利用免疫共沉淀技术研究RSVCP_SP和NSvc4蛋白的互作

农业生物技术学报ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２００８，１６（５）：８９１￣８９７＊基金项目：国家重点基础研究发展规划（９７３）项目（Ｎｏ．２００６ＣＢ１００２０３）、教育部博士点专项科研基金（Ｎｏ．２００４０３８９００２，２００５０３８９００６）和国家自然科学基金（Ｎｏ．３０６７１３５７）资助。

＊＊通讯作者。Ａｕｔｈｏｒｆｏｒｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ．谢联辉，教授，主要从事植物病毒学研究。Ｅ－ｍａｉｌ：＜ｆｊｘｌｈ＠１２６．ｃｏｍ＞；

吴祖建，副研究员，主要从事植物病毒学研究。

Ｅ－ｍａｉｌ：＜ｗｕｚｕｊｉａｎ＠１２６．ｃｏｍ＞．

收稿日期：２００８－０１－２３接受日期：

２００８－０２－２７

·研究论文·利用免疫共沉淀技术研究ＲＳＶＣＰ、

ＳＰ和ＮＳｖｃ４蛋白的互作＊

鹿连明，秦梅玲，王萍，兰汉红，牛晓庆，谢荔岩，吴祖建＊＊，谢联辉＊＊（福建农林大学植物病毒研究所，福建省植物病毒学重点实验室，福州３５０００２）

摘要：为了检测水稻条纹病毒（Ｒｉｃｅｓｔｒｉｐｅｖｉｒｕｓ，ＲＳＶ）外壳蛋白（ｃｏａｔｐｒｏｔｅｉｎ，ＣＰ）、病害特异蛋白（ｄｉｓｅａｓｅ－ｓｐｅｃｉａｌｐｒｏｔｅｉｎ，ＳＰ）和可能的运动蛋白ＮＳｖｃ４自身和两两之间的互作关系，首先通过ＰＣＲ扩增获得了分别融合有ＨＡ或ｃ－Ｍｙｃ标签的ＲＳＶＣＰ、

ＳＰ和ＮＳｖｃ４基因，并将其插入到植物表达载体ｐＥＧＡＤ或ｐＫＹＬＸ７１：３５Ｓ２中。重组质粒转化根癌农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅ－ｆａｃｉｅｎｓ）ＥＨＡ１０５后，将含有不同重组质粒的根癌农杆菌菌液混合后注射烟草（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）

叶片。提取烟草中瞬时表

达的蛋白，以ＨＡ或ｃ－Ｍｙｃ抗体进行免疫共沉淀试验，最后免疫混合物通过ｃ－Ｍｙｃ抗体或ＨＡ抗体进行Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测，确定蛋白的互作情况。结果表明，ＲＳＶＣＰ蛋白自身能够发生互作，而ＣＰ与ＳＰ，ＣＰ与ＮＳｖｃ４，ＳＰ与ＳＰ，ＳＰ与ＮＳｖｃ４，及ＮＳｖｃ４与ＮＳｖｃ４蛋白之间均未有检测到互作现象

。

关键词：水稻条纹病毒；免疫共沉淀；蛋白互作中图分类号：Ｓ１８８文献标识码：Ａ文章编号：

１００６－１３０４（２００８）０５－０８９１－０７

ＳｔｕｄｉｅｓｏｎｔｈｅＩｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｂｅｔｗｅｅｎＲＳＶＣＰ，ＳＰａｎｄＮＳｖｃ４ＰｒｏｔｅｉｎｓＵｓｉｎｇＣｏ－ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ

ＬＵＬｉａｎ－ｍｉｎｇ，ＱＩＮＭｅｉ－ｌｉｎｇ，ＷＡＮＧＰｉｎｇ，ＬＡＮＨａｎ－ｈｏｎｇ，ＮＩＵＸｉａｏ－ｑｉｎｇ，ＸＩＥＬｉ－ｙａｎ，ＷＵＺｕ－ｊｉａｎ＊＊，ＸＩＥＬｉａｎ－ｈｕｉ＊＊（ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＰｌａｎｔＶｉｒｏｌｏｇｙ，ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＰｌａｎｔＶｉｒｏｌｏｇｙｏｆＦｕｊｉａｎＰｒｏｖｉｎｃｅ，ＦｕｊｉａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｆｕｚｈｏｕ３５０００２，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＩｎｏｒｄｅｒｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎＲｉｃｅｓｔｒｉｐｅｖｉｒｕｓ（ＲＳＶ）ｃｏａｔｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＰ），ｄｉｓｅａｓｅ－ｓｐｅｃｉａｌｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＰ）ａｎｄ

ＮＳｖｃ４，ｔｈｅＨＡ－ｔａｇｇｅｄｏｒｃ－Ｍｙｃ－ｔａｇｇｅｄＣＰ，ＳＰａｎｄＮＳｖｃ４ｏｆＲＳＶｗｅｒｅａｍｐｌｉｆｉｅｄｂｙＰＣＲ，ａｎｄｔｈｅｎｉｎｓｅｒｔｅｄｉｎｔｏｐｌａｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐＥＧＡＤｏｒｐＫＹＬＸ７１：３５Ｓ２．ＴｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｓｗｅｒｅｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓＥＨＡ１０５，ａｎｄｔｈｅＥＨＡ１０５ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｄｉｆｆｅｒｅｎｔｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｗａｓｉｎｊｅｃｔｅｄｉｎｔｏＮｉｃｏｔｉａｎａｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ．ＴｈｅｔｏｔａｌｐｒｏｔｅｉｎｓｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｉｎｆｉｌｔｒａｔｅｄＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａｌｅａｖｅｓ，ａｎｄｃｏ－ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｄｗｉｔｈＨＡｏｒｃ－Ｍｙｃａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｔｈｅｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｌｅｘｅｓ

ｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｗｉｔｈｃ－ＭｙｃｏｒＨＡａｎｔｉｂｏｄｙｔｏｉｄｅｎｔｉｆｙｔｈｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｓｅｐｒｏｔｅｉｎｓ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＲＳＶＣＰｃｏｕｌｄｉｎｔｅｒａｃｔｗｉｔｈｉｔｓｅｌｆ，ｂｕｔｎｏｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｏｆＣＰｗｉｔｈＳＰ，ＣＰｗｉｔｈＮＳｖｃ４，ＳＰｗｉｔｈＳＰ，ＳＰｗｉｔｈＮＳｖｃ４，ａｎｄＮＳｖｃ４ｗｉｔｈＮＳｖｃ４ｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｒｉｃｅｓｔｒｉｐｅｖｉｒｕｓ；ｃｏ－ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ；ｐｒｏｔｅｉｎｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ

水稻条纹叶枯病是我国水稻产区广泛分布的重要病毒病害之一，给水稻生产带来了严重的危害。该病病原为水稻条纹病毒（Ｒｉｃｅｓｔｒｉｐｅｖｉｒｕｓ，ＲＳＶ），是纤细病毒属（Ｔｅｎｕｉｖｉｒｕｓ）的代表成员，由昆虫介体灰飞虱（Ｌａｏｄｅｌｐｈａｘｓｔｒｉａｔｅｌｌｕｓ）以持久方式经卵传播（谢联辉，２００１），具有很广的寄主范围，可以侵染１６个属８０多种的禾本科植物（阮义理等，１９８４）。ＲＳＶ是一种多组分ＲＮＡ病毒，其基因组由４种单链ＲＮＡ农业生物技术学报２００８年组成，分别编码ＲＮＡ聚合酶、Ｐ２３（ＮＳ２）蛋白、ＮＳｖｃ２、ＮＳ３、外壳蛋白（ｃｏａｔｐｒｏｔｅｉｎ，ＣＰ）、病害特异蛋白（ｄｉｓｅａｓｅ－ｓｐｅｃｉａｌｐｒｏｔｅｉｎ，ＳＰ）和ＮＳｖｃ４等７种蛋白。其中ＣＰ为外壳蛋白，由ＲＮＡ３负链编码。免疫胶体金技术研究发现，ＣＰ在寄主组织细胞中广泛存在，不仅存在于叶绿体和细胞质中，在细胞核中也有分布（刘利华等，１９９９，２０００）。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测发现该蛋白在带毒介体灰飞虱体内也有存在（曲志才等，１９９９）。这些表明ＲＳＶＣＰ极有可能是该病毒重要的致病性蛋白。ＳＰ是一种非结构性蛋白，由ＲＮＡ４编码。ＲＳＶ侵染寄主后的各个时期内都能检测到ＳＰ的存在，它在病叶中大量积累，形成形态各异的内含体，且其含量的高低与水稻品种的抗性和症状表现有着密切的关系（林奇田等，１９９８）。对ＲＳＶ在灰飞虱体内的亚细胞定位的研究表明，ＳＰ蛋白可分布在卵巢、卵壳表面、中肠内腔和柱形细胞等多个器官中（吴爱忠等，２００１）。Ｒａｍｉｒｅｚ和Ｈａｅｎｎｉ（１９９４）在对纤细病毒属的ＳＰ和烟草脉斑驳病毒（Ｔｏｂａｃｃｏｖｅｉｎｍｏｔｔｌｉｎｇｖｉｒｕｓ，ＴＶＭＶ）编码的蚜虫传播辅助因子的氨基酸序列比对后推测，ＳＰ可能参与了介体昆虫的传毒过程。Ｓｔｅｗａｒｔ和Ｂａｎｅｒｊｅｅ（１９９９）认为ＳＰ可能在病毒与昆虫介体最初的识别过程中起作用。ＮＳｖｃ４蛋白由病毒的ＲＮＡ４负链编码，与３０ｋＤ运动蛋白大家族的结构具有相似性（Ｍｅｌｃｈｅｒ，２０００），利用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ技术均可以在病叶和带毒虫体内检测到这个蛋白（曲志才等，１９９９），因此现有研究推测ＮＳｖｃ４蛋白有可能是ＲＳＶ的运动蛋白。ＲＳＶＣＰ和ＳＰ均存在于ＲＳＶ侵染的水稻细胞质和叶绿体中，且叶绿体中ＣＰ和ＳＰ的含量同植株褪绿花叶症状的严重度密切相关（刘利华等，１９９９；林奇田等，２０００）。因此推测，ＲＳＶＣＰ和ＳＰ作为病毒致病相关蛋白，能侵染水稻叶绿体，从而引发寄主产生褪绿条纹症状。但是目前尚不清楚ＲＳＶ侵染后所引起的寄主病害症状是由ＣＰ或ＳＰ单独作用所致，还是两者共同作用抑或与其它核酸或蛋白协同作用的结果。另外，ＲＳＶ抗血清免疫胶体金标记显示，在水稻叶肉组织细胞壁的胞间连丝中存在ＣＰ（刘利华等，１９９９，２０００），据此推测ＣＰ也可能与病毒的运输有关，ＲＳＶＭＰ极有可能是和ＣＰ协同起作用的。而ＮＳｖｃ４是否是ＲＳＶ的运动蛋白，及其与ＣＰ和ＳＰ之间的关系是怎样，尚需要深入研究。免疫共沉淀（ｃｏ－ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。本研究利用免疫共沉淀技术，初步检测了植物细胞内ＲＳＶＣＰ、ＳＰ和ＮＳｖｃ４蛋白自身和两两之间的互作情况，为建立病毒编码蛋白的关系图谱及深入研究这３个蛋白在灰飞虱传毒及ＲＳＶ致病过程中的作用提供了依据

。

１材料和方法

１．１材料１．１．１菌株和质粒大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＤＨ５α和根癌农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＥＨＡ１０５为本实验室保存。克隆载体ｐＭＤ１８－Ｔ购自

大连ＴａＫａＲａ公司。植物表达载体ｐＫＹＬＸ７１：３５Ｓ２为本实验室保存，ｐＥＧＡＤ载体由福建农林大学真菌实验室王宗华研究员惠赠。重组载体ｐＧＢＫ－ＣＰ、

ｐＧＡＤ－ＣＰ、ｐＧＢＫ－ＳＰ、ｐＧＡＤ－ＳＰ、ｐＧＢＫ－ＮＳｎｖ４和

ｐＧＡＤ－ＮＳｎｖ４由本实验室构建（鹿连明等，２００７）并

保存。

１．１．２ＰＣＲ引物根据ｐＧＡＤＴ７和ｐＧＢＫＴ７载体

序列，设计用于扩增带有ＨＡ或ｃ－Ｍｙｃ标签的ＲＳＶＣＰ、ＳＰ和ＮＳｖｃ４基因的特异引物

：

Ｐ１：５＇－ＧＧＡＡＴＴＣＡＡＧＣＴＴＡＴＧＧＡＧＴＡＣＣＣＡＴＡＣＧＡＣＧ－３＇ＥｃｏＲⅠ和Ｈｉｎｄ

Ⅲ

Ｐ２：５＇－ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＴＴＴＣＡＧＴＡＴＣＴＡＣＧＡＴＴＣＡＴ－３＇ＢａｍＨⅠ和ＸｂａⅠ

Ｐ３：５＇－ＧＧＡＡＴＴＣＡＡＧＣＴＴＡＴＣＡＴＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＡＡＧＣＴＧ－３＇ＥｃｏＲⅠ和Ｈｉｎｄ

Ⅲ

Ｐ４：５＇－ＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＡＧＧＧＧＴＴＡＴＧＣＴＡＧＴＴＡＴＧＣ－３＇ＢａｍＨⅠ和ＸｂａⅠ

Ｐ５：５＇－ＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣＴＣＡＧＧＧＧＴＴＡＴＧＣＴＡＧＴＴＡＴＧ－３＇ＢａｍＨⅠ和ＳａｃⅠ

设计的引物送宝生物（大连）工程有限公司合成。

１．１．３主要试剂Ｅｘ－ＴａｑＤＮＡ聚合酶和Ｔ４ＤＮＡ连接酶购自大连ＴａＫａＲａ公司；各种限制性内切酶及ＮＢＴ和ＢＣＩＰ购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＵＳＡ）；ＨＡ和ｃ－Ｍｙｃ单克隆抗体及ｐｒｏｔｅｉｎＧｐｌｕｓ－ａｇａｒｏｓｅｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎｒｅａｇｅｎｔ均购自

ＳａｎｔａＣｒｕｚ公司（ＳａｎｔａＣｒｕｚ，ＵＳＡ）；ＰＶＤＦ膜购自

Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司（Ｂｏｓｔｏｎ，ＵＳＡ）；碱性磷酸酶标记的羊

抗鼠ＩｇＧ购自Ｓｉｇｍａ公司（ＳａｉｎｔＬｏｕｉｓ，ＵＳＡ）。

１．２方法１．２．１目的基因的扩增和克隆分别以重组子ｐＧＡＤ－ＣＰ、ｐＧＡＤ－ＳＰ和ｐＧＡＤ－ＮＳｎｖ４为模板，以