分子生物学实验报告

分子生物学实验报告

姓名：

学院：

专业班级：

学号：

一、前期工作及引物设计

（一）实验目的：

寻找一个合适的基因，并设计出与之相对应的引物，用于后续实验。

（二）实验原理：

引物设计的一般原则：

①引物长度：15-30bp

②GC含量：一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%

③退火温度：退火温度需要比解链温度低5℃，如果引物碱基数较少，可以适当提高

退火温度，这样可以使PCR的特异性增加

④避免扩增模板的二级结构区域

⑤与靶DNA的错配：当被扩增的靶DNA序列较大的时候，一个引物就有可能与靶

DNA的多个地方结合，造成结果中有多个条带出现。这个时候有必要先使用BLAST 软件进行检测

⑥引物末端：引物3’端是延伸开始的地方，因此要防止错配就从这里开始。3’端不

应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。

⑦引物的二级结构：引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构，

这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。

（三）操作方法：

1、阅读一些与小麦抗旱基因相关的文章，并最终选出基因TAPK7。

LOCUS AB125308 1583 bp mRNA linear PLN 15-FEB-2008

2、根据引物设计原则，用相关软件Primer6设计两对引物。

3、在网站NCBI上用BLAST检验所设计的引物，并从中选出较好的一对引物。（四）实验结果：

前引物：5’-CCAACATCATCCGCTTCA-3’（position:396 引物长度：18）

后引物：5’-CCTGCTCATCCTCCTCTT -3’（position:1190 引物长度：18）

（产物长度795）

（五）讨论：

虽然我们自己设计出来引物，但是后来做PCR的效果也不好，后来还换了引物。所以希望老师能在这些我们还未学习到的地方给一些经验指导，或者提供一些资料参考，来保证我们的实验效果。

二、目的基因提取及验证

（一）实验目的：

根据所设计的引物，用克隆基因组和反转录两种方法，得到目的基因cDNA。

（二）实验原理：

1、提取基因组：十六烷基三甲基溴化胺（CTAB）是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中是可溶的,当降低溶液盐浓度到一定程度时,从溶液中沉淀。在本实验方案中，首先通过含有CTAB高盐抽提液使DNA充分溶出，然后加入氯仿使蛋白和细胞碎片沉淀，离心后，溶液分为三层，上层为CTAB与核酸的复合物的高盐溶液，中层为蛋白质和细胞碎片，下层为氯仿。取出上清加入异丙醇使核酸沉淀。

2、提取RNA：DNA和RNA的溶解性不同，DNA在1M的盐溶液中具有最好的溶解度，而RNA在0.14M的盐溶液中具有最好的溶解度，所以可以利用它们的溶解性将它们进行区分。RNA提取的另一个关键问题就是抑制或去除环境中RNA酶，判断RNA 的质量主要有两个标准，一是纯度，二是完整性（是否被降解）。

3、利用提取的基因组和设计好的引物一起做PCR，便可得到目的基因。利用提取的RNA和设计的引物一起做RT-PCR，便可得到目的基因的cDNA。之后再做电泳检验扩增出的条带是否和目的基因的分子量大小相符。

（三）实验步骤：

（1）基因组DNA提取

1. 取0.15g左右小麦叶片，在液氮中研磨后放入1.5ml离心管中，加入700μl抽提液

（65℃预热）混匀，加4 ul RNase室温静置2min。放入65℃水浴中，裂解40-60分钟，期间温和混匀几次。

2. 取出裂解好的DNA ，加入700μl 氯仿：异戊醇（24：1），猛烈混匀，离心（10000rpm，

10分钟）。

3. 取上清于新管中，（不要混入氯仿），加入0.8-1倍预冷异丙醇，缓慢混匀后，再猛烈

混匀，使DNA成团，-20℃放置半小时以上。

4. 将析出的DNA 离心，14000rpm，10分钟。

5. 去掉上清，将沉淀用1ml 70% 乙醇清洗一次，挥发除去乙醇，溶于50μl TE或水中。（2）提取RNA：

1. 称取小麦叶片50-100mg,于研钵中加液氮研磨成粉末，迅速转移到1.5ml离心管中。

2. 加入1 ml Trizol Reagent，15～30℃×5min。

3. 加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15 sec，15～30℃×3min。

4. 冷冻离心12 000 rpm×15min。

5. 将上清液转移到另一个离心管中，加0.5ml预冷异丙醇,混匀，-20℃放置20min。

6. 冷冻离心12 000 rpm×10min，弃上清。

7. 加入0.5ml 70%乙醇于RNA沉淀中并悬浮沉淀，10000 rpm×2min，挥发除去乙醇。

8. 加入30 μl DEPC 处理过的ddH2O溶解RNA。

（3）PCR及RT-PCR：

1.

2. 设置

94 ℃180s

94 ℃45s

32 cycles: 55℃45s

72 ℃45s

72 ℃600s

3. 运行PCR程序

（4）电泳分析：

用2%的琼脂凝胶，做电泳，在中间点入Maker。

（四）实验结果：

电泳显示：用基因组扩增的一组条带很微弱，用RNA做反转录的一组则没有任何条带。

之后又重复做了几次扩增和电泳，还是没有清晰的条带，因此便用了实验室的一个基因和与之配套的引物进行下一步实验。

（五）讨论：

1、在反转录法提取RNA中，由于我们选取的是小麦的一个抗旱基因，而实验用的小麦可能没有表达该基因，提取的RNA中没有相关的基因转录片段，因此在做反转录时扩增失败。

2、在前期准备对设计的引物进行检验时，一些看不懂参数也没在意，有可能也是扩增失败的原因之一。

3、基因组DNA在提取时，最后一步出现错误，加了自来水而不是ddH2O，导致其中盐浓度过高，测得OD值也只有1500左右，可能是扩增失败的原因之一。

三、制作感受态细胞、转化及蓝白斑筛选

（一）目的

掌握感受态细胞制备和转化及蓝白班筛选的原理和基本方法。

（二）原理

受体细胞经过一些特殊方法如电击法, 化学试剂法（CaCl2 ,RbCl，KCl)等的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞。

（三）操作步骤

（1）感受态细胞的制备(0.1M CaCl2方法)

1. 从LB固体平板挑单克隆于5ml LB液体培养基中(不加抗生素)，37℃×200rpm×

12-16h，可过夜培养。

2. 将活化菌体按1～5％接种到LB中，扩大培养37℃×200rpm×2h，至OD600约为

0.4。

3. 取培养好的菌液1.5 ml于一离心管中，4℃离心8 000rpm×1 min。

4. 弃上清，加500 μl 0.1M CaCl2 (灭菌预冷)洗菌体，4℃冷冻离心8000rpm×1 min。

5. 彻底除去残液, 加200 μl 0.1M CaCl2 (灭菌预冷)，悬浮菌体。

6. 冰浴静置20 min ，4℃冷冻离心8000rpm×1 min。

7. 弃上清，加100 μl 0.1M CaCl2 (灭菌预冷)，悬浮菌体，即为制备好的感受态细胞。（2）质粒载体与外源DNA连接：

1. 取一个1.5ml离心管依次加入下列试剂:

2×ligation buffer：5μl

pGEM-T Easy：1μl

目的片段：2μl

T4 DNA连接酶：1μl

ddH2O：1μl

2. 离心机离心30s，使反应体系充分混合。

3. 4℃过夜连接。

（3）大肠杆菌的转化

1. 将连接产物加入100 μl制备好的感受态细胞，冰上放置10-20 min。

2. 42℃热激90s。

3. 迅速冰浴3min。

4. 加入600 μl LB液体培养基，37℃轻摇培养45min。

5. 30μl X-gal和6 μl IPTG混匀涂布在含有50 μg/ml氨苄的LB固体培养平板中。

6. 取菌液100 μl涂板。

7. 37℃倒置，避光培养16-20 h。

（4）蓝白斑筛选：

由于载体上有氨苄抗性基因，在培养基60-70摄氏度时，加入氨苄，在接种大肠杆菌，便会出现蓝白斑。挑取单菌落进行菌落进行扩大培养，之后PCR鉴定。

（四）实验结果：

经过一天的培养后培养皿并没有出现蓝白斑，不过PCR扩增和电泳分析后，发现了目的基因，但杂带较多。后来用基因组和引物进行扩增，用于转膜。

（五）讨论：

1、没有出现蓝白斑的原因可能是抗生素放置时间太长而失效，可能是培养时间不够。但对连接载体进行PCR扩增后发现了目的基因，说明载体连接正确。所以可以从培养皿上取一些细菌扩大培养，做进一步的鉴定。

2、在做转化时，热激前可先将其轻轻混匀，可以提高转化效率。

四、提取质粒DNA

（一）目的

学习碱裂解法提取质粒的原理。

（二）原理

质粒DNA的提取是依据质粒DNA分子较染色体DNA分子小，且具有超螺旋共价闭合环状的特点，从而将质粒DNA与大肠杆菌染色体DNA分离。实验室普遍采用的碱裂解法具有操作简便、快速、得率高的优点。其主要原理：利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。

（三）实验步骤：

1. 柱平衡步骤：向吸附柱CP3 中（吸附柱放入收集管中）加入500μL 的平衡液BL，

12,000rpm（~13,400×g）离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（请使用当天处理过的柱子）

2. 取1-5 mL 过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12,000rpm（~13,400

×g）离心1min，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。

3. 向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL 溶液P1（请先检查是否已加入RNaseA），

使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。

4. 向离心管中加入250μL 溶液P2，温和地上下翻转6-8 次使菌体充分裂解。

5. 向离心管中加入350μL 溶液P3，立即温和地上下翻转6-8 次，充分混匀，此时将

出现白色絮状沉淀。12,000rpm（~13,400×g）离心10min，此时在离心管底部形成沉淀。

6. 将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3 中（吸附柱放入收集管中），注

意尽量不要吸出沉淀。12,000rpm（~13,400×g）离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3 放入收集管中。

7. 向吸附柱CP3 中加入600μL 漂洗液PW（请先检查是否已加入无水乙醇），

12,000rpm（~13,400×g）离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3 放入收集管中。

8. 重复操作步骤7。

9. 将吸附柱CP3 放入收集管中，12,000rpm（~13,400×g）离心2min，目的是将吸附

柱中残余的漂洗液去除。

10. 将吸附柱CP3 置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100μL 洗

脱缓冲液EB，室温放置2 min，12,000rpm（~13,400×g）离心2min 将质粒溶液收集到离心管中。

（四）实验结果：

质粒的提取顺利，经双酶切电泳检验后，有明显的条带。

（五）讨论：

【如何更好的提取质粒？】

用试剂盒提取质粒时，最好注意下面几个细节：

1、新鲜菌液。-20冻存的菌体沉淀提取质粒的质量不如来自新鲜菌液的。

2、不要处理过多的菌液。

3、溶液P2和溶液P3处理的时候动作不要剧烈。特别是溶液III动作过于剧烈，容易导致离心蛋白的效果不佳，也容易导致质粒终产物中的菌体基因组DNA污染的增大。

4、加入漂洗液时，可以静置一下再离心，如果400ulX2两次漂洗效果可能会更好。但是按试剂盒操作说明只700ul一次漂洗所获得的质粒质量也是没有问题的。

5、采用硅胶膜类试剂盒时，一定要在漂洗后再次离心1－3min，以彻底去除漂洗液。漂洗液中含有乙醇，残留在硅胶膜上会导致质粒洗脱效率下降，也会造成质粒后续操作例如酶切效率的降低。

6、离心洗脱前最好静置1－2min。如果有时间也可以将50ulX2两次洗脱，但实际上一次洗脱的效率足够让你获得足量的质粒DNA。

7、采用试剂盒提取的质粒DNA应该基本上只有一条超螺旋，其他带条都是很模糊的比较多。

8、提质粒大都提的有三条带，一般是三条，不可能只有一条。

五、转膜及地高辛标记的探针制作及杂交

（一）目的

学习Southern杂交的原理及操作方法。

（二）原理

在琼脂糖凝胶上按片段大小电泳分离待检的DNA；用NaOH对凝胶中的DNA进行变性处理；通过毛细管作用将单链DNA吸附到硝酸纤维素膜上；然后用标记好的探针进行杂交，洗掉没有杂交的游离探针；经放射性自显影（放射性标记探针）或生化检测（非放射性标记）就可以证明基因片段与已知探针是否具有同源性，达到检测样品基因的目的。

因此，Southern印迹杂交包括两个步骤①把电泳分级的DNA转移到固定支持膜上。②与标记的DNA探针杂交。

（三）实验步骤：

1. 用之前提取的基因组加完全引物，做PCR扩增目的基因。

2. PCR完成之后，点样电泳（点样时，留10ul做探针），然后观察是否扩增出了目的基因，如果有的话，进行下一步的转膜操作。

3. 按照实验指导书上的操作步骤进行转膜操作。

4. 制作地高辛标记的探针：先将DNA热变性：把DNA置于沸水中，水浴10分钟。然后，迅速地插入碎冰中3分钟以上。再加4μl DIG Random Labeling Mix(高效)，置于37℃20小时即可。

5. 转膜之后，用地高辛标记探针与硝酸纤维素膜杂交，一段时间后看上面条带的位置，判定是否有目的基因。

（四）实验结果：

胶片上的DNA成功转移到硝酸纤维膜上，且探针也制作成功，带地高辛的maker也制作成功。最后杂交时，在硝酸纤维素膜有目的基因。

（五）讨论：

这步操作中，用目的基因转膜，然后用剩余的目的基因连地高辛做成探针。由于之前已经经过多次电泳验证，可以扩增出来，因此探针和膜上的DNA为完全同源序列，没有意外的话，下一步的杂交结果，与maker比较，目的基因大小处应有条带。