TK基因重组缺陷山羊痘病毒构建及其生物学特性鉴定

南方农业学报ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＳＯＵＴＨＥＲＮ　ＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＥ　２０１３．４４（９）：１５５２—１５５７　ＩＳＳＮ　２０９５—１　１９１；ＣＯＤＥＮ　ＮＮＸＡＡＢ　ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎ￣ｙｘｂ．ｃｎ　

ＤＯＩ：１０．３９６９￣：ｉｓｓｎ．２０９５—１１９１．２０１３．９．１５５２　

基因重组缺陷山羊痘病毒构建　及其生物学特性鉴定　

郑　敏　，梁　晟　，郑彦梓　，兰　彬　，韦显凯　，苏娇秀・，郑列丰　，李常挺，　（　广西动物疫病预防控制中心，南宁５３０００１；　钦州市动物疫病预防控制中心，广西钦　Ｊｉ　５３５０００　。隆安县动物疫病预防控制中心，广西隆安５３２７００）　

摘要：【目的】利用同源重组技术构建聪因缺陷的山羊痘病毒（ＧＴＰＶ）毒株，为研制出更安全、高效的ＧＴＰＶ，￣ｊ　毒疫苗和病毒载体提供备选毒株。【方法】采用ＰＣＲ克隆ＧＴＰＶ　Ａｖ４１株订（基因（ＯＲＦ５６）及其侧翼基因组片段，在ＴＫ　基因内部插入报告基因ＥＧＦＰ和抗性基因　￡表达盒，构建ＧＴＰＶ重组转移载体ｐＴＫ—Ｅｇ。将重组转移载体ｐＴＫ．Ｅｇ与　ＧＴＰＶ　ＡＶ４１株共转染Ｖｅｒｏ细胞，通过空斑纯化筛选阳性重组病毒，鉴定其生长特性和遗传稳定性，并接种山羊评价　其安全性和免疫原性。【结果】成功构建获得一株　基因缺陷的重组病毒ｖＴＫ－Ｅｇ。与亲本毒株ＧＴＰＶ　ＡＶ４１相比，　ｖＴＫ－Ｅｇ的生长特性及其形成的细胞病变均未发生显著改变，只是毒价略微下降ｌ０“　个数量级；在原代牛睾丸（ＢＴ）细　胞上连续传代，至少在１Ｏ代内保持遗传性状和病毒滴度稳定。接种ｖＴＫ—Ｅｇ的山羊精神和食欲均正常，接种后体温升　高和局部反应的严重程度均较接种亲本毒株ＧＴＰＶ　Ａｖ４ｌ的山羊有所降低；ｖＴＫ．Ｅｇ与ＧＴＰＶ　Ａｖ４１株诱导山羊产生　的ＧＴＰＶ中和抗体水平无明显差异（Ｐ＞０．０５）。【结论】构建的丁Ｋ基因重组缺陷病毒ｖＴＫ—Ｅｇ具有良好的遗传稳定性和　免疫原性，较亲本毒株其安全性也有所提高，可作为研ｒ￣ＪＧＴＰＶ基因工程弱毒疫苗和活载体疫苗的备选毒株。　关键词：山羊痘病毒；　基因；重组病毒；基因缺陷；生物学特眭　中图分类号：￥８５２．６５４　文献标志码：Ａ　文章编号：２０９５—１１９１（２０１３）０９—１５５２—０６　

Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｂｉｏ－ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｇｏａｔｐｏｘ　ｖｉｒｕｓ　ｗｉｔｈ　ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ　ｋｉｎａｓｅ　ｇｅｎｅ（ＴＫ）ｄｅｌｅｔｉｏｎ　

ＺＨＥＮＧ　Ｍｉｎ　，ＬＩＡＮＧ　Ｓｈｅｎｇ　，ＺＨＥＮＧ　Ｙａｎ—ｚｈｉ　，ＬＡＮ　Ｂｉｎ　，ＷＥＩ　Ｘｉａｎ—ｋａｉ　，　ＳＵ　Ｊｉａｏ－ｘｕ　，ＺＨＥＮＧ　Ｌｉｅ－ｆｅｎｇ　，ＬＩ　Ｃｈａｎｇ－ｒｉｎｇ　

（　Ｇｕａｎｇｘｉ　ＣｅｎｔｅｒｆｏｒＡｎｉｍａｌ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ａｎｄ　Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，Ｎａｎｎｉｎｇ　５３０００１，Ｃｈｉｎａ；　Ｑｉｎｚｈｏｕ　ＣｅｎｔｅｒｆｏｒＡｎｉｍａｌ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ａｎｄ　Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，Ｑｉｎｚｈｏｕ，Ｇｕａｎｇｘｉ　５３５０００，Ｃｈｉｎａ；　Ｌｏｎｇ’ａｎ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ａｎｉｍａｌ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ａｎｄ　Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，　Ｌｏｎｇａｎ　Ｇｕａｎｇｘｉ　５３２７００，Ｃｈｉｎａ）　

Ａｂｓｔｒａｃｔ：【Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ】Ｔｈｉｓ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｗａｓ　ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ　ｔｏ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ　ａ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｇｏａｔｐｏｘ　ｖｉｒｕｓ（ＧＴＰＶ）ｗｉｔｈ　ｉｎａｃｔｉｖａｔ－　ｉｎｇ　ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ　ｋｉｎａｓｅ　ｇｅｎｅ（ＴＫ）ｉｎ　ｏｒｄｅｒ　ｔｏ　ｄｅｖｅｌｏｐ　ａ　ｓａｆｅ　ａｎｄ　ｈｉｇｈ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　ｌｉｖｅ　ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ　ＧｒｒＰＶ　ｖａｃｃｉｎｅ　ａｎｄ　ｖｉｒａｌ　ｖｅｃｔｏｒ．　【Ｍｅｔｈｏｄ】Ｇｅｎｏｍｅ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　ｏｆ　ＧＴＰＶ　ＡＶ４１　ｓｔｒａｉｎ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ＴＫ　ｇｅｎｅ（０ＲＦ５６）ｗｅｒｅ　ｃｌｏｎｅｄ　ｂｙ　ＰＣＲ　ａｓ　ｆｌａｎｋｉｎｇ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｆｏｒ　ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ．Ｔｈｅ　ｔｒａｎｓ；ｆｅｒ　ｓｈｕｔｔｌｅ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｐＴＫ—Ｅｇ　ｗａｓ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ｂｙ　ｉｎｓｅｒｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｃａｓｓｅｔｔｅｓ　ｏｆ　ＥＧＦＰ　ｇｅｎｅ　ａｎｄ　ｇｐｔ　ｇｅｎｅ．Ｔｈｅ　ｐＴＫ—Ｅｇ　ａｎｄ　ＧＴＰＶ　ＡＶ４１　ｗｅｒｅ　ｃｏ—ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｉｎｔｏ　Ｖｅｒｏ　ｃｅｌ１．ａｎｄ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｖｉｒｕｓｅｓ　ｗｅｒｅ　ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ａｎｄ　ｓｃｒｅｅｎｅｄ　ｂｙ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ．Ｔｈｅｎ，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｖｉｒｕｓｅｓ　ｗｅｒｅ　ｅｘａｍｉｎｅｄ　ｂｙ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ａｎｄ　ｔｉｔｔｅｒｉｎｇ　ｄｕｒｉｎｇ　ｓｅｒｉ　ａｌ　ｐａｓｓａｇｉｎｇ．Ｆｉｎａｌｌｙ，ｔｈｅ　ｇｏａｔｓ　ｗｅｒｅ　ｉｎ＿ｊｅｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｖＴＫ－Ｅｇ　ｉｎ　ｏｒｄｅｒ　ｔｏ　ｅｖａｌｕａｔｅ　ｉｔｓ　ｓａｆｅｔｙ　ａｎｄ　ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ．【ＲｅｓｕｌｔｌＡ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＧＴＰＶ　ｗｉｔｈ　ＴＫ　ｇｅｎｅ　ｄｅｌｅｔｅｄ　ｗａｓ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ａｎｄ　ｎａｍｅｄ　ａｓ　ｖＴＫ—Ｅｇ．ｖＴＫ—Ｅｇ　ｒｅｍａｉｎｅｄ　ａｌｍｏｓｔ　ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｐａｔｔｅｒｎ　ａｎｄ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ＣＰＥ　ｏｆ　ｉｔｓ　ｐａｒｅｎｔａｌ　ｖｉｒｕｓ　ｆＡＶ４１）ｉｎ　ｃｅｌｌ　ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｅｅ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｔｉｔｅｒｓ　ｏｆ　ｖＴＫ—Ｅｇ　ａｎｄ　ｔｈａｔ　ｏｆ　ＡＶ４１　ｗａｓ　ｏｎｌｙ　１０　ｆｏｌｄ．Ｉｔ　ｋｅｐｔ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ａｎｄ　ｔｉｔｅｒ　ｓｔａｂｌｅ　ｉｎ　ａｔ　ｌｅａｓｔ　１０　ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｉｎ　ＢＴ　ｃｅｌ１．Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ．ｉｔ　ｈａｄ　ｌｏｗｅｒ　ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ　ｉｎ　ｇｏａｔｓ．ｃａｕｓｉｎｇ　ｌｅｓｓ　ｓｋｉｎ　ｌｅｓｉｏｎｓ　ａｎｄ　ｆｅｖｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈｏｓｅ　ｏｆ　ｉｔｓ　ｐａｒｅｎｔａｌ　ｖｉｒｕｓ．Ｈｏｗｅｖｅｒ．ｔｈｅｒｅ　ｗａｓ　ｎｏ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ（Ｐ＞０．０５）ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　ｇｏａｔｓ　ｉｎｊｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｖＴＫ—Ｅｇ　ａｎｄ　ｔｈｏｓｅ　ｏｆ　ｇｏａｔｓ　ｉｎｊｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ＡＶ４１．Ｉ　Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ】ｖＴＫ—Ｅｇ　ｈａｄ　ｇｏｏｄ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｓｔａｂｉｌｉｔｙ　ａｎｄ　ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ，ａｓ　ｗｅｌｌ　ａｓ　ｂｅｔｔｅｒ　ｂｉｏ—ｓａｆｅｔｙ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｉｔ　ｈａｓ　ｔｈｅ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｔｏ　ｂｅ　ｆｕｒｔｈｅｒ　ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ　ａｓ　ａ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ａｔｔｅｎｕａｔｅ　ｖａｃｃｉｎｅ　ｓｔｒａｉｎ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｇｏａｔｐｏｘ　ｖｉｒｕｓ（ＧＴＰＶ）；ＴＫ　ｇｅｎｅ；ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｖｉｒｕｓ；ｇｅｎｅ　ｄｅｌｅｔｉｏｎ；ｂｉｏ—ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ　

０引言　【研究意义】山羊痘是由山羊痘病毒（Ｇｏａｔｐｏｘ　ｖｉｒｕｓ，ＧＴＰＶ）￣Ｉ起的一种高度接触性传染病，以发热、　

全身痘疮、结节和死亡为特征。山羊痘的发病率和死　亡率极高，是危害最为严重的家畜痘病毒病，现已被　世界动物卫生组织（ＯＩＥ）和我国农业部分别列为需要　

收稿日期：２０１２—１２—３０　基金项目：广西青年科学基金项目（２０１３ＧＸＮＳＦＢＢ０５３００６，桂科青０９９１０４２）　作者简介：郑敏（１９７５一），博士，副研究员，主要从事动物疫病诊断与防控技术研究工作，Ｅ—ｍａｉｌ：ｚｈｇｍｎ２６＠ｈｏｔｍａｉ１．ｃｏｍ　郑敏等：ＴＫ基因重组缺陷山羊痘病毒构建及其生物学特性鉴定　・１５５３・　报告的疫病和一类动物疫病。【前人研究进展】ＧＴＰＶ　隶属痘病毒科（ＰｏＸＶｉｒｉｄａｅ）羊痘病毒属（Ｃａｐｒｉｐｏｘｖｉｒｕｓ），　具有充当病毒载体的潜力（郑敏等，２ｏｌｏ）。将裂谷热　病毒、蓝舌病病毒等病原体的免疫保护性抗原基因插　入ＧＴＰＶ复制非必需区构建重组病毒，其细胞内复制　能力和免疫原性均维持不变，但能实现一针预防多种　疫病的目的（Ｗａｌｌａｃｅ　ａｎｄ　Ｖｉｌｊｏｅｎ，２００５；Ｐｅｒｒｉｎ　ｅｔ　ａ１．，　２００７）。由于ＧＴＰＶ只能感染羊和小反刍兽，宿主特异　性很强，在研制活载体疫苗时具有生物安全性的天然　优势，因而受到广大科研工作者的日益重视（Ｓｈｅｎ　ｅｔ　ａ１．，２０１１）。在我国山羊痘疫苗研究方面，主要是使用　温度敏感弱毒疫苗毒株ＡＶ４１，其具有良好的免疫原　性，但制备的弱毒疫苗在接种某些地方山羊品种时偶　尔会引起不良反应，严重者可引起腹泻、全身发痘和　孕羊流产（黄国敏和韦春葵，２００４；刘兴和，２００７）。因　此，有必要借助基因工程手段研制出更加安全的新型　疫苗。　基因是痘病毒复制的非必需基因之一，多用　作构建重组病毒的外源基因插入位点。Ｂａｌｉｎｓｋｙ等　（２００７）研究报道，将属于强毒株的绵羊痘病毒ＳＡ株　基因缺陷后所获得的重组毒株毒力显著下降，仅　引起短暂的体温变化，未引起绵羊发病，甚至在接种　部位也不出现痘症。【本研究切入点】目前尚无通过缺　陷ＡＶ４１株丁Ｋ基因获得毒力进一步降低ＧＴＰＶ毒株的　相关研究报道。【拟解决的关键问题】利用同源重组　技术构建丁Ｋ基因缺陷ＧＴＰＶ毒株，评价其生物学特性　及其在山羊体内的安全性和免疫原性，旨在为研制　出更安全、高效的ＧＴＰＶ弱毒疫苗和病毒载体提供备　选毒株。　

１材料与方法　１．１试验材料　ＧＴＰＶ弱毒株（ＡＶ４１）由广西动物疫病预防控制　中心保存，在原代牛睾丸（ＢＴ）细胞中培养；Ｖｅｒｏ细胞、　携带绿色荧光蛋白基因（ＥＧＦＰ）表达盒的质粒ｐＭＤ．　ＰＥＬ—ＥＧＦＰ及携带大肠杆菌黄嘌呤～鸟嘌呤磷酸核糖　转移酶基因（ａｐｔ）表达盒的质粒ｐＫＳ—Ｐ７５一ｇｐｔ均由广　西动物疫病预防控制中心提供。Ｅｘ　Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶、　ｄＮＴＰ、ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ入一ＥｃｏＲＴ１４　Ｉ　ｄｉｇｅｓｔ、ＤＬ２０００　ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ、ＤＮＡ连接酶、限制性内切酶、ｐＭＤ１８．Ｔ载体及　病毒ＤＮＡ／ＲＮＡ提取试剂盒等均购自宝生物工程（大连）　有限公司；霉酚酸、黄嘌呤、次黄嘌呤购自Ｓｉｇｍａ￣司。　１．２同源重组臂的扩增　按照病毒ＤＮＡ／ＲＮＡ提取试剂盒说明提取病毒　ＤＮＡ，根据ＧｅｎＢａｎｋ中ＧＴＰＶ　ＡＶ４１株的丁Ｋ基因序列　（ＡＹ７７３０８７．１），设计两对引物用于扩增长度约４３０　ｂｐ　的基因组片段，包含完整的丁Ｋ基因。ＴＫＬ１：５＇－ＴＧＧＧ　ＣＡＡＡＴＡＡＣＴＧ　ＴＡＡＡＴＡＡＡＧＧＧＴＡＣ一３’（引入　ａｐａ　Ｉ位点）和ＴＫＬ２：５’一Ｃ　Ｑ　！！　△　！　ＴＡＴＡＡＴＧＴＣＧＡＡＡＴＴＣＡ一３’（引入Ｓａｌ　Ｉ、Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ位点　及Ｔ５ＮＴ痘病毒早期转录终止信号序列）。ＴＫＲ１：５＇－Ｔ　ＧＧＧＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＡＧＣＴＣＴＴＴＴＴＧＴＡＧＧＴＡＴＡＧ　ＡＴＧＡＡＧＧＧＣＡＡ．３’（引入Ａｐａ　Ｉ、Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ、Ｓａｃ　Ｉ位点　及Ｔ５ＮＴ痘病毒早期转录终止信号序列）和ＴＫＲ２：　５’．ＧＡＧＴＴＡＧＡＴＡＴＴＴＴＧｃＴＴＧＴＴＴｃＴ．３’。ＰＣＲ扩增　程序为：９４℃预变性３　ｍｉｎ；９４℃１　ｍｉｎ，５７℃１　ｍｉｎ，　７２　１　ｍｉｎ，进行１０个循环；９４℃１　ｍｉｎ，５５℃１　ｍｉｎ，　７２℃１　ｍｉｎ，进行２０个循环；７２℃延伸１０　ｍｉｎ。扩增产　物经回收纯化后与ｐＭＤ１８．Ｔ连接，经测序正确的阳性　克隆分别命名为ｐＭＤ—ＴＫＬ和ｐＭＤ．ＴＫＲ。然后用Ａｐａ　Ｉ　和Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ消化ｐＭＤ—ＴＫＬ获得ＴＫＬ片段，再与ｐＭＤ—　ＴＫＲ载体连接获得质粒ｐＴＫ。　１．３重组转移载体ｐＴＫ—Ｅｇ的构建　用Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ和Ｓａｃ　Ｉ消化ｐＭＤ—ＰＥＬ—ＥＧＦＰ获得　ＰＥＬ．ＥＧＦＰ表达盒，然后克隆到同样消化的骨架质粒　ｐＴＫ上获得ｐＴＫ－ＥＧＦＰ。用ＢａｍＩ－Ｉ　Ｉ消化ｐＫＳ．Ｐ７５一ａｐｔ，　补平，再用Ｓａｌ　Ｉ消化获得表达盒Ｐ７５．ｇｐｔ；同时用Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ消化ｐＴＫ－ＥＧＦＰ，补平，用Ｓａｌ　Ｉ消化获得载体ｐＴＫ．　ＥＧＦＰ；将表达盒Ｐ７５．ｇＰ内载体ｐＴＫ－ＥＧＦＰ相连获得重　组转移载体ｐＴＫ．Ｅｇ。　１．４重组病毒ｖＴＫ—Ｅｇ的制备、筛选及纯化　当Ｖｅｒｏ￣胞长满９０％时，按０．０５的感染复数（Ｍ．Ｏ．　Ｉ值）感染ＧＴＰＶ　２　ｈ，然后用脂质体Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００　进行转染，当８０％细胞出现细胞病变（ＣＰＥ）时（约在第　７　ｄ）收集病毒液。将收获的病毒液作１０。、１０铘１０。５１音稀　释，接种Ｖｅｒｏ细胞，培养基中加入霉酚酸（２５　ｔｘｇ／ｍＬ）、　黄嘌呤（２５０　Ｉｘｇ／ｍＬ）、次黄嘌呤（１５　Ｉｘｇ／ｍＬ），在３７℃、　５％ＣＯ　的条件下培养７　ｄ出现ＣＰＥ后，荧光显微镜检　查是否出现荧光斑。用含胰酶的无菌滤纸片挑出荧　光蚀斑，并转至１２孔板继续进行筛选和蚀斑纯化。　１．５重组病毒的细胞生长特性鉴定　将１００　ＴＣＩＤ５０的重组病毒ｖＴＫ．Ｅｇ与ＧＴＰＶ　Ａｖ４１株　分别接种ＢＴ细胞，分别培养２４、４８、７２、９６、１２０和１４４　ｈ后　收获病毒并测定其半数组织培养感染剂量（ＴＣＩＤ∞），　绘制病毒生长动力学曲线。　１．６重组病毒遗传稳定性　将纯化的重组病毒ｖＴＫ．Ｅｇ在ＢＴ细胞上连续传　代，定期检查细胞状态，记录８０％以上细胞出现ＣＰＥ的　时间。如此连续培养１０代，每５代提取病毒ＤＮＡ进行　ＰＣＲ检测，测定重组病毒ＴＣＩＤ蚰。　１．７山羊接种试验　选取１岁龄健康杂交都安山羊１２只，随机分为３　组，每组４只。第１组尾内侧皮内接种１０　ｓ　ＴＣＩＤ　ｇｏ．２