人诱导性多能干细胞的建立,鉴定与维持+201...
高中生物 第一单元 生物技术与生物工程 第2章 第4节 干细胞工程教案 中图版选修3-中图版高中选修
第四节干细胞工程1．描述干细胞分类。
(重点)2．举例说出胚胎干细胞的移植。
(难点)干细胞的概念及其分类1．干细胞具有自我更新和分化发育潜能的原始细胞。
2．干细胞分类(依据分化潜能的大小)(1)全能干细胞：具有形成机体的任何组织或器官直至形成完整个体的潜能，如受精卵。
(2)多能干细胞：具有分化成多种组织的潜能，但不能发育成完整的个体，如骨髓造血干细胞。
(3)专能干细胞：只能分化成某一类型的细胞，如神经干细胞。
[合作探讨]探讨1：全能干细胞、多能干细胞、专能干细胞全能性的大小顺序为？提示：全能干细胞＞多能干细胞＞专能干细胞。
探讨2：各类干细胞都能形成一个完整个体吗？提示：各类功能干细胞都具有发育的全能性，即可以分化为成年动物体内任何一种组织细胞，但只有全能干细胞才具有发育成完整个体的潜能。
探讨3：胚胎发育过程中不同干细胞之间存在怎样的关系？提示：受精卵→全能干细胞→多能干细胞→专能干细胞。
[思维升华]1．对干细胞的理解(1)干细胞是机体内未分化或未完全分化的细胞，它们的增殖和分化，可以实现机体组织细胞的更新，也可以发育成某一组织、器官。
(2)机体内的一般体细胞已经发生了分化，而这种分化一般是不可逆的，所以分化了的体细胞一般失去了分裂增殖能力，即细胞的自我更新能力。
2．干细胞类型比较名称全能干细胞多能干细胞专能干细胞特点具有形成机体的任何组织或器官直至形成完整个体的潜能具有分化成多种细胞或组织的潜能，但不能发育成完整的个体只能分化成某一种类型或功能密切相关的两种类型的细胞举例受精卵、胚胎干细胞造血干细胞神经干细胞应用用于病人的器官移植等造血干细胞移植是治疗血液系统疾病、遗传性血液病等的有效手段通过神经干细胞移植治疗脑瘫、头颅外伤等病症1．下列关于胚胎干细胞的叙述，哪项是不正确的( )A．动物胚胎的每一个细胞都是胚胎干细胞B．胚胎干细胞具有分化为动物各种组织的潜能C．胚胎干细胞的遗传物质在质和量上与受精卵相同D．胚胎干细胞在体外可被诱导分化为不同的组织类型【解析】胚胎干细胞主要来源于囊胚期的内细胞团；由于其分化的全能性，也可在体外培养时诱导为不同的机体组织；细胞分化是基因选择性表达的过程，细胞中的遗传物质并不发生改变。
KDMs在重编程与多能性调控中的生物学功能
中国细胞生物学学报Chinese Journal of Cell Biology2020, 42(11): 2079-2086DOI: 10.11844/cjcb.2020.11.0021KDMs在重编程与多能性调控中的生物学功能高辉1’2’3文兰1’2’3胡蓉1’2’3张昌军u’4刁红录以3’4*G十堰市人民医院(湖北医药学院附属人民医院)生殖医学中心，十堰442000;2湖北医药学院生物医药研宄院，十堰442000;3湖北省生殖医学临床医学研宄中心，十堰442000; 4湖北医药学院生物医学工程学院，十堰442000)摘要 表观遗传修姉对于干细胞的命运决定和体细胞重编程至关重要，组蛋白赖氨酸去曱基化酶(lysine demethylases,K D M s)作为组蛋白修饰关键调控因子，是再生医学研究的热点。
目前 研究发现，K D M s在干细胞多能性的维持、谱系分化激活以及体细胞核移植胚胎的重编程方面具 有重要的生物学作用。
该文将对K D M s在干细胞领域的最新研究进展进行综述。
关键词 K D M s;胚胎干细胞;诱导多能干细胞;专能干细胞;体细胞核移植Biological Functions of KDMs in Reprogramming andPluripotent RegulationG A O H u i1'2-3,W E N L a n1'2-3,H U R o n g1'2'3,Z H A N G C h a n g j u n13-4,D I A O H o n g l u1-2'3-4*Q R eproductive Medicine Center, Renmin Hospital, Hubei University o f M edicine, Shiyan 442000, China;2Biomedical Research Institute, Hubei University o f M edicine, Shiyan 442000, China', ^H ubei Clinical Research Center f or Reproductive Medicine, Shiyan 442000, China) ^Biomedical Engineering College, Hubei University o f M edicine, Shiyan 442000, China)Abstract Epigenetic modification is critical for the fate of stem cells a n d somatic r e p r o g r a m m i n g.K D M s (lysine demethylases),as k e y regulators o f histone modification,are hot topics in regenerative m e d i c i n e.Current studies hav e found that K D M s play important biological roles in the maintenance of stem cell pluripotency a n d the activation o f lineage differentiation as well as the r e p r o g r a m m i n g of somatic cell nuclear transfer e m b r y o s.This article will review the latest research progress of K D M s in the field of stem cells.Keywords K D M s;e m bryonic stem cells;induced pluripotent stem cells;multipotent st e m cells;somatic cell nuclear transfer干细胞是指具有自我更新能力和多向分化潜 能的细胞，根据细胞分化的潜能不同可分为全能干 细胞、多能干细胞(pluripotent stem cells,P S C s)、专 能干细胞(multipotent stem cells)、单能干细胞。
逆转录病毒方法建立小鼠诱导性多能干细胞的实验研究
明 已经 建 立 小 鼠ｉ Ｐ Ｓ细胞 ； ＭＥ Ｆ ； 逆转录病毒 中图分类号 ： Ｒ ３ ３ １ 文献标识码： Ａ 文章编号 ： １ ０ ０ ５ － ５ ５ ０ ９ （ ２ ０ １ ３） ｏ ２ ＿ ｏ ｌ １ ｌ 一 ０ ５ Ｒｅ ｓ ｅ ａ ｒ ｃ ｈ ｏ ｆ Ｍｏ ｕ ｓ ｅ Ｉ ｎ ｄ ｕ ｃ ｅ ｄ Ｐ ｌ ｕ ｒ ｉ ｐ ｏ ｔ ｅ ｎ ｔ Ｓ ｔ ｅ ｍ Ｃ ｅ ｌ ｌ Ｃｒ ｅ ａ ｔ ｅ ｄ ｂ ｙ Ｒｅ ｔ ｒ ｏ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ Ａｐ ｐ ｒ ｏ ａ ｃ ｈ Ｓ ｈ ａ ｎ Ｗｅ ｉ ， Ｙ ｕ Ｑ ｉ ｎ ， Ｗａ ｎ ｇ Ｂ ｉ ａ ｏ ，ｅ ｔ ａ ｌ １ ． １ ｎ ｓ ｔ ｉ ｔ ｕ ｔ ｅ ｏ ｆ Ｂ ｉ ｏ ｌ ｏ ｇ ｉ ｃ ａ ｌ
Ｅ ｎ ｉｎ ｇ ｅ ｅ ｒ ｉ ｎ ｇ ， Ｚ ｈ ｅ ｊ ｉ ａ ｎ ｇＣ ｈ ｉ ｅｓ ｎ ｅ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ｉ ｎ ｅ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ） ； Ｈａ ｎ ｇ ｚ ｈ ｏ ｕ Ｉ ３ １ ０ ０ ５ ３ ） ， Ｃ ｈ ｉ ｎ ｏ ， ＂ ２ Ｔ ｈ ｅ Ｆ ｉ ｒ ｓ ｔ Ａ ｆ ｉｌ ｆ ｉ ａ ｔ ｅ Ｈｏ ｓ ｐ ｉ ｔ ｌ ａ ， Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ａ ｌ Ｓ ｃ ｈ ｏ ｏ ｌ ｆＺ ｏ ｈ ｅ ｊ ｉ ａ ｎ ｇＵ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ Ａｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ： ［ Ｏｂ ｊ ｅ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ ］Ｔ ｏ ｃ ｒ ｅ ａ ｔ ｅ ｔ ｈ ｅ ｍｏ ｕ ｓ ｅ ｉ ｎ ｄ ｕ ｃ ｅ ｄ ｐ ｌ ｕ ｒ ｉ ｐ ｏ ｔ ｅ ｎ ｔ ｓ ｔ ｅ ｌ ｌ ｑ ｃ ｅ ｌ ｌ （ ｍｉ Ｐ Ｓ Ｃ ）ｂ ｙ ｔ ｈ ａ ｎ ｓ ｆ ｅ ｃ ｔ ｉ ｎ ｇ ｔ ｈ ｅ １ ＣＲ ｍｏ ｕ ｓ ｅ ｅ ｍｂ ｙｏ ｒ ｎ ｉ ｃ ｉ ｆ ｂ ｒ ｏ ｂ ｌ ａ ｓ ｔ （ ＭＥ Ｆ ）ｏ ｆ ｐ ａ ｓ ｓ ａ ｇ ｅ ２ ｔ ｈ ｒ ｏ ｕ ｇ ｈ ｔ ｈ ｅ ｒ ｅ ￣ ｏ ｖ ｉ ｍｓ ａ ｐ ｐ ｒ ｏ ａ ｃ ｈ ｉ ｎ ｏ ｒ ｄ ｅ ｒ ｔ Ｏ ｐ ｒ ｏ ｖ ｉ ｄ ｅ ｔ ｈ ｅ ｔ ｈ ｅ ｏ ｒ ｅ ｔ ｉ ｃ ａ ｌ ｂ ａ ｓ ｉ ｓ ｆ ｏ ｒ ｃ ｌ ｉ ｎ ｉ ｃ ａ ｌ ａ ｐ ｐ ｌ ｉ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ 【 Ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｓ 】 Ｔ ｈ ｅ ｒ ｅ ｓ ｅ ａ ｒ ｃ ｈ ａ ｐ ｐ ｈ ｅ ｄ ｔ ｈ ｅ ｒ ｅ ￣ ｏ ｖ ｉ ｍｓ ｃ ｏ ｎ ｔ ａ ｉ ｎ ｉ ｎ ｇ
人成纤维细胞的体外分离、纯化培养及细胞鉴定
·1216·
中国老年学杂志 2012 年 3 月第 32 卷
化学染色，细胞质中有棕色颗粒。成纤维细胞的标志物 Vimen- tin 为阳性，证明提取细胞为成纤维细胞。见 细胞培养第 2 天； c： 细胞培养第 12 天细胞生长呈鱼群状； d： 细胞培养第 14 天，细胞生长呈漩涡状
5 Keisuke T，Jin H，Taranova O，et al. Generation of insulin-secreting isletlike clusters from human skin fibroblasts〔J〕. Science，2008； 283 （ 46 ） ： 31601-7.
2结果 2. 1 成纤维细胞分离、纯化及培养 通过酶消化法及贴壁筛 选法，成功分离出人成纤维细胞。 2. 2 形态学观察 倒置显微镜观察细胞形态，接种第 2 天可 见细胞散在生长，分布不均的单个贴壁细胞呈梭形，成纤维细 胞样。待细胞培养 10 ～ 14 d 时，细胞生长已达 80% ～ 90% ，呈 鱼群样或漩涡状排列。见图 1。 2. 3 细胞 HE 染色 成纤维细胞的形态呈梭形，也可见大多 角形和扁平星形等。核仁明显，核呈椭圆形，可见 1 ～ 2 个核 仁，胞体较大，胞质弱嗜碱性，染色质疏松着色浅。当细胞汇流 时，呈鱼群样或漩涡状排列，细胞在 15 代内形态保持不变，经 HE 染色可以更清楚地观察到这些表现。见图 2。 2. 4 细胞免疫组化结果 对第 6 代成纤维细胞进行免疫细胞
人 成 纤 维 细 胞 的 体 外 分 离 、纯 化 培 养 及 细 胞 鉴 定
王玲玲1 马 峰2 张玉成 杜珍武 张桂珍 （ 吉林大学中日联谊医院中心研究室，吉林 长春 130033）
〔摘 要〕 目的 对人皮肤成纤维细胞进行分离、纯化、培养及细胞鉴定，探讨一种高效的分离及纯化方法，为细胞移植提供种子细胞。方法 使用酶消化法原代提取人成纤维细胞，快速贴壁法纯化细胞，对细胞进行形态学观察、HE 染色，免疫细胞化学鉴定细胞标志物 Vimentin。结果 利 用倒置显微镜及 HE 染色，可见细胞为散在分布的梭形贴壁细胞，当细胞汇流时，呈鱼群样或漩涡状排列，且细胞在 15 代内形态保持不变。结论 成 功地发现快速提取成人成纤维细胞的方法，为成人自体细胞移植的研究奠定了基础。
我国科学家将诱导多能干细胞转化效率提高到10%
我 国科 学 家 研 发 “ 优 八 号 “ 交水 稻 珞 杂 在 越 南创 三 项 第 一
近 期， 者从武汉市人 民政府和武汉大学主办的红莲型 记 杂 交 稻 现场 观 摩 及 产 业 化 研 讨 会 上 获 悉 ，２ ０ 年 ， 红 莲 型 ０９
杂 交水 稻 “ 优 八号 ”在 越 南 的种 子 销 售 量 突 破 １ ０ 珞 ０ ０吨 大 关 ，创 下 了越 南 国 内单 个 品 种 销 售 量 、种 植 范 围和 综 合 质量 三 项第 一 。 表 彰 该 品种 对 越 南 国家 粮 食 安 全 和 对 农 民增 产 为 增 收作 出 的 巨大 贡 献 ，越 南 农 业 部拟 定在 今 年 授 予 “ 优 八 珞 号 ”粮 食 安 全 金 奖 。 据 越 南 大 洋 种 业 有 限 公 司 董 事 长 罗 云 飞 介 绍 ，２ ０ 年 ０６ 夏 季 ， 该 公 司携 带 ４ ０公斤 “ 优 八 号 ”到 越 南 宁 平 县 做 实 珞 验 ，产 量 达 到 ８ ４吨 ／ 顷 ，大 大 超 过 当 时 其 他 新 品种 夏 季 ． 公 最 高 产 量 ７ ５吨 ／ 顷 。从此 ，“ 优 八 号 ” 越 南 的销 售 就 ． 公 珞 在 迅速从 ２０ ０ ７年 的 ２ ０吨 上 升 到 ２ ０ ３ ０ ９年 的 １２ ０ ０吨 。 目前 ，
的市场 需求，而且成本低 ， 安全可靠， 以杜绝病原菌污染。 可 课题组 已获得高纯度 的重 组人血清 白蛋 白， 品质量超 产 过 国 际 同类 产 品 。目前 他们 与武 汉 禾 元 生物 科 技 有 限公 司 联
合 进 行 开 发 ，开 始 进 入 国 际工 业 试 剂 市 场 ， 可望 再经 ４ ～５ 年 的 努 力 使 重 组 人 血 清 白蛋 白进 入 医药 市 场 。（ 技 日报 ） 科
干细胞的分离与培养技巧指南
干细胞的分离与培养技巧指南干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞，具有广泛的应用前景在组织工程、再生医学和药物研发等领域。
为了充分发挥干细胞的应用潜力，正确的分离和培养技巧显得尤为重要。
本文将为您介绍干细胞的分离与培养技巧，帮助您获得可靠的实验结果并提高实验效果。
一、干细胞的分离技巧1. 选择合适的组织来源干细胞可以从多种来源获得，包括胚胎干细胞、成体干细胞和诱导性多能干细胞。
根据研究目的和实验要求，选择适合的组织来源对于干细胞的分离至关重要。
例如，如果研究需要大量干细胞，胚胎干细胞可能是一个理想的选择；如果研究着眼于特定组织的再生，成体干细胞或诱导性多能干细胞可能更适合。
2. 采取正确的分离方法分离干细胞的方法有很多种，如机械分离、胶原酶消化和离心法等。
选择合适的方法要考虑细胞来源和实验要求。
机械分离主要适用于组织块的分离，胶原酶消化常用于组织细胞的分离，而离心法可以用于分离含有干细胞的细胞组分。
同时，在分离过程中要注意避免对细胞造成损伤，确保干细胞的活力和其它特性的保持。
3. 精确的筛选和鉴定干细胞分离干细胞后，对其进行准确的鉴定是必不可少的。
常用的鉴定方法包括细胞表面标记物的检测、形态学观察和功能性实验等。
通过这些方法可以确定干细胞的表型特征和功能特性，从而确认干细胞的纯度和活性，进一步提高实验的可靠性。
二、干细胞的培养技巧1. 选择适当的细胞培养基干细胞的培养基是维持其生长和增殖的基础。
不同类型的干细胞需要不同的培养基，包括支持细胞增殖的基础培养基和特定因子的补充培养基等。
选择适当的培养基要根据细胞类型和实验需求来确定，同时注意培养基的配方和浓度，确保提供足够的营养物质和生长因子。
2. 维持适宜的培养条件干细胞的培养需要维持适宜的环境条件，包括温度、湿度、气体氛围、培养器具和培养面积等。
一般情况下，干细胞的培养条件与正常体内环境相似，例如37℃的恒温、细胞培养箱中恒定的5% CO2和湿度控制等。
人类胚胎干细胞的建系与鉴定的开题报告
人类胚胎干细胞的建系与鉴定的开题报告一、研究背景干细胞作为一类具有自我更新和分化潜能的细胞，被广泛应用于组织工程和再生医学领域。
其中，人类胚胎干细胞（hESC）由于具有极其广泛的分化潜能和多能性，被认为是非常有潜力的细胞来源。
然而，hESC的研究受到法律、伦理和技术等多方面因素的限制，因此其建系和鉴定也存在一定的挑战和困难。
本文主要对hESC的建系和鉴定进行探讨。
二、研究目的1.了解hESC的定义、特点以及应用前景。
2.探究hESC建系的方法和技术，包括细胞来源、培养基组成、培养条件、培养器具和培养技术等。
3.了解hESC的鉴定方法和技术，包括免疫细胞化学、RT-PCR、流式细胞术等。
三、研究内容1.hESC的定义、特点和应用前景hESC是来源于人类早期胚胎内的干细胞。
它们具有自我更新和分化潜能，可以分化成不同类型的细胞，如心脏细胞、神经元、肌肉细胞等，目前已被广泛应用于组织工程和再生医学领域。
hESC最大的特点是具有多能性，即可以分化成不同类型的细胞。
这种多能性赋予了hESC广泛的应用前景，例如治疗神经退行性疾病、心血管疾病、肌萎缩性侧索硬化等。
2.hESC建系的方法和技术hESC的建系主要有两种方法：自然建系和人工建系。
自然建系是让早期胚胎在体外自然发育，然后从其内部的内细胞团中分离出hESC。
人工建系则是将内细胞团直接分离后进行体外培养。
hESC建系需要注意一些环节，包括细胞来源、培养基组成、培养条件、培养器具和培养技术等。
细胞来源可以是早期胚胎或人工合成内细胞团。
培养基是保证hESC生长的重要条件，其中核心成分为生长因子和化学物质。
培养条件需要在恒温恒湿条件下，保证适当的二氧化碳和氧气供应。
培养器具需要使用无菌的方法进行清洁。
培养技术需要注意细胞的裂解、传代、分化等方面的操作。
3.hESC的鉴定方法和技术hESC的鉴定方法包括免疫细胞化学、RT-PCR、流式细胞术等。
免疫细胞化学可以检测表面标志物如Oct4、SSEA4、TRA-1-60、TRA-1-81等。
分子生物学综述论文(基因敲除技术)
现代分子生物学课程论文题目基因敲除技术班别生物技术10-2学号 *********** 姓名陈嘉杰成绩基因敲除技术的研究进展要摘基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。
此后经历了近20年的推广和应用，直到2007年10月8日，美国科学家马里奥•卡佩奇（Mario Capecchi）和奥利弗•史密西斯（Oliver Smithies）、英国科学家马丁•埃文斯（Martin Evans）因为在利用胚胎干细胞对小鼠基因金星定向修饰原理方面的系列发现分享了2007年诺贝尔生理学或医学奖。
基因敲除技术从此得到关注和肯定，并对医学生物学研究做出了重大贡献。
本文就基因敲除的研究进展作一个简单的综述。
关键词基因敲除、RNAi、生物模型、同源重组前言基因敲除又称基因打靶，该技术通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组，进行精确的定点修饰和基因改制，具有转移性强、染色体DNA可与目的片段共同稳定遗传等特点。
应用DNA同源重组技术将灭活的基因导入小鼠胚胎干细胞（embryonic stem cells，ES cells）以取代目的基因，再筛选出已靶向灭活的细胞，微注射入小鼠囊胚。
该细胞参与胚胎发育形成嵌合型小鼠，再进一步传代培育可得到纯合基因敲除小鼠。
基因敲除小鼠模型的建立使许多与人类疾病相关的新基因的功能得到阐明，使现代生物学及医学研究领域取得了突破性进展。
上述起源于80年代末期的基因敲除技术为第一代技术，属完全性基因敲除，不具备时间和区域特异性。
关于第二代区域和组织特异性基因敲除技术的研究始于1993年。
Tsien等[1]于1996年在《Cell》首先报道了第一个脑区特异性的基因敲除动物，被誉为条件性基因敲除研究的里程碑。
该技术以Cre/LoxP系统为基础，Cre在哪种组织细胞中表达，基因敲除就发生在哪种组织细胞中。
2000年Shimizu等[2]于《Science》报道了以时间可调性和区域特异性为标志的第三代基因敲除技术，其同样以Cre/LoxP系统为基础，利用四环素等诱导Cre的表达。
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人诱导性多能干细胞的维持 -注意事项
• 何时传代 一般来说，日常传代不要超过一周，因为太大 的克隆中间容易分化，导致下一代分化克隆变多。 若是克隆中间开始发黄，就应该立即传代。 传代时接种细胞的密度要合适。 一般经验是，无饲养层条件下四天传代，有饲 养层条件六天传代。要是传代时克隆汇合度不高， 可以缩小传代比例。
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人诱导性多能干细胞的维持 -注意事项
• 饲养层细胞的选择和密度
小鼠胚胎成纤维细胞CF-1、CD1/ICR，以及其他 有报道的品系。 某些人成纤维细胞，可以参照已发表的细胞系， 也可以开发新的。 饲养层细胞的密度要适中：过密时接种的人诱导 性多能干细胞不易贴壁，并且生长缓慢，培养基 营养消耗多快；过稀时对多能干细胞的支持能力 不够，会导致细胞分化。需要自己摸索调整。
多能性
自我更新
无限扩增
James A. Thomson 1998
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背景介绍-成体干细胞
• 成体干细胞是指存在于一种已 经分化组织中的未分化细胞， 这种细胞能够自我更新并且能 够特化形成组成该类型组织的 细胞。成体干细胞存在于机体 的各种组织器官中。成年个体 组织中的成体干细胞在正常情 况下大多处于休眠状态，在病 理状态或在外因诱导下可以表 现出不同程度的再生和更新能 力。
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第三部分 人诱导性多能干细胞的维持
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人诱导性多能干细胞的维持 -注意事项
• 日常维护不推荐使用抗生素 一旦建立起人诱导性多能干细胞，获得一定数 量的培养物后，就应该停止使用抗生素了，这也 包括在制备饲养层细胞时不添加抗生素。这样可 以及时发现污染，避免可能存在的污染物对细胞 的长期影响。 • 定期做支原体检测，保证入库保存的诱导性多能 干细胞无支原体污染。
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人诱导性多能干细胞鉴定 -形态鉴别和AP染色
On feeder (100×) AP staining(40×) Matrigel (200×)
扁平，较高核质比 AP染色呈阳性
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人诱导性多能干细胞鉴定
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Day 4 Day 30 AP stain GFP On feeder SKOM Pick up AP staining C20P1 Colonies
部分结果展示
C20P6 No feeder
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第二部分 人诱导性多能干细胞的鉴定
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人诱导性多能干细胞的建立 -多能性因子的选择
各式各样的“鸡尾酒”
OCT4+SOX2+KLF4+cMYC (2007 Cell) OCT4+SOX2+NANOG+LIN28 (2007 Science) OCT4+SOX2+cMYC (2008 NBT) OCT4+SOX2+KLF4+cMYC+SV40LT+TERT (2008 Nature) OCT4+SOX2+KLF4+cMYC+NANOG+LIN28 (2008 Cell research) OCT4+SOX2+KLF4+cMYC+NANOG+LIN28+SV40LT (2009 Science) OCT4 (2009，2010) 现在，这些转录因子的小分之替代物已经相继被报道出来。 无需转录因子，仅依靠miRNA也可也实现重编程（2011 Cell Stem Cell）
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人诱导性多能干细胞的维持 -注意事项
• 细胞复苏率低 是正常的，所以冻存的时候尽可能多冻一些。 我们现在采用冻存Matrigel上的克隆，复苏 时成活率一般可达50%左右，与Y27632联合使用会 提高复苏成活率。 但是前提是冻存时细胞状态要好。建议专门冻 存细胞，不要冻实验剩下的。
多能干细胞
Oct4 Sox2 Klf4 cMyc
Yamanaka S 2007 体细胞
Oct4 Sox2 Nanog Lin28 Yu JY & Thomson JA 2007
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背景介绍： 人诱导性多能干细胞技术的前景
人诱导性多能干细胞的应用： 1. 疾病模型，研究疾病发生，搭建 筛药平台。 2. 细胞治疗 “用你的细胞定做器官” （Konrad Hochedlinger，《环球科学》 2010）
• 培养方法的改进 低氧 5% O2（2009 Cell stem Cell）
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人诱导性多能干细胞的建立-技术流程
• 流程图
Cell Stem Cell,2009
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人诱导性多能干细胞的建立-克隆挑取
神经干细胞 造血干细胞 间充质干细胞 内皮干细胞 „„
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背景介绍： 细胞核的全能性-体细胞重编程研究
核移植 技术 细胞融 合技术 直接导入外源多 能性因子的重编 程技术
Shinya Yamanaka 2006,2007
Sir John Bertrand Gurdon 1962
Masa Tada 2001
带有多能性选择标记的 小鼠（Fbx-,Oct4-, Nanog- geo) Oct4Oct4 Sox2 Myc Klf4
病毒感染/抗性选择
胚胎材料，伦理问题
带有选择标记的成体细胞
iPSCs
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背景介绍： 人诱导性多能干细胞技术的诞生
46XX
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人诱导性多能干细胞鉴定
-拟胚体畸胎瘤形成实验验证分化潜能
iPS EB Day5
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人诱导性多能干细胞鉴定
- 基因芯片显示与胚胎干细胞的相似程度
iPS-1
iPS-2
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可挑克隆-有光滑边缘，胚胎干细胞样
一次性玻璃巴氏吸管， 需制备圆口（切割， 剥离）和断口（吸取） 两种
处理好 的巴氏 吸管
口吸管
灭菌枪头
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人诱导性多能干细胞的建立 -克隆的扩大培养
• 开始一到两代的时候建议使用机械法传代。若是 克隆均一性不好，需要挑取形态好的亚克隆继续 传代。 • 克隆数量较多，均一性好，且都具有良好的形态 时可以用酶法（dispase /Collagenase IV）开始 传代，扩大培养。
人诱导性多能干细胞的建立、鉴 定与维持
华南干细胞与再生医学研究所 中国科学院广州生物医药与健康研究院 讲解：陈燊（chen_shen@) 2011-8-24
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概
要
• 第一部分 人诱导性多能干细胞的建立 • 第二部分 人诱导性多能干细胞的鉴定 • 第三部分 人诱导性多能干细胞的维持 • 第四部分 开放性讨论
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人诱导性多能干细胞的维持 -注意事项
• 无饲养层培养还是有饲养层培养？ Matrigel/ECM与mTeSR1联合使用可以支持人胚 胎干细胞的生长，可以支持人诱导性多能干细胞。 成分清楚，批次间差异小，操作方便，但是成本 较高。 饲养层培养方式是较传统的方式，成本较无饲 养层方式低廉，但需要制备优质的饲养层细胞。 • bFGF用量 4ng/ml-100ng/ml都有人在使用，主要 由不同生产者的bFGF 对细胞的支持效果决定，需 要自己摸索。
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人诱导性多能干细胞的建立 -诱导体系的选择
• 传统的胚胎干细胞培养条件能够支持体细胞完 成重编程，成为诱导性多能干细胞，但是效率 低。 • 一些小分子化合物的加入可以加速重编程过程， 并且可以提高重编程的效率。
VPA（2008 NBT） Vc（2009 Cell Stem Cell）
中国科学院 广州生物医药与健康研究院
GIBH.CAS
人诱导性多能干细胞的维持 -注意事项
• 细胞团还是单细胞
越来越多的文献在报道将人胚胎干细胞制备成 单细胞进行传代，与ROCK inhibitor(Y27632)使 用是可以的，但是这种情况一般适用于均一无分 化的克隆传代。单细胞传代时需要较高的接种密 度。通常我们接种10,000cells/cm2. • ROCK inhibitor(Y27632) 工作浓度为10uM，可以促进细胞贴壁。接种时 使用，直接加到培养集中。看到两三个细胞成团 时可以撤掉。
-qPCR检测内源多能性基因与转基因表达水平
中国科学院 广州生物医药与健康研究院
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人诱导性多能干细胞鉴定 -多能性标志物的检测
TRA-1-81
SSEA4
TRA-1-60
Nanog
SSEA3
中国科学院 广州生物医药与健康研究院