毛头鬼伞多糖CCP60a对TMV外壳蛋白的影响
硒酸酯多糖的免疫调节与抗肿瘤作用
收稿日期:20052032301基金项目:甘肃省自然科学基金项目(ZR 2972068)1硒酸酯多糖的免疫调节与抗肿瘤作用张哲文1,魏虎来2,苏海翔2(11兰州大学基础医学院;21兰州大学医学实验中心,甘肃兰州 730000) 硒(Se )是人类必需的微量元素之一,多年来国内外对硒的生物学功能进行了大量研究,尤其是硒与肿瘤的关系,已成为硒生物学功能研究中最为令人关注的领域之一,并取得了重大进展[1]。
流行病学调查、动物实验和临床应用研究证实硒是许多肿瘤强有力的预防剂、抑制剂和治疗辅助剂,能够减轻化疗药物的毒副作用,增加机体对抗肿瘤药物的耐受性而不影响其抗癌活性。
近年的研究表明,与亚硒酸钠等无机硒相比,硒酸酯多糖、硒酵母、富硒麦芽等有机硒化合物具有生物活性高,硒的生物利用度高,不易蓄积,毒性极低等特点,更适合于人体生理和临床应用。
随着生命科学的发展,多糖和硒元素在生命过程中的重要作用日渐引人注目,本文重点综述一种全新的有机硒化合物硒酸酯多糖的免疫调节作用和抗肿瘤效应。
1 硒酸酯多糖的生物特性卡拉胶是从红藻中提取的天然植物胶。
分为Kappa 型(由鹿角藻中提取)和Iota 型(由麒麟菜中提取),其化学本质为硫酸酯多糖。
硒酸酯多糖又称硒化卡拉胶(Kappa 2Selenocarrageenan ,KSC ),是人工制备的卡拉胶的硒化产物。
卡拉胶是β2D 2吡喃半乳糖与3,62内醚222D 2吡喃半乳糖以C1,3键和C1,4键交替连接构成的无分支链型硫酸酯多糖。
其结构中的硫部分地被硒取代,即形成硒酸酯多糖。
此有机结构能够有效地提高硒的生物利用度和生理功能,且毒副作用比无机硒大大降低,是一种安全、有效、健康的富硒化合物[2]。
KSC 具有硒和多糖的双重功效,具有优势互补,彼此协同增效的特点,具有广泛的生理活性,兼具有机硒和多糖的诸多生理功能,已证明KSC 在体内外具有显著的抗肿瘤免疫调节作用,可抑制肿瘤细胞增殖、增强免疫功能和降低化疗药物的毒副作用等。
毛尖蘑子实体粗多糖对肿瘤生长及免疫器官的影响
----毛尖蘑子实体粗多糖对肿瘤生长及免疫器官的影响范晓艳金岳雷于洋李玉1吕冬霞1（佳木斯大学基础医学院，黑龙江佳木斯154007）〔摘要〕目的探讨毛尖蘑子实体粗多糖（MJMP ）对H22荷瘤小鼠的抗肿瘤作用以及对免疫器官的影响。
方法将不同浓度的MJMP 作用于H22荷瘤小鼠，计算胸腺指数、脾指数、抑瘤率，观察H22荷瘤小鼠免疫器官的变化及肿瘤生长情况。
结果多糖作用组与空白对照组及阴性对照组脾指数比较无统计学意义（P ＞0.05），胸腺指数有差异（P ＜0.05）。
小鼠体内实验显示MJMP 可明显抑制肿瘤生长。
结论MJMP 对小鼠免疫功能有增强的作用，对肿瘤的生长具有抑制作用。
〔关键词〕毛尖蘑子实体粗多糖；免疫器官〔中图分类号〕R730〔文献标识码〕A〔文章编号〕1005-9202（2012）24-5480-02；doi ：10.3969/j.issn.1005-9202.2012.24.051基金项目：佳木斯大学大学生科技创新项目（No ：Dz2011-010）；黑龙江省教育厅研究项目（No ：12511564）1吉林农业大学食药用菌教育部工程研究中心通讯作者：吕冬霞（1965-），女，教授，硕士生导师，主要从事肿瘤发生机制与生物学治疗研究。
第一作者：范晓艳（1979-），女，讲师，主要从事肿瘤发生机制与生物学治疗研究。
毛尖蘑属珍贵野生菌，是黑龙江省特有的食、药用真菌，其子实体营养丰富，是食品、医药、保健品行业开发利用的宝贵资源〔1〕。
真菌多糖具有增强免疫力、抗菌、抗病毒、抑制肿瘤、增强心血管功能等作用。
本研究通过提取毛尖蘑子实体粗多糖（MJMP ），检测不同浓度MJMP 作用H22荷瘤小鼠后对胸腺指数、脾指数、抑瘤率的影响，为MJMP 抗肿瘤作用及对免疫系统影响的进一步研究奠定基础。
1材料与方法1.1材料H22腹水瘤小鼠，购于哈尔滨医科大学附属肿瘤医院动物中心。
实验动物：昆明种近交系小鼠48只（合格证号：黑动字第99101001，清洁级），体重（20ʃ2.0）g ，雄性，由佳木斯大学实验动物中心提供（许可证号：SYXK 黑2006-004）。
壳寡糖对烟草花叶病毒的体外钝化作用
第24卷 第1期2008年1月 病 毒 学 报CHINESE JOU RNAL OF VIROLOGYVol.24No.1J anu ary 2008壳寡糖对烟草花叶病毒的体外钝化作用商文静1,吴云锋1,商鸿生1,赵小明1、2,杜昱光2(11西北农林科技大学 植物保护学院,陕西杨凌 712100;21中国科学院 大连化学物理研究所,辽宁大连 116023) 关键词:壳寡糖;烟草花叶病毒;钝化作用中图分类号:S43214 文献标识码:A 文章编号:100028721(2008)0120076203收稿日期:2007202215;修回日期:2007205208基金项目:教育部长江学者和创新团队发展计划(No 1200558);西北农林科技大学博士启动基金;作者简介:商文静(19722),女,辽宁大连市人,讲师,博士,主要从事植物病毒学研究。
通迅作者:商鸿生,教授、博导,主要从事植物免疫学研究。
电话:86229287092703,E 2mail:s han ghsh@1631com壳寡糖是一种由脱乙酰基几丁质经酶降解后制备的氨基葡萄糖,它具有多方面的生物活性,在调节植物的生理机能、调控植物形态发生、诱导植物抗病性、抗逆性以及抑制真菌、细菌的生长发育等方面的作用多有报道,但关于壳寡糖对植物病毒的抑制作用未见报道。
在研究利用壳寡糖防治烟草病害时,发现壳寡糖不仅可以诱导烟草产生对病毒的系统获得抗病性[123],而且还能直接钝化烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus ,T MV ),造成病毒侵染性降低。
本研究拟通过半叶枯斑法和电镜观察方法研究壳寡糖对T MV 的体外钝化作用。
供试壳寡糖100%质量分数,聚合度(DP)3~10,分子量3kD 。
由中科院大连化学物理研究所糖工程研究室张虎等报道的方法,用脱乙酰基几丁质经酶降解过膜制得。
使用前用蒸馏水配制成浓度为100~1000L g/mL 的壳寡糖溶液供试。
羊肚菌胞外多糖抗肿瘤作用的研究
羊肚菌胞外多糖抗肿瘤作用的研究陈 彦1,2，潘 见1，周丽伟3，张利平2，杨 毅1(1.合肥工业大学农产品生物化工教育部工程研究中心，安徽 合肥 230009；2.安徽大学生命科学学院，安徽省中药研究与开发重点实验室，安徽 合肥 230039；3.安徽农业大学茶与食品科技学院，安徽 合肥 230036)摘 要：目的：研究羊肚菌胞外多糖(EPM)对S 180荷瘤小鼠的抗肿瘤作用与免疫功能的影响。
方法：将昆明种小鼠接种S 180腹水瘤后随机分组，灌胃给予200、400 mg/kg 剂量的EPM ，以灌胃生理盐水和环磷酰胺为空白对照组和阳性对照组，研究EPM 对荷瘤小鼠的抑瘤率、存活期和免疫功能的影响；通过与肿瘤细胞共培养，观察EPM 对肿瘤细胞增殖的影响。
结果：EPM 能够显著提高荷瘤小鼠的脾脏指数、T-淋巴细胞百分率和巨噬细胞吞噬率；2个剂量的EPM 对肿瘤S 180的抑制率分别为49.04%和64.42%，并且可以显著延长荷瘤小鼠的存活时间；体外实验发现羊肚菌多糖EPM 具有直接杀死S 180肿瘤细胞的作用，最高抑制率为46.3%，结论：MEP 具有显著的抗肿瘤活性和增强免疫功能。
关键词：羊肚菌；胞外多糖；抗肿瘤；免疫功能Antitumor Activity of Extracellular Polysaccharides from Morchella esculentaCHEN Yan 1,2，PAN Jian 1，ZHOU Li-wei 3，ZHANG Li-ping 2，YANG Yi 1(1.Engineering Research Center of Bio-process, Ministry of Education, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China ；2.School of Life Science, Anhui University, Key Laboratory of Chinese Traditional Medicine Research and Development of Anhui Province, Hefei 230039, China ；3.College of Tea and Food Science Technology, Anhui Agricultural University, He fei230036, China)Abstract ：Objective: To study the antitumor effects of extracellular polysaccharides from Morchella esculenta (EPM) and the immunological function on S 180 tumor-bearing mice. Method: EPM was intragastrically given to S 180-bearing mice at the dose of 200 mg/kg and 400 mg/kg. Normal sodium and cyclophosphamide were taken as blank control and positive control respectively.The tumor weight, immunologic organ weights and life span of S 180-bearing mice were measured. S 180 tumor cells were incubated with various concentrations of EPM for 24 h, and antiproliferative activities against tumor cells were determined by MTT assay.Result: EPM significantly increases the spleen index, percent of T-lymphocyte, macrophage phagocytic index and prolongs survival time of S 180-bearing mice.The inhibiting tumor rates at the low and high does are 49.04% and 64.42% respectively. EPM can kill S 180 tumor cells directly in vitro , with the highest inhibiting rate 46.3% at the dose of 50μg/well.Conclusion: EPM has significant antitumor effects and improves immunological function.Key words ：Morchella esculenta ；extracellular polysaccharide ；antitumor ；immunological function中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2008)09-0553-04收稿日期：2008-05-28基金项目：教育部科技创新工程重大项目培育基金(7074027)；安徽省自然科学基金项目(070413143)作者简介：陈彦(1963-)，男，教授，博士，主要从事食品生物技术研究。
野生墨汁鬼伞的人工驯化与营养成分分析
野生墨汁鬼伞的人工驯化与营养成分分析墨汁鬼伞[Coprinus atramentarius(Bull.Fr.)Fr.]又名柳树钻,子实体群生,初期卵形至钟形,开伞后逐步液化成墨汁,是鬼伞属真菌中具有代表性的一种,广泛分布于欧亚地区。
其子实体可以鲜食并具有较高的医药价值。
墨汁鬼伞长期以来一直处于野生状态,其人工栽培尚未开发。
本研究以北京怀柔宝山镇野生墨汁鬼伞为试验材料,对该菌母种和原种培养条件进行了研究,并采用不同的栽培方式研究了它的人工培养条件。
同时详细阐述了该菌的菌丝体、子实体以及孢子的形态结构,并对野生子实体和人工栽培子实体进行了营养成分的测定与评价。
主要结果如下:(1)墨汁鬼伞菌丝体为无隔菌丝,菌丝间交错连接,有锁状联合。
野生子实体与人工栽培子实体在形态上基本一致,初期卵形至钟形,顶部钝圆,后期液化成墨汁。
但野生墨汁鬼伞菌盖表面和菌柄基部有浅褐色鳞片,颜色为浅褐红色。
人工栽培子实体菌盖和菌柄表面光滑,颜色污白色。
墨汁鬼伞孢子呈椭圆形,有典型的脐点,颜色深褐色,内含物丰富。
孢子间的大小差别不大,基本一致。
(2)墨汁鬼伞菌丝生长的最佳碳源是葡萄糖+玉米淀粉;最佳氮源是蛋白胨;以PDA为基础附加玉米粉培养基上,pH5～10范围内均能生长,最适pH值为9;菌丝体生长温度范围为13～29℃,适宜温度为21～25℃,25℃生长最快,是一种喜碱性、中低温型的食用菌。
墨汁鬼伞最佳母种培养基是PDA+玉米粉50g。
最佳原种配方为(棉籽壳70%,麸皮18%,玉米粉5%,石膏1%,石灰3%,锯末3%)和(粗木屑37%,棉籽壳33%,麸皮18%,玉米粉5%,石膏1%,石灰3%,锯末3%)。
这两个配方均可作为扩大栽培配方。
棉籽壳和粗木屑是墨汁鬼伞扩大化栽培的优选主料。
培养基以稍偏碱性为好。
(3)墨汁鬼伞栽培时需要覆土,驯化栽培结果表明,墨汁鬼伞以菌棒立栽覆土效果最好,覆土后45～55天现菇蕾,现蕾后10天可采收。
第一潮出菇生物学效率可达40%左右,条件适宜可出3～4潮菇。
土壤处理对毛头鬼伞出菇的影响
土壤处理对毛头鬼伞出菇的影响摘要：在实验室中采用不同的覆土及喷施水处理，研究覆土中诱导毛头鬼伞（Coprinus comatus）出菇的因素。
结果表明，覆原土组的出菇率为100%，且出菇个数多，菌盖直径1.7～3.0 cm；覆无菌土组与不覆土组，仅浇灌原土悬液的有少量菇蕾形成，且菌盖直径小，最大直径只有1.5 cm，其它处理均未形成菇蕾。
证明原土中的微生物是诱导毛头鬼伞子实体形成的必要因素。
关键词：鸡腿菇；覆土；子实体毛头鬼伞（Coprinus comatus），又称鸡腿菇、毛鬼伞、鸡腿蘑、刺蘑菇等，是一种食药兼用的食用菌，其子实体肥厚，菌肉嫩滑，味道鲜美，富含蛋白、脂肪、糖、粗纤维营养物质［1］。
近年来，毛头鬼伞的抗氧化功能［2-6］及其它降血糖、降血脂、增强免疫力、抗癌和抗菌等生物活性 ［7,8］也逐渐成为研究热点。
毛头鬼伞在人工栽培中需要覆土才能出菇，之前有很多针对双孢蘑菇覆土出菇机理的研究，一般认为是土壤中微生物在出菇过程中起了决定性作用。
杜巍等［9］的研究结果显示毛头鬼伞的子实体形成与覆土中的一些革兰氏阳性菌相关。
鉴于这方面的资料较少，笔者采用实验室内出菇的方法，就不同土壤处理对毛头鬼伞出菇影响进行探索。
1 材料与方法1.1供试菌种毛头鬼伞（C. comatus）C5菌种保藏于河南科技学院应用微生物实验室。
1.2培养基及配方原种培养料：麦粒98%,石膏粉1.3%,碳酸钙0.7%。
栽培培养料：棉籽壳98%，蔗糖1%，石膏粉1%，含水量约65%。
1.3原种和栽培种制备原种：洗净后麦粒浸泡10 h后煮透，晾干表面水分，按配方添加其它成分拌匀，装入500 mL菌种瓶中，121 ℃灭菌2 h，冷却后接入活化的母种，25 ℃，黑暗培养至菌丝长满（约25 d）。
栽培种：按照配方称取各成分，加水混匀，装入17 cm×33 cm×0.06 cm的聚丙烯袋中，121 ℃ 灭菌2 h，冷却后接入原种，25 ℃，黑暗培养至菌丝长满（约30 d）。
TMV重组外壳蛋白Sc1754CP的原核表达和多克隆抗体制备
上海大学学报( 自然科学版)第14卷第3期2008年6月Vo l.14 No. 3JOURNAL O F SHAN G HA I U N I V E R S I TY (NA T URAL SC I ENCE)J u n. 2008 文章编号: 100722861 ( 2008 )03 20323205T M V重组外壳蛋白S c1754CP的原核表达和多克隆抗体制备李蓉,宋任涛,许政, 李平(上海大学生命科学学院,上海200444)摘要: 烟草花叶病毒( tobacco mo s a i c viru s, T MV )重组外壳蛋白( coa t p r o t e i n, CP) S c1754CP是一种能够激发敏感烟草产生过敏性反应( hy p e r sen s itive reac t i o n, HR )的蛋白, 但是这种蛋白无法通过植物病毒的大量扩增获得. 为了获得足够量的上述蛋白, 并对这种蛋白在植物中激发的HR 反应进行深入研究, 作者在大肠杆菌中大量表达S c1754CP蛋白,并且获得了S c1754CP高度专一性的多克隆抗体. 上述研究为进一步深入研究S c1754CP及其激发的新的过敏性反应机制奠定了基础.关键词: S c1754CP;原核表达;多克隆抗体中图分类号: Q 785 文献标识码: AExpre s s i on of Sc1754C P an d Prepa r a t i on of An t i2Sc1754C P An t i bodyL I Rong, S ON G R e n2tao, XU Zheng2ka i, L I P i ng( Schoo l of L ife S c i en ce s, S han g ha i U n i ve r sity, S han g ha i 200444 , Ch i na)A b s tra c t: The recom b i nan t coa t p r o t e i n of T MV Sc1754 can i nduce hyp e r sen s iti ve reac t i o n i n su s cep t i b l et obacco. How eve r th is p r o te i n ha rd l y is accum u l a ted i n the i nocu l a ted p l an ts. I n o rde r t o c l a ri f y t he r o l e of Sc1754CP i n th i s hyp e r sen s iti ve reac t i o n, we ove r2ex p re s sed Sc1754CP i n E. co l i.Po l yc l o na l A n t i2 Sc1754CP rabb it po l yc l o na l an ti body ha s been succe ssfu ll y p rep a red. The Sc1754CP p r o te i n and t he an ti body aga i n st Sc1754CP can he l p u s fu rthe r study th is unknown i ncomp a ti b l e reac ti o n be t w een p a t hogen and ho s t.Key word s: Sc1754CP; p r oka ryo t i c ex p re s si o n; po l yc l o na l an t i body当植物抗性基因的编码产物和病原物无毒基因的编码产物直接或间接发生互作时,会引发寄主植物局部受感染细胞的快速死亡,出现枯斑并诱导防卫相关基因的表达, 这个现象被称为过敏性反应( hyp e r sen s iti ve reac t i o n, HR ) [ 1 22 ] . 植物和病原体的这种非亲和性互作对于植物抗病性有着重要作用.不仅如此,该类研究对于植物病理学研究和经济作物改良也有重要的影响.烟草花叶病毒( t obacco mo sa i c viru s, T MV ) 是一种杆状的正链RNA病毒[ 3 25 ] . 野生型T MV 可以系统地感染敏感性烟草N. tabacum cv. Sam sun nn 并产生典型的花叶症状[ 6 ] . 但在前期实验中, 我们发现一类重组T MV (在外壳蛋白( coa t p r o t e i n, CP)末端融合了含跨膜结构的外源小肽)能在敏感性烟草收稿日期: 2007 204 219 基金项目:上海市科委重点基础研究项目(06JC14030 ) ;上海市教委一般项目(06A Z052 )通信作者:李平(1976 ～) ,女,副研究员,博士,研究方向为分子植物病理学. E2m a il: lp9835 @ staf f.shu. edu. cn据表明枯斑的形成与这些重组CP 蛋白密切相关(数据未发表) . 这类外源重组CP 可能在蛋白水平上,通过病毒的运输与植物体内特定空间内的“受体”相结合,启动植物内源的细胞调亡途径,进而引起了HR 反应[ 8 29 ] .T MV Sc1754 就属于这样一类重组病毒,它是在野生型T MV 的CP蛋白第152位和153 位氨基酸之2. 1 T M VSc1754 C P全长c D NA 的扩增根据T MV Sc1754 CP cDNA 的读码框设计引物,上游引物:5 ′2GCG AA T T C A TGT2CTT A C A GT A TC A CT AC23 ′;下游引物:5 ′2TTCTCG A G C AA GTTGC A GG A CC A G A GGT23 ′.以质粒p T MV Sc1754 为模板,通过PCR 的方法扩增Sc1754CP 全长cDNA. PCR 反应条件: 94 ℃, 30 s; 55 ℃, 30 s; 72 ℃, 24 s共30个循环.2. 2 重组质粒pET2Sc1754C P的构建将PCR 产物和p ET232 a ( + )质粒分别用E co R I 和X ho I双酶切, 用T4DNA连接酶进行连接, 转化E. co l i BL 21 (D E3 )受体菌.2. 3 pET2Sc1754C P的诱导表达挑取阳性单菌落,接种于3 mL LB 液体培养基中(含100 μg /mL 氨卞青霉素) , 37 ℃振荡培养过夜, 以1 ∶40 比例转接于50 mL LB 液体培养基中含100 μg /mL 氨卞青霉素剧烈振荡,培养至菌体密度OD600为0. 6 时, 加终浓度1 mmo l /L IPTG 37 ℃诱导表达3 h, 4 500 r /m i n离心10 m i n,收集菌体. 2. 4 重组蛋白Sc1754C P的分离菌体沉淀用10 倍体积缓冲液I ( 20 mmo l /m L Tris, 500 mmo l /mL N a C l, 0. 1 %Trit on X2100 , 1 mmo l /mL ED T A ,pH 8. 0 ) 重悬, 冰浴下超声破碎、离心.2. 5 W e s tern b l o t参见文献[ 6 ].2. 6 免疫家兔将研磨的含目的蛋白的凝胶和弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂以2 ∶1 ∶1的比例混合,皮下注射,免疫2 ～3 kg的成年新西兰家兔. 每头家兔注射1 m g 左右的目的蛋白. 隔3周后加强免疫家兔,将研磨的含目的蛋白的凝胶和弗氏完全佐剂以1 ∶1 的比例混合,皮下注射. 然后每隔1 周加强免疫1 次,至少加强免疫3次.2. 7 E L I SA 测定Sc1754C P抗体效价将诱导表达Sc1754CP 的菌体裂解物用包被稀释液稀释到工作浓度, 加入96 孔酶标板, 每孔100 μL , 4 ℃, 过夜. 待抗原包被后, 去除上清. 每孔加300 μL PB ST,洗板. 每孔加入300 μL 封闭液, 37 ℃反应2 h. 将待测定兔抗血清( 100 μL ) 梯度稀释加间, 插入一段编码18 个氨基酸( FFFV SY I II SFLVVVNM Y)的外源序列,并在插入序列的末尾加入终止密码子T A G. 由于该重组病毒不能系统感染敏感性烟草N. tabacum cv. Sam sun nn, 重组病毒T MV S c1754在感染组织中的含量很低,我们很难得到足量的重组步研究.CP 蛋白Sc1754CP 做进一因此,我们针对重组病毒T MV S c1754 的CP 序列设计了一对特异性引物,采用PCR 技术,从重组病毒T MV Sc1754 的表达质粒p T MV Sc1754 中扩增出重组CP蛋白Sc1754CP的cDNA ,全长513 bp. 构建了p ET2Sc1754 CP 原核表达载体,并以表达的融合蛋白为抗原制备了Sc1754CP 的多克隆抗体. 这些结果为进一步研究重组病毒T MV Sc1754 CP蛋白亚细胞定位、功能分析及其在植物互作中的作用奠定了基础.1 实验材料1. 1 菌株大肠杆菌菌株保存.1. 2 质粒co l i BL21 ( D E3 )为本实验室E.p T MV Sc1754 , p ET232 a( + )为本实验室保存. 1. 3 酶和试剂限制性内切酶E co R I和X ho I购自Toyobo 公司, T4 DNA连接酶购自Taka ra大连生物技术公司, Taq酶购自T I A N GEN 公司, 丙烯酰胺、双叉丙烯酰胺均购自FLU T A 公司,溶菌酶、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、I PTG 购自鼎国公司; PVD F膜购自M illi p o re公司, X 光片购自富士公司; Sup e r Si gna lW e st D u ra免疫杂交试剂盒购自P IERCE 公司; BC A 蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术研究所; 其他药品为国产分析纯试剂,购自国药集团上海分公司.第3期李蓉,等: T MV 重组外壳蛋白S c1754CP的原核表达和多克隆抗体制备325 入包被板, 37 ℃反应2 h,洗板. 每孔加入1 ∶10 000稀释的羊抗兔I gG /HR P( 200μL ) , 37 ℃孵育1. 5 h.洗涤后每孔加入200 μL 邻苯二胺(O P D ) 底物, 37℃避光反应15～20 m i n. 加50μL 2 mo l /L H2 S O4 终止反应,酶标仪( 490 mm )比色测定. 以正常的兔血清为阴性对照, 同时设试剂空白对照.2. 8 丙酮粉的制备和屏蔽将大肠杆菌菌株E. c oli BL21 ( D E3 ) 菌体沉淀用预冷的4倍体积的丙酮重悬,离心,干燥,制成丙酮粉. 将兔血清用10 倍体积的生理盐水稀释. 按2 % (W /V )的比例加入丙酮粉,温和混匀,冰上放置过夜,离心,将上清移入新管.酶切,定向插入到p ET232 a( + ) 载体中构建表达载体p ET2Sc1754CP (图1 ( b) 、( c) ) ,阳性克隆经测序验证正确. 转化入宿主菌BL21 (D E3 )中,构建表达菌株BL S c1754CP.3. 2 Sc1754C P的诱导表达和鉴定表达菌株BL Sc1754CP经I PTG诱导表达后,用超声波破碎,离心后上清和沉淀进行S D S2P A GE 电泳(图2 ( a ) ) . 可以看到经过I PTG诱导之后, 总菌体蛋白中能诱导大小38 kD a 左右的蛋白. p ET232 a表达的重组蛋白前面还融合有一个约20 k D a 的标签序列,再加上T MV Sc1754CP编码的170 个氨基酸(约18 kD a)总共约38 k D a. 这和表达得到的蛋白大小基本一致.3 实验结果3. 1 Sc1754C P的表达质粒的构建利用Sc1754C序列特异性引物,从重组病毒质粒p T MV S c1754 上扩增出重组CP 全长cDNA , 513bp (图1 ( a) ) . 回收的PCR 产物用E co R I和X h o I双1. 蛋白质低分子量m a r ke r2. 未加I PTG的总菌体裂解物3. 加I PTG诱导的总菌体裂解物4 27. 加I PTG诱导的菌体裂解物中的上清8 211. 加I PTG诱导的菌体裂解物中的沉淀1. DN A m ar ker2. T MV S c1754CP( a) Sc1754CP c DN A 片段P CR 扩增电泳图( a) BL Sc1754CP诱导表达S D S2PA G E电泳图1. 蛋白质低分子量m a r ke r2. 未加I PTG的总菌体裂解物( 37 °C诱导)3. 加I PTG诱导的总菌体裂解物(37 °C诱导)4. 加I PTG诱导的菌体裂解中的上清( 37 °C诱导)5. 加I PTG诱导的菌体裂解中的沉淀( 37 °C诱导)6. 未加I PTG的总菌体裂解物( 16 °C诱导)7. 加I PTG诱导的总菌体裂解( 16 °C诱导)8. 加I PTG诱导的菌体裂解中的上清( 16 °C诱导)9. 加I PTG诱导的菌体裂解中的沉淀( 16 °C诱导)1. DN A m a r ke r2. 重组质粒p ET2Sc1754CP3. 重组质粒p ET2Sc1754CPE co R I和X ho I双酶切电泳图( b) 重组质粒p ET2Sc1754CP酶切鉴定电泳图( b) BL S c1754CP诱导表达条件优化S D S2PA G E电泳图图 2 B L Sc1754C P SD S2PA G E电泳图F ig. 2 SD S2PAG E ana ly s i s BL Sc1754C P( c) p ET2Sc1754CP结构图图 1 pET2Sc1754C P构建图F ig. 1 C o n s truc t i o n of pET2Sc1754C P在实验中发现经诱导后表达的T MV Sc1754CP4 讨 论是不溶性的. 为此 ,针对诱导表达条件进行了部分优 化 ,希望通过降低诱导温度和在超声波振荡处理前 加入溶菌酶能增加 Sc1754CP 的可溶性.进行条件优化后 ,菌体裂解液上清中目的蛋白 的量有少量增加 ,但并不明显 (图 2 ( b ) ) .由于 Sc1754CP 和野生型 CP 前面的 152 个氨 基酸是一致的 , 所以 T MV Sc1754CP 可以和 T MVCP 的抗体特异性结合. 为了进一步确认表达的蛋白是 否是 Sc1754CP,利用实验室现有的野生型 CP 的抗 体进行 W e s te r n 杂交 (图 3 ) . 诱导的目的条带能和T MVCP 抗体产生特异性反应. 可以肯定该位置的条 原核表达体系是一个十分简便实用的实验平 台. 在过去的实验中 ,利用的不同的载体系统已经在 大肠杆菌中表达了数百种重组蛋白. 不仅如此 ,利用原核表达的蛋白免疫动物来制备多克隆抗体是一种十分有效的方法. 由于某些重组 T MV 病毒在敏感性 烟草感染组织中能引发 HR 反应 ,很难得到该病毒 的重组 CP 蛋白. 因此 ,我们选择原核表达体系人为 表达重组 CP.带就是 Sc1754CP.1. 未加 I PTG 诱导的总菌体裂解物2. 加 I PTG 诱导的总菌体裂解物3. 加 I PTG 诱导的菌体裂解中的上清 4 27. 加 I PTG 诱导的菌体裂解中的沉淀 ( a ) BL Sc1754CP S D S 2PA G E 电泳图( a ) Sc1754CP S D S 2PA GE 电泳图1. 未加 I PTG 诱导的总菌体裂解物2. 加 I PTG 诱导的总菌体裂解物3. 加 I PTG 诱导的菌体裂解中的上清 4 27. 加 I PTG 诱导的菌体裂解中的沉淀 ( b ) Sc1754CP W e s ter n 检测电泳图 (W T CP 抗体 )图 3 重组蛋白 Sc1754C P 的鉴定F ig . 3I den t i f i ca t i o n of Sc1754C P( b ) BL S c1754CP W e ste r n 检测电泳图(屏蔽前的 Sc1754CP 抗体 )3. 3 抗体特异性分析菌体总蛋白通过 S D S 2P A GE 电泳 , 分离纯化 , 免疫家兔. 以 2 m g /mL 的菌体蛋白包被抗原 , 将取 样的免疫 Sc1754CP 的兔血清作为一抗. 以倍半稀 释的方法 ,梯度稀释一抗 ,进行 EL I S A 测定. 血清样品中血清效价为 1 ∶12 800 (结果未列出 ) . 抗血清通过 BL21 (D E3 )菌体丙酮粉交叉吸附 , 对于屏蔽后的血清进行 W e s te r n 检测 (图 4 ) . 检测 发现抗血清在未经屏蔽前对于 Sc1754CP 的特异性 较差 ,杂交后的条带较多. 通过交叉吸附的方法能有 效地屏蔽兔抗血清中的其他多克隆抗体 ,屏蔽后的 血清对于 Sc1754CP 特异性较高 ,能杂交出单一的 、( c ) BL Sc1754CP W e ste r n 检测电泳图(屏蔽后的 Sc1754CP 抗体 )图 4 Sc1754C P 免血清屏蔽前后特异性的检测F ig . 4 Spec i f ic it y ana l y s i s of the an t i 2sera to Sc1754C P表达菌株 BL Sc1754CP 经 IPTG 诱导表达后 ,得第3期李蓉,等: T MV 重组外壳蛋白S c1754CP的原核表达和多克隆抗体制备327到的融合蛋白与预期的大小基本一致. 我们还对诱导条件进行了优化. 在先前的实验中,通过降低诱导温度的方法使得表达野生型CP 蛋白菌体的上清裂解液中野生型CP的含量大大增加. 但是,同样的方法用在表达T MV S c1754CP蛋白菌体上,效果却十分有限. 我们推断表达的重组CP 可能是不溶性的蛋P l an t B i o l, 2002 , 5 ( 325) : 3252331.H E A T H M C. H y p e r sen s itive re s pon s e2re l a t ed dea t h[ J ]. P l an t M o l ecu l a r B i o l o g y, 2000 , 44: 321 2334.K NA P P E, L E WANDOW SK I D L. Tobacco mo s a icviru s, no t ju s t a single componen t viru s any mo r e [ J ].Mo l ecu l a r P l an t Pa t h o l og y, 2001, 2 ( 3): 117 2123.J I A N G L B , L I Q L , L I M M , e t a l. A mod i fied T MV 2ba sed vec to r fac ilita t e s the exp re ssion of long e r fo re i g nep itop e s in tobacco [ J ]. V a cc i ne, 2006, 24: 1092115.F I LG U E I RA D M P, Z AMOR ANO P I, DOM I N G U EZ MG, e t a l.Bovine hep e s viru s g D p r o t e in p r oduced i np lan ts u sing a recom b inan t tobacco mo sa ic viru s ( T MV)vec t o r po s se s se s au t hen t ic an t ig en i c i ty [ J ]. V a cc i ne,2003 , 21: 420124209.WU L G, J I A N G L B , ZHOU Z A , e t a l. Exp re ssion offoo t2and2mou th d isea se viru s ep itop e s in tobacco by atobacco mo s a i c viru s2ba s ed vec t o r[ J ]. V a cc i ne, 2003,21: 4390 24398.L I Q L , L IM M , J I A N G L B , e t a l. T MV recom b inan t sencod in g fu sed fo re ig n tran s m em b rane d om a in s to the CPsubun it cau sed loca l nec r o tic re s pon se on su scep tib l etobacco [ J ]. V ir o l o g y, 2006 , 348: 2532259.EHR E N FELD N , C ANON P, S TAN G E C, e t a l.Tobamoviru s coa t p r o te in CPCg induce s an HR 2li k ere s pon se in sen sitive tobacco p lan ts [ J ]. Mo lecu le s andCe l ls, 2005, 19 ( 3) : 4182427.TAR A POR E W ALA Z F, CULV ER J N. Struc tu ra l andfunc ti o na l con se rva tion of the tobamoviru s coa t p r o t e i ne l ic i to r ac t ive site [ J ]. M P M I, 1997 , 10 ( 5): 597 2604.(编辑:刘志强) [ 2 ][ 3 ][ 4 ]白,而且这种不溶性可能和构有一定的关系.Sc1754CP 中的跨膜结利用实验室现有的野生型CP 的抗体进行[ 5 ] W e s te r n杂交,诱导的目的条带都能和T MVCP 产生特异性反应. 可以肯定该位置的条带就是重组质粒诱导产生的. 菌体总蛋白通过S D S2P A GE 电泳分离纯化,免疫家兔. 血清效价为1 ∶12 800 ,抗血清通过BL21 (D E3 )菌体丙酮粉交叉吸附,屏蔽后的血清对于Sc1754CP特异性较高,能杂交出单一的、特异性的条带.在本实验中得到Sc1754CP蛋白和抗Sc1754CP 的血清,对于我们进一步的研究有很大的帮助. 我们能够通过Sc1754CP的蛋白构象分析来判断其受抗性基因识别的特异性位点; 通过抗Sc1754CP 血清对感染组织进行原位杂交来检测体内Sc1754CP 的积累部位,从而推测它可能的作用途径;通过免疫共沉淀技术来鉴定烟草体内和Sc1754CP 特异性作用的宿主蛋白. 这一切都可以使我们更好地理解和分析这个HR 过程. [ 6 ] [ 7 ] [ 8 ] [ 9 ]参考文献:[ 1 ] K UN KEL B N , BROO KS D M. C r o s s ta l k be t ween sig na l in g p a t hway s in p a t hog en defen s e [ J ]. Cu r r Op in(上接第318页)[ 12 ] DA S Y C, S AR G AND S M. Fo r ced v ib r a t ion s of la t e r a l ly l o ad p ile s [ J ]. In t J S o l id Struc t, 1999, 36:497524989.刘鑫,杨骁. 悬浮桩水平振动的动力刚度[ J ]. 岩土力学, 2008, 29 ( 4) : 1021 21026.HAR D I N B O , DRN E V I CH V P. S hea r mo du l u s and damp ing in s o i ls [ J ]. J S o i lM e ch Fo und D iv, 1972 , 98 ( 7): 667 2692.[ 13 ] (编辑:陈海清) [ 14 ]。
一株野生毛头鬼伞的分离鉴定及其生物学特性研究
中图分类号： ￥ ６ ４ ６ ． １ ＋ ５ 文献标识码 ： Ａ 文 章编 号 ： １ ０ ０ ２ — ２ ４ ８ １ （ ２ ０ １ ７ ） ０ １ — ０ ０ ２ ４ — ０ ７
Ｓ ｔ ｕ ｄ ｙ ｏ ｎ Ｉ ｓ ｏ ｌ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ， Ｉ ｄ ｅ ｎ ｔ ｉ ｉｃ ｆ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｎ ｄ Ｂｉ ｏ ｌ ｏ ｇ ｉ ｃ ａ ｌ Ｃｈ ａ ｒ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｓ ｔ ｉ ｃ ｓ
。 通过
对Ｚ Ｍ Ｍ一 ３菌株生物学特性 的研究发现 ， 其最适生长温度为 ２ ５℃， 最适碳源为 蔗糖 ， 最适氮源为酵母粉 ， 最适碳氮 比为（ １ ０： １ ） 一（ ２ ０： １ ） ， 最适 ｐ Ｈ值为 ７～８ 。采用棉 籽壳 、 木屑 、 稻草 、 玉米 芯、 玉米秸 秆等栽培料对该野生菌株进
行 了出菇栽培试验 。 结果表明 ， 该菌株在稻草培养料 上生 长最快 ， 在稻草和玉米秸秆上发满菌覆土即可出菇 ， 其生
物转化率分别为 １ １ ． １ ８ ％和 ２ ２ ． ２ ８ ％， 所以， 玉米秸秆栽培料是 Ｚ Ｍ Ｍ一 ３菌株的最适栽培料 。 关键 词 ： 毛头鬼伞 ； 生物学特性 ； 鉴定
分离的方法获得该 野生菌株 ， 并 且提取其基 因组 Ｄ Ｎ Ａ， 以其 为模板扩增 内转 录间隔 区（ Ｉ ｎ ｔ ｅ ｒ ｎ ｌ ａ ｔ ｒ ａ ｎ ｓ ｒ ｉ ｂ 。 ｄ ｐ 。 ，
银耳多糖对人软骨细胞的增殖效应和抗炎作用
谭敏颖，戴川景，卢学敏，等. 银耳多糖对人软骨细胞的增殖效应和抗炎作用[J]. 食品工业科技，2024，45（1）：1−8. doi:10.13386/j.issn1002-0306.2023060077TAN Minying, DAI Chuanjing, LU Xuemin, et al. Proliferation and Anti-inflammatory Effects of Tremella fuciformis Polysaccharide on Human Chondrocytes[J]. Science and Technology of Food Industry, 2024, 45(1): 1−8. (in Chinese with English abstract). doi:10.13386/j.issn1002-0306.2023060077· 特邀主编专栏—食品中天然产物提取分离、结构表征和生物活性（客座主编：杨栩、彭鑫） ·银耳多糖对人软骨细胞的增殖效应和抗炎作用谭敏颖1,2，戴川景1，卢学敏1，王毅刚1，关 磊2，程 勇2, *（1.浙江理工大学生命科学与医药学院，浙江杭州 310018；2.浙江天草生物科技股份有限公司，浙江湖州 313399）摘 要：目的：骨关节炎（Osteoarthritis ，OA ）是一种常见的慢性关节性疾病，本研究旨在探究银耳多糖对骨关节炎细胞模型人软骨细胞T/C-28a2的增殖效应和抗炎作用。
方法：通过MTT （3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide ）和结晶紫染色实验检测银耳多糖对T/C-28a2细胞增殖活力和细胞毒性的影响；用脂多糖（Lipopolysaccharide ，LPS ）处理T/C-28a2细胞建立骨炎症模型，酶联免疫吸附测定（Enzyme-linked immunosorbent assay ，ELISA ）检测药物处理后细胞白介素-6（Interleukin-6，IL-6）的表达；利用蛋白免疫印迹（Western blot ）检测药物处理后相关骨保护因子和炎症因子的表达；通过ROS 活性氧释放实验检测药物对细胞的氧化应激水平和抗炎症反应。
菌渣、酒糟培养料对毛头鬼伞生长及产量的影响
菌渣、酒糟培养料对毛头鬼伞生长及产量的影响以废弃香菇、黑木耳菌渣及酒糟为主料栽培毛头鬼伞（Coprinus comatus），菌丝能正常生长发育，但菌丝生长速度、满袋时间、在覆土面长势等表现弱于常规栽培料，且各配方的子实体生长性状表现稍弱于常规培养料。
以酒糟为主料栽培的子实体生长性状优于以香菇和黑木耳菌渣为主料的处理，以酒糟和黑木耳菌渣为主料栽培得到的子实体产量与常规培养料上的差异不显著，以香菇菌渣为主料生产得到的子实体性状及产量表现最差。
结果表明：以酒糟、黑木耳菌渣栽培毛头鬼伞是可行的，能充分利用资源，减少环境污染。
毛头鬼伞（鸡腿菇）；菌渣；酒糟；生长；产量贵州省印江县食用菌的栽培面积逐年扩大，其中以规模化栽培香菇（Lentinula edodes）、黑木耳（Auricularia auricula-judae）为主，而采收结束后的大量废弃食用菌菌渣被堆置致发霉腐烂。
贵州青酒厂产生的大量白酒糟除部分用作饲料外，大部分还没有找到合适的利用途径，长期堆置滋生大量的蚊蝇，这不仅造成资源浪费且污染环境。
毛头鬼伞（Coprinus comatus）又名鸡腿菇，其菌丝分解木质素、纤维素能力极强，抗逆性较好[1，2]。
笔者用废弃菌渣、酒糟作为替代栽培主料生产毛头鬼伞，考察毛头鬼伞的生长状况，以期能将该地区废弃菌渣、酒糟变废为宝、循环利用。
1材料与方法1.1菌株川鸡腿菇1号（C. comatus）由四川省食用菌菌种场提供。
1.2培养料以常规配方（80%玉米芯，10%麦麸，6%玉米粉，2%石灰，1%石膏，1%过磷酸钙）为对照。
配方1：废弃40%香菇菌渣，40%玉米芯；配方2：废弃40%黑木耳菌渣，40%玉米芯；配方3：40%酒糟，40%玉米芯，各配方均添加10%麦麸，6%玉米粉，2%石灰，1%石膏，1%过磷酸钙。
香菇和黑木耳废弃菌棒来自惠水县高镇食用菌栽培基地，采收结束后的香菇和黑木耳废弃菌棒晒干后粉碎备用。
香菇菌棒原始配方为：78%杂木屑、20%麦麸、1%红糖、1%石膏。
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植物资源与环境学报２００８，ｌ７（３）：６３—６６ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ
毛头鬼伞多糖ＣＣＰ６０ａ对ＴＭＶ外壳蛋白的影响 吴艳兵 ｒ，谢荔岩 ，谢联辉 ，林奇英 ’① （１．福建农林大学植物病毒研究所生物农药与化学生物学教育部重点实验室，福建福州３５０００２； ２．河南科技学院资源与环境学院，河南新乡４５３００３）
摘要：对毛头鬼伞（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｃｏｍａｔｕｓ Ｍｕｅｌ１．ｅｘ Ｆｒ．）子实体中的多糖ＣＣＰ６０ａ进行了提取分离及检测，研究了不同温 度条件下ＣＣＰ６０ａ对烟草花叶病毒（ＴＭＶ）外壳蛋白体外聚合的影响，并用Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ法研究了ＣＣＰ６０ａ对 ＴＭＶ外壳蛋白表达的影响。结果表明，经沸水浸提、乙醇分级沉淀、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ一２５离子交换柱层析、 Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ一６Ｂ凝胶柱层析和抗ＴＭＶ活性跟踪检测可得到均一的多糖ＣＣＰ６０ａ。随温度的提高，ＣＣＰ６０ａ处理组在 ３２０ ｎｍ处的吸光度值增加幅度明显小于对照组，表明ＣＣＰ６０ａ对ＴＭＶ外壳蛋白体外聚合有一定的抑制作用。 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测结果显示，ＣＣＰ６０ａ可以使ＴＭＶ外壳蛋白的表达明显降低。
关键词：毛头鬼伞；多糖ＣＣＰ６０ａ；烟草花叶病毒（ＴＭＶ）；外壳蛋白 中图分类号：Ｑ５３９；￥４３２．４１ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００４—０９７８（２００８）０３—００６３—０４
Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ＣＣＰ６０ａ ｆｒｏｍ Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｃｏｍａｔｕｓ ｏｎ ＴＭＶ ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ＷＵ Ｙａｎ．ｂｉｎｇ 一， ＸＩＥ Ｌｉ．ｙａｎ ，ＸＩＥ Ｌｉａｎ—ｈｕｉ ，ＬＩＮ Ｑｉ—ｙｉｎｇ ＇①（１．Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｐｅｓｔｉｃｉｄｅ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ
Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏ．ｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｆｕｊｉａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｆｕｚｈｏｕ
３５０００２，Ｃｈｉｎａ；２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，Ｈｅ’ｎａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｘｉｎｘｉａｎｇ ４５３００３，Ｃｈｉｎａ）， Ｐｌａｎｔ Ｒｅｓｏｕｒ．＆Ｅｎｖｉｒｏｎ．２００８，１７（３）：６３—６６
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ＣＣＰ６０ａ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ａｎｄ ｓｅｐａｒａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｆｒｕｉｔｉｎｇ ｂｏｄｉｅｓ ｏｆ Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｃｏｍａｔｕｓ Ｍｕｅｌ１．ｅｘ Ｆｒ．Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＣＣＰ６０ａ ｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＴＭＶ ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｎ ｖｉｔｒｏ ｗａｓ ｓｔｕｄｉｅｄ ｕｎｄｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ．ａｎｄ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＣＣＰ６０ａ ｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＴＭＶ ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ａｌｓｏ ｔｅｓｔｅｄ ｂｖ Ｗｅｓｔｅｍ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ＣＣＰ６０ａ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｂｏｉｌｉｎｇ ｗａｔｅｒ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ， ｅｔｈａｎｏｌ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ，ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ．２５ ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ－６Ｂ ｇｅｌ ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ａｎｄ ａｎｔｉ—ＴＭＶ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｅｘｔｅｎｔ ｏｆ ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ ｖａｌｕｅ（３２０ ｎｍ）０ｆ ＣＣＰ６０ａ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｇｒｏｕｐ ｗａｓ ｓｍａｌｌｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｗｉｔｈ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ．ｔｈｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ＣＣＰ６０ａ ｈａｄ ａｎ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ０ｆ ＴＭＶ ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｎ ｖｉｔｒｏ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｔｅｓｔ ａｌｓｏ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ＣＣＰ６０ａ ｃｏｕｌｄ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｒｅｄｕｃｅｄ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＴＭＶ ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｃｏｍａｔｕｓ Ｍｕｅｌ１．ｅｘ Ｆｒ．；ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ＣＣＰ６０ａ；ｔｏｂａｃｃｏ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ（ＴＭＶ）； ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ
毛头鬼伞（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｃｏｍａｔｕｓ Ｍｕｅｌ１．ｅｘ Ｆｒ．）又名 鸡腿蘑，是一种营养丰富、肉质细嫩的名贵药兼食用 真菌。毛头鬼伞性平味甘，有益脾胃、清神宁智、增 食欲及治疗痔疮等功效¨ ，还具有一定的降血糖、 降血脂、提高免疫活性和抗肿瘤等生物学功能 ］。 目前，有关毛头鬼伞对植物病毒抑制作用的研究报 道较少 Ｊ。作者以毛头鬼伞子实体为实验材料， 经沸水浸提、乙醇分级沉淀、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ一２５ 离子交换柱层析、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ一６Ｂ凝胶柱层析和抗 ＴＭＶ活性跟踪检测得到均一的多糖ＣＣＰ６０ａ，并对 其抗ＴＭＶ外壳蛋白体外聚合和对ＴＭＶ外壳蛋白表 达的影响进行了研究，以期为食用真菌多糖在防治
收稿日期：２００７—１１—２３ 基金项目：福建省教育厅专项科学基金项目（Ｋ０４０３７）；福建省科 学技术厅重点资助项目（９９一ｚ一１９３）；河南科技学院 高层次人才资助项目（２００７００２１） 作者简介：吴艳兵（１９８Ｏ一），男，山东东营人，博士，讲师，主要从 事生物农药的科研和教学工作。 通讯作者Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｉｎｇｙ９０８＠ｙａｈｏｏ．ＣＯＢ．ａｎ
重庆维普 http://www.cqvip.com植物资源与环境学报 第１７卷 植物病毒病害中的应用及研制新型的多糖类抗植物 病毒制剂提供一定的理论依据。
１ 材料和方法 １．１材料 供试的毛头鬼伞新鲜子实体购于市场；烟草花 叶病毒（ＴＭＶ）和心叶烟（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｇｌｕｔｉｎｏｓａ Ｌ．）由 福建农林大学植物病毒研究所提供；侵染的寄主为 普通烟草（Ⅳ．ｔａｂａｃｕｍ Ｌ．）Ｋ３２６。 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测用ＴＭＶ抗血清（一抗）由 福建农林大学植物病毒研究所提供；碱性磷酸标记 羊抗兔ＩｇＧ（二抗）为Ｓｉｇｍａ公司产品。 １．２方法 １．２．１毛头鬼伞多糖ＣＣＰ６０ａ的制备将新鲜的 毛头鬼伞子实体清洗干净后用匀浆机破碎，用沸水 重复提取３次，合并提取液，浓缩，加无水乙醇沉淀， 析出的沉淀冷冻干燥，获得粗多糖。将粗多糖用水 溶解后采用Ｓｅｖａｇ法 叫［提取液为氯仿一正丁醇混 合液（体积比４：１）］剧烈振荡２０ ｍｉｎ，离心除去中间 层沉淀，重复此过程若干次，直至上清液中无蛋白质 为止，浓缩，冷冻干燥后获得多糖ＣＣＰ。将多糖ＣＣＰ 用水重新溶解后经体积分数４０％～８０％的乙醇分 级沉淀和抗ＴＭＶ活性跟踪检测得到毛头鬼伞多糖 ＣＣＰ６０（即用体积分数６０％乙醇沉淀后得到的多糖 组分）。 将获得的ＣＣＰ６０上ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ一２５离 子交换柱（１．５ ｅｍ×７０．０ ｃｍ）进行层析，分别用０、 ０．０５、０．１０、０．３０和０．５０ ｍｏｌ・Ｌ ＮａＣ１溶液进行梯 度分段洗脱，流速１０ ｍＬ・ｈ～，以每管５ ｍＬ分别收 集洗脱液，经硫酸一苯酚法 和抗ＴＭＶ活性跟踪 检测所分离的多糖，再经Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ一６Ｂ凝胶柱层析 进行鉴定。 抗ＴＭＶ活性跟踪检测采用枯斑半叶法。在 ＴＭＶ的枯斑寄主心叶烟的一半叶片上摩擦接种 ＴＭＶ与多糖等体积混合溶液，另一半叶片上摩擦接 种ＴＭＶ与清水等体积混合溶液，３ ｄ后统计枯斑数， 计算枯斑抑制率。 １．２．２ ＴＭＶ外壳蛋白的制备 采用Ｆｒａｅｎｋｅｌ— Ｃｏｎｒａｔ等的醋酸法Ｈ 进行烟草花叶病毒（ＴＭＶ）外 壳蛋白的制备，具体步骤如下：向冷的ＴＭＶ溶液 （５ ｇ・Ｌ ）中加人２倍体积冷的冰醋酸溶液（体积 分数６７％），４ ｏＣ静置６０ ｍｉｎ（每隔１０ ｍｉｎ振荡１ 次），于３ ５００ ｒ・ｍｉｎ 离心２０ ｍｉｎ；取上清液，用等 体积冷水稀释后，在４℃条件下用重蒸水透析９６ ｈ （首次间隔４ ｈ换水，以后每隔８ ｈ换１次水），至提 取溶液白色浑浊后停止透析；于透析后的提取溶液 中加入３ ｍｏｌ・Ｌ 醋酸钠缓冲液（ｐＨ ４．７）３～５滴， ４℃、１０ ０００ ｒ・ｍｉｎ 离心３０ ｍｉｎ，将沉淀溶于 ０．０３３ ｍｏｌ・Ｌ 磷酸缓冲液（ＰＢＳ）中，即得ＴＭＶ外 壳蛋白溶液。于２８０ ｎｍ处用紫外分光光度计进行 光谱分析，并对提纯的ＴＭＶ外壳蛋白进行ＳＤＳ— ＰＡＧＥ电泳 和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测¨ ，以确定其 相对分子质量和纯度。 １．２．３ ＣＣＰ６０ａ对ＴＭＶ外壳蛋白体外聚合影响的 实验方法使用０．０３３ ｔｏｏｌ・Ｌ 磷酸缓冲液（４℃， ｐＨ ７．０）配制浓度为０．８ ｇ・Ｌ 的ＴＭＶ外壳蛋白溶 液，将ＣＣＰ６０ａ加入ＴＭＶ外壳蛋白溶液中，使溶液 中ＣＣＰ６０ａ的最终浓度为０．１ ｇ・Ｌ～。分别设置 １０ ｃｃ、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃和４０℃等７ 个温度处理，各处理组溶液在水浴锅中充分预热，参 照Ｌａｕｆｆｅｒ的方法¨ ，以等浓度的ＴＭＶ外壳蛋白溶 液为参照，用紫外分光光度计在３２０ ａｍ处进行不同 温度下的光谱分析。 １．２．４ ＣＣＰ６０ａ对ＴＭＶ外壳蛋白表达影响的实验 方法选取５—６叶期、株高相近的普通烟草植株， 随机分为３组，每组１５株，１组喷施０．１ ｇ・Ｌ ＣＣＰ６０ａ溶液，另外２组喷施清水，分别作为阴性对 照和阳性对照。喷施３ ｄ后，阳性对照和处理组每 株烟草分别接种等量同浓度的ＴＭＶ，阴性对照不接 种ＴＭＶ；接种１０ ｄ后，分别摘取每株烟草的心叶，同
一组心叶混合，随机称取０．２ ｇ，分别加入２ ｍＬ０．Ｏ１ ｍｏｌ・Ｌ 磷酸缓冲液（ｐＨ ７．２），研磨至匀浆后， １２ ０００ ｒ・ｍｉｎ 离心１０ ｍｉｎ，取上清液进行ＳＤＳ— ＰＡＧＥ电泳（分离胶质量体积分数１２％，浓缩胶质量 体积分数５％）；电泳结束后进行转膜和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测¨ 。