栏・ＭＡＰＫ与糖尿病心肌细胞凋亡关系的研究进展ＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．１００８－１３７２．２０１４．０２．０１６作者单位：０５００００ 石家庄，河北医科大学第二医院内分泌科通信作者：张力辉，Ｅｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｌｉｈｕｉ１０５１０＠１６３．ｃｏｍ李娜 朱秋霄 袁玲玲（综述） 张力辉（审校）［关键词］ 丝裂原激活蛋白激酶类；糖尿病并发症；心肌／细胞学；心肌疾病／病因学；细胞凋亡；综述 随着生活水平的提高，糖尿病患者越来越多，据最新全国流行病学调查，我国成年人糖尿病发病率已达１１畅６％，而心血管疾病是糖尿病患者的主要死亡原因。
糖尿病性心肌病（ｄｉａｂｅｔｉｃｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ，ＤＣＭ）是指特发于糖尿病患者，除外冠心病、高血压等疾病，以心室舒张或收缩功能障碍及心脏结构改变为主要表现、最终可进展为心力衰竭的一种疾病［１］。
糖尿病性心肌病变与糖尿病特有的代谢异常有关，其发病机制尚不完全明确，目前认为是糖脂代谢紊乱、肾素－血管紧张素系统激活、炎症、氧化应激等多因素综合作用所致［２］。
越来越多的研究证明，糖尿病心肌病存在心肌细胞凋亡［３－５］，而丝裂原活化蛋白激酶（ｍｉｔｏｇｅｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅｓ，ＭＡＰＫ）通路与心肌细胞凋亡有关［６］。
阻断ＭＡＰＫ通路或将是治疗糖尿病心肌病的新趋势。
１ ＭＡＰＫ通路与凋亡１．１ ＭＡＰＫ通路组成 ＭＡＰＫ是在哺乳动物中广泛表达的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，包含４个主要家族，细胞外信号调节激酶１／２（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｓｉｇｎａｌｒｅｇｕｌａｔｅｄｋｉｎａｓｅ１／２，ＥＲＫ１／２），ｐ３８，ｃ－Ｊｕｎ氨基端激酶／应激活化蛋白激酶（ｃ－ＪｕｎＮ－ｔｅｒｍｉｎａｌｋｉｎａｓｅ／ｓｔｒｅｓｓａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ，ＪＮＫ／ＳＡＰＫ），ＥＲＫ５／大丝裂原活化蛋白激酶１（ＢｉｇＭＡＰｋｉｎａｓｅ，ＢＭＫ１）。
微血管状态调节中HIF-1信号通路的参与研究-病理学论文-基础医学论文-医学论文
微血管状态调节中HIF-1信号通路的参与研究-病理学论文-基础医学论文-医学论文——文章均为WORD文档，下载后可直接编辑使用亦可打印——摘要：低氧导因子1（HIF-1）与微循环功能中的血管新生以及炎性反应密切相关。
研究表明，HIF-1通过调控下游血红素加氧酶及血管内皮生长因子影响血管生成。
另外一方面，HIF-1通过调控白细胞介素8等细胞趋化因子影响血管炎症状态。
目前急性心肌梗死及糖尿病中的微循环障碍越来越受到关注。
深入了解微循环障碍的分子靶点，对微循环障碍的治疗尤为重要。
HIF-1作为低氧状态下的适应性调节因子，通过影响血管新生、细胞凋亡、炎症及氧化应激等多种环节参与微循环功能调节。
鉴于HIF-1在微循环障碍中的地位，以HIF-1为靶点的微循环障碍治疗越来越得到关注。
关键词：微循环障碍; 低氧导因子; 血管新生;Abstract：Hypoxia inducible factor-1（HIF-1）is closely related to angiogenesis and inflammation response in the pathological process. Previous studies showed that HIF-1 affects angiogenesis byregulating the expression of heme oxygenase and vascular endothelial growth factor. Additionally,HIF-1 affects vascular inflammation by regulating chemokines such as interleukin-8. With the increasing evidences of microvascular dysfunction induced by acute myocardial infarction and diabetes,the microvascluar dysfunction treatment is getting important.A deep insight of HIF-1 is crucial in therapy of microvascular dysfunction.Keyword：Microvascular dysfunction; Hypoxia inducible factor; Angiogenesis ;低氧通常通过多种机制促进血管稳态失衡，包括血栓形成、动脉粥样硬化、缺血再灌注损伤。
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活性氧自由基对心肌细胞损伤效应研究*林灼锋1李校坤1,2**孟 娟2(1暨南大学药学院生物制药教研室 广州 510632 2暨南大学医药生物研究开发中心 广州 510632)摘要 为探讨活性氧自由基对心肌细胞的影响,采用胰蛋白酶酶消化法分离SD 乳鼠心肌细胞,培养于适当的条件并观察其形态学和生理学方面的特征;加入H 2O 2活性氧刺激心肌细胞,模拟氧自由基损伤心肌细胞方式,构建心肌细胞缺血再灌注损伤的模型并了解H 2O 2对心肌细胞的损伤作用。
结果表明胰蛋白酶消化分离的心肌细胞能够在体外完好生长,并能够在一段时间内维持其原有的生理特性;MTT 检测结果和形态学观察结果表明H 2O 2对心肌细胞的损伤与其浓度和作用时间呈正比关系,TUNEL 和DNA 凝胶电泳分析结果显示,H 2O 2在心肌细胞中的积累是造成细胞凋亡的主要因素之一。
关键词 心肌细胞培养 H 2O 2 氧自由基 心肌细胞损伤收稿日期:2004 02 25 修回日期:2004 04 19*国家 863 计划项目(2001AA215131)和国家 十五 创新药物重大专项基金资助项目**通讯作者,电子信箱:zflwf@s 1953年Durrows 和Moscona 首次成功地应用生物酶分离出鸡胚心肌细胞后[1],其分离培养技术不断发展,围绕着心肌细胞的质量和数量两方面,形成了多种多样的方法,其中包括离体心脏灌注法、心肌细胞酶浸泡消化法和贴块培养法。
对新生幼年动物而言,酶浸泡消化法无论在分离心肌细胞的质量和数量方面,还是在操作方面均为研究人员的首选方案。
心肌细胞在体外的成功培养对心肌细胞进行生物学特性的研究,建立一些实验病理模型[2],已成为心脏病研究的重要手段之一。
本文采用胰蛋白酶酶消化法分离SD 乳鼠的心肌细胞进行体外培养,观察其形态学和生理学方面的特征,并用活性反应氧H 2O 2模拟氧自由基刺激心肌细胞,建立氧自由基损伤心肌细胞的模型,从细胞形态学及其它方面观察H 2O 2对心肌细胞的损伤效应,借此了解心肌细胞在缺血再灌注损伤过程中的损伤状况,为研究相关的抗氧自由基新药提供适当的细胞模型。
1 材料与方法1 1 材 料1 1 1 细胞培养材料 Trypsin !、Dulbeccos ∀Minimum Essential Medium (DMEM )、Fatal Bovine Serum(Gibic o BRL),SABC 免疫细胞化学染色试剂盒、anti sarcomeric actin 抗体、DAB 染料(武汉博士德生物公司),细胞培养板(Corning ),MTT 、BrdU (Sigma)。
1 12 实验动物 新生(1~3d)SD 乳鼠,雌雄不限,由中山大学医学院动物中心提供。
1 2 方 法1 2 1 新生原代心肌细胞的分离、提纯和培养 从15只新生乳鼠(出生3d 内)采用无菌操作的方式取出心脏,放入4#D Hanks 缓冲液中清洗几次以除去血液。
将乳鼠心脏移至另一个无菌的平皿中,用眼科小剪刀剪成1~2mm 2大小的快状,加入0 08%的胰蛋白酶!消化液中,置37#培养箱孵化5~10min,将上层液体转至10ml 离心管中,1000r min 离心3~5min,去上清,用生长培养基重悬细胞,保存于37#CO 2培养箱。
将未消化完的心肌组织块加入消化液,重复上述步骤,直至所有心肌组织消化完毕为止。
将所得的心肌细胞转至70ml 的细胞培养瓶中,37#C O 2培养箱培养60~90min,吸取上层细胞悬液至新的培养瓶中,计数后按0 8∃105个 cm 2平板将细胞加至24孔细胞培养板,同时加入BrdU 并使其终浓度为0 1mmol L,置5%CO 2~95%O 2的培养箱37#培养,次日将细胞换液,继续培养,同时观察和记录心肌细胞的生长状况。
第24卷第6期中 国 生 物 工 程 杂 志CHINA BIOTEC HNOLOGY2004年6月1 2 2 免疫细胞化学方法对心肌细胞进行鉴定 将分离的心肌细胞按1∃105 cm2的密度接种于6孔细胞培养板,培养3d后用95%的乙醇固定,采用鼠抗兔 sacomeric ac tin antibody及SABC免疫组化染色试剂盒对心肌细胞中的特有的横纹肌肌动蛋白进行定位,对心肌细胞鉴定,同时确定心肌细胞的纯度。
1 2 3 缺血再灌注心肌细胞损伤模型的建立 将分离好的心肌细胞接种到培养板中,置5%CO2 ~95%O2的培养箱37#培养。
当细胞培养至融合状态时,加入一定量的H2O2 DMEM刺激细胞,采用H2O2活性氧代替氧自由基的形式,模拟缺血再灌注时氧自由基对心肌细胞的损伤状况,观察心肌细胞的损伤状况。
1 2 4 H2O2对心肌细胞形态学和存活率的影响 将分离的心肌细胞按5∃104 孔接种于96孔细胞培养板,培养3d后改用含有不同H2O2浓度(0 4、0 2、0 1、0 05mmol L)的DMEM无血清培养基,培养3h之后换为无血清DMEM培养基,同时在倒置显微镜下观察和记录其形态学的变化,然后加入MTT检测心肌细胞的存活率。
1 2 5 H2O2与心肌细胞凋亡 将分离的心肌细胞按3∃105 孔接种于6孔细胞培养板,培养3d后加入含有0 625、1 25、2 5、5 0mmol L的H2O2 DME M 培养液,设立正常对照组,37#继续培养3h,观察细胞形态学变化,并收集细胞,提取细胞基因组,采用1%琼脂糖凝胶电泳分离并观察其基因组的变化。
同时将培养了3d的细胞加入浓度为0 05和0 1mmol L H2O2的D ME M培养基刺激细胞,连续培养24h,采用TUNEL法检测细胞凋亡的状况,观察H2O2与凋亡的关系。
2 结 果2 1 原代SD乳鼠心肌细胞培养新生大鼠心肌细胞刚分离出来时呈圆形或椭圆形,培养了24h呈椭圆形分散生长,大部分细胞出现搏动,随着培养的时间增加,细胞细胞之间出现网状一样的细胞伪足,从而形成一簇一簇的呈同步搏动细胞团(图1)。
这种搏动现象在维持到一定的时间后,心肌细胞的博动便逐渐减慢,最终停图1 新生SD乳鼠心肌细胞体外培养1d和10d的细胞形态(∃10,∃40)Fig.1 The prim ary culture cardiomyocytes morphology of neonatal SD mouse(observed under a reverse m icroscope,magnify10tim es and40times)图2 心肌细胞免疫细胞化学鉴定图(∃40,∃200)Fig.2 Identified cardiac myocytes by immunocytochemical assay After culture3days,cardiac m yocytes were identify by its∀specific alpha sarcomeric actin The positive cells were stained yellow brown color(DAB straining,∃40,∃200)82中 国 生 物 工 程 杂 志第24卷止。
本次实验观察结果表明,在培养了10d之后,心肌细胞的搏动便开始减弱,但有相当部分细胞在培养了45d之后仍然维持缓慢的搏动状况。
2 2 心肌细胞的鉴定采用胰蛋白酶酶消化法分离SD乳鼠心肌细胞,培养3d后,根据心肌细胞中所含有的各种蛋白特性,我们将其特有的横纹肌肌动蛋白( sac omeric actin)作为检测鉴定指标,采用免疫细胞化学法对所培养的心肌细胞进行鉴定。
根据检测结果(见图2),在培养的细胞中,凡被DAB染上棕黄色的细胞均为心肌细胞,随机对5个显微镜视野中细胞总数和心肌细胞数量进行计算,采用本文所述的细胞分离、纯化和培养的方法所得的心肌细胞纯度可达到95%左右。
2 3 H2O2对心肌细胞的影响不同浓度的H2O2对心肌细胞形态学方面的影响存在显著的差异。
形态学观察表明,0 05~ 0 1mmol L的H2O2作用于心肌细胞3h之后,心肌细胞形态变化并不明显。
但当H2O2的浓度超过1mmol L时,心肌细胞的形态变化明显加剧,在倒置显微镜下已经可以观察到心肌细胞形态学方面的变化,细胞核与细胞膜均开始收缩,核内的染色体紧缩;当H2O2浓度达到5mmol L时,倒置象差显微镜观察发现,细胞体积缩小,细胞核浓缩,部分细胞核已经开始出现溶解的现象,细胞间的轮角已经变得相当模糊,细胞处于死亡状态(图3)。
图3 不同浓度H2O2对心肌细胞形态学的影响(倒置显微镜观察、拍照记录)Fig.3 The influence of cardiomyocytes m orphology(observing in reverse microscope)after exposing in different concentration hydrogen peroxide for3hoursA:normal control group(magni fy∃100);B:exposing i n1 25mmol L H2O2(magnify∃200);C:exposing i n2 5mmol L H2O2(magnify∃200);D:expos ing in5mmol L H2O2(magnify∃200)心肌细胞在含有不同浓度H2O2(0 05、0 1、0 2和0 4mmol L)的DME M培养基中培养了3 5h之后,采用MTT法检测细胞存活率。
如表1所示,心肌细胞在不同浓度的H2O2活性氧直接作用下,大量的细胞死亡。
0 1mmol L H2O2浓度直接作用3 5h,超过10%的细胞死亡;当H2O2浓度达到0 4mmol L时,接近50%的细胞死亡。
图4所示,H2O2与细胞凋亡存在浓度依赖关系。
0 625mmol L H2O2作用3h,凝胶电泳分析未见有DNA小片段,这说明细胞基因组染色体仍然83第6期林灼锋等:活性氧自由基对心肌细胞损伤效应研究保持其完整的状态,但随着H 2O 2浓度提高到1 25mmol L 时,电泳检测出现了许多DNA 小片段,这说明细胞相当部分细胞已经处在凋亡阶段;而当H 2O 2浓度达到5mmol L 时,只出现了弥散的泳带,这说明相当部分染色体DNA 已经被降解,而H 2O 2浓度达到10mmol L 时,总DNA 的量也变得更少了。
由此可见,心肌细胞在H 2O 2的作用下,细胞的凋亡与H 2O 2的浓度相关。
此外,TUNE L 的检测结果表明,0 1mmol L H 2O 2所造成的心肌细胞凋亡远远要比0 05mmol L 的H 2O 2严重得多(图5)。