大鼠超氧化物歧化酶(SOD)酶联免疫分析
动物血中超氧化物歧化酶的提取及活力测定一
动物血中超氧化物歧化酶的提取及活力测定目的学会从动物血中提取超氧化物歧化酶SOD。
掌握用邻苯三酚法测定超氧化物歧化酶SOD活性的原理及方法。
原理超氧化物歧化酶别名肝蛋白、奥谷蛋白，简称：SOD。
SOD是一种源于生命体的活性物质，能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质。
SOD具有特殊的生理活性，是生物体内清除自由基的首要物质。
SOD在生物体内的水平高低意味着衰老与死亡的直观指标；现已证实，由氧自由基引发的疾病多达60多种。
它可对抗与阻断因氧自由基对细胞造成的损害，并及时修复受损细胞，复原因自由基造成的对细胞伤害。
由于现代生活压力，环境污染，各种辐射和超量运动都会造成氧自由基大量形成；因此，生物抗氧化机制中SOD的地位越来越重要！目前，研究开发最多的资源还是从动物血液、动物组织中制备提纯SOD。
在一般情况下，SOD酶活性测定只能应用间接活性测定法。
邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出O2 -，生成带色的中间产物，反应开始后反应液先变成黄棕色，几分钟后转绿，几小时后又转变成黄色，这是因为生成的中间物不断氧化的结果。
这里测定的是邻苯三酚自氧化过程中的初始阶段，中间物的积累在滞留30～45s后，与时间成线性关系，一般线性时间维持在4min的范围内，中间物在420nm波长出有强烈光吸收。
当有SOD存在时，由于它能催化O2 -与H+结合生成O2和H2O2，从而阻止了中间产物的积累，因此，通过计算即可求出SOD的酶活性。
酶活力单位定义：在25℃恒温条件下，每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯酚自氧化率达50%的酶量定义为1个酶活力单位。
1、试剂（1）3.8%（质量分数）柠檬酸三钠（2）0.9%（质量分数）氯化钠（3）95%（体积分数）乙醇（4）氯仿（5）丙酮（6）pH8.2、50mmol/L Tris-HCl称取Tris 0.61g，EDTA-2Na 0.037g，用双蒸水溶解至80mL左右，用HCl调节pH =8.20（用pH计校正），最后定容至100mL。
缺血预处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤中超氧化物歧化酶(SOD)、一
缺血预处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤中超氧化物歧化酶（SOD）、一氧化氮（NO）及超微结构的影响发表时间：2016-04-28T14:50:34.820Z 来源：《徐州医学院学报》2015年11月第35卷总第21期作者：焦秀萍张淼马克杰薛同敏张杰陶立德[导读] 扬州大学第二临床医学院缺血/再灌注可对肝脏细胞超微结构造成严重损伤，使线粒体评分分值增加，造成肝脏损害。
（扬州大学第二临床医学院江苏扬州 215000）【摘要】目的：研究缺血预处理(IP)对大鼠肝脏缺血再灌注(I/R)损伤中超氧化物歧化酶（SOD）、一氧化氮（NO）及超微结构的影响。
方法：健康成年雄性SD大鼠随机分为3组(每组5只)。
正常组(N组)；缺血再灌注(I/R)组；缺血预处理(IP)组。
各组均在术后3h后取组织进行检测。
酶标仪检测肝脏匀浆超氧化物歧化酶（SOD）及一氧化氮（NO）的含量；用透射电子显微镜观察各组心肌组织的超微结构，并进行线粒体评分。
结果：与单纯I/R相比，IP预处理明显增加SOD含量同时减少NO释放 (P<0.05)；电镜显示肝癌细胞N组结构正常，I/R组损伤最严重，IP组介于N组与I/R组之间。
N组、IP组线粒体评分均低于I/R组(P<0.05)。
结论：缺血/再灌注可对肝脏细胞超微结构造成严重损伤，使线粒体评分分值增加，造成肝脏损害。
缺血预处理可产生肝脏保护作用。
【关键词】肝脏缺血再灌注；缺血预处理；SOD、NO；超微结构肝脏缺血预处理（IP）是指一次或多次短暂性肝脏缺血再灌注后．诱导肝脏组织产生内源性保护机制，使其对以后较长时间的缺血性损伤产生显著的耐受[1]。
本实验旨在探究IP减轻大鼠肝脏I/R损伤的相关机制，SOD、NO，线粒体超微结构激的影响。
1.材料与方法1. 1实验动物分组：健康雄性SD大鼠,鼠龄10-12周, 体质量250-300g, 共15只，随机分为3组(每组5只)。
所有动物术前12h禁食，自由进水，采用戊巴比妥麻醉，固定动物，常规脱毛消毒。
超氧化物歧化酶(SOD)的发现及其应用
超氧化物歧化酶（SOD）的发现及其应用早在1930年，Keilin和Mann就发现了SOD，不过，当时他们仅认为是一种蛋白质，并命名为血铜蛋白。
直到1969年，McCord和Fridovich在研究对黄嘌呤氧化酶时，发现SOD具有酶的活性，并正式把它命名为superoxidedismutse，中文名即为超氧化物歧化酶。
超氧化物歧化酶一、超氧化物歧化酶（SOD）分类及作用根据分子中所含的金属辅基不同，SOD可分为Cu，Zn-SOD，Fe-SOD，Mn-SOD 和Ni-SOD四类。
其中Cu，Zn-SOD主要存在于真核细胞的细胞浆中，如猪血、鸭血、猪肝等动物血液和内脏器官等组织中；Mn-SOD存在于真核细胞的线粒体、细菌中；Fe-SOD只存在于原核细胞中，如海藻中的螺旋藻、铁钉叶等；Ni-SOD 是最近发现只存在于某些极少数原核细菌中。
SOD是机体内天然存在的超氧自由基清除因子，它可以把有害的超氧自由基转化为过氧化氢和氧气，生成的过氧化氢会被过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)分解为完全无害的水。
因而SOD是机体内防止自由基损伤的第一道防线，，是生物体内最重要的抗氧化酶。
SOD作为机体内最有效、最重要的抗氧化酶之一，能有效清除老年机体代谢过程中所产生的超氧自由基，延缓衰老。
二、自由基自由基是一类非常活跃的化学物质，是个有不成对（奇数）电子的原子或原子团。
其中最重要的是超氧自由基，它可聚集体表、心脏、血管、肝脏和脑细胞中。
如果沉积在血管壁上，会使血管发生纤维性病变，导致动脉管硬化，高血压，心肌梗塞；沉积在脑细胞时，会引起老年人神经官能不全，导致记忆、智力障碍以及抑郁症，甚至老年性痴呆等，是造成人类衰老和疾病的元凶。
而在衰老的皮肤和脑中存在的脂褐素和蜡样质,可使皮肤变黑和粗糙，这两种物质也是由自由基引起。
SOD作为机体内天然存在的超氧自由基清除因子，可以有效地清除人体内的超氧自由基，因而在疾病治疗、食品及日用化学中有广泛的应用。
氧化损伤修复实验报告(3篇)
第1篇一、实验背景氧化损伤是生物体内常见的生理和病理现象，指生物分子如蛋白质、脂质和DNA等在氧化应激条件下发生氧化反应，导致生物活性降低或功能丧失。
氧化损伤修复是生物体维持内环境稳定的重要过程。
本研究旨在探究氧化损伤修复机制，并评估其治疗效果。
二、实验材料1. 实验动物：成年雄性SD大鼠，体重180-220g。
2. 试剂与仪器：- 氧化损伤诱导剂：Fenton试剂- 氧化损伤修复剂：N-乙酰半胱氨酸（NAC）- 生化试剂盒：SOD、MDA、GSH等- 分光光度计- 低温离心机- 高速冷冻离心机- 培养箱- 电子显微镜三、实验方法1. 动物分组与处理：将SD大鼠随机分为四组，每组10只，分别为对照组、氧化损伤组、氧化损伤+NAC处理组、氧化损伤+NAC+抗氧化剂处理组。
氧化损伤组给予Fenton试剂诱导氧化损伤，氧化损伤+NAC处理组和氧化损伤+NAC+抗氧化剂处理组在给予Fenton试剂后分别给予NAC和抗氧化剂处理。
2. 生化指标检测：- 超氧化物歧化酶（SOD）活性：采用SOD测定试剂盒，通过分光光度法检测。
- 丙二醛（MDA）含量：采用MDA测定试剂盒，通过分光光度法检测。
- 谷胱甘肽（GSH）含量：采用GSH测定试剂盒，通过分光光度法检测。
3. 生物学效应观察：- 光镜观察：取肝脏组织，进行苏木精-伊红染色，观察细胞形态变化。
- 电子显微镜观察：取肝脏组织，进行透射电镜观察，观察细胞超微结构变化。
四、实验结果1. 生化指标检测：- 氧化损伤组SOD活性显著降低，MDA含量显著升高，GSH含量显著降低。
- 氧化损伤+NAC处理组SOD活性显著升高，MDA含量显著降低，GSH含量显著升高。
- 氧化损伤+NAC+抗氧化剂处理组SOD活性、MDA含量和GSH含量均显著改善。
2. 生物学效应观察：- 光镜观察：氧化损伤组细胞出现肿胀、变性等损伤现象，氧化损伤+NAC处理组细胞损伤程度减轻。
- 电子显微镜观察：氧化损伤组细胞线粒体肿胀、嵴断裂，氧化损伤+NAC处理组细胞线粒体形态恢复。
超氧化物歧化酶与畜禽氧化应激
程皇座动物氧化应激是指动物体内产生过多的自由基引发机体氧化还原平衡失调的现象，是引起动物疾病和降低生产性能的重要原因之一[1]。
这是因为氧化应激产生的活性氧自由基积累过多，超过了体内抗氧化酶系统的清除能力，而过量自由基会攻击细胞中的脂质、蛋白质和DNA 等生物大分子，对细胞造成不可逆转的伤害，从而影响动物生理机能。
在防止氧自由基对细胞破坏的抗氧化系统中，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)在保护细胞免受氧自由基的攻击中发挥重要作用[2]。
1 SOD 的发现与分类1930年，Keilin 和Mann 研究发现了SOD，不过当时认为SOD 是一种蛋白质，并命名为血铜蛋白。
1969年，McCord 和Fridovich 发现该蛋白具有酶的活性，并正式命名为超氧化物歧化酶[3]。
SOD 是一种金属酶，催化中心含有一个金属离子，根据金属离子的不同，SOD 家族可以分为4种类型：Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD 和Ni-SOD。
其中Cu/Zn-SOD 主要存在于真核细胞的细胞质和叶绿体以及细菌的细胞质和周质空间中；Mn-SOD 主要存在于原核生物和真核生物的线粒体中；Fe-SOD 存在于原核生物和少数植物中；Ni-SOD 主要存在于链霉菌属细菌及蓝细菌等海洋生物中[4-5]。
2 SOD 生物学重要性SOD 对呼吸细胞的存活至关重要。
氧是一切生命活动的基础物质之一，但氧在参与机体生命代谢活动中会转化成氧自由基，为应对自由基氧化损伤，细胞需要SOD 来清除氧自由基。
对大量微生物的调查表明，很多需氧和耐氧生物均含有SOD。
SOD 通过抗氧化途径在防御氧中毒、抗辐射损伤、预防衰老、治疗疾病等方面发挥重要作用[6]。
3 SOD 抗氧化机理自由基是一些单独存在的具有不配对电子的分子、原子、离子或原子团，其显著特征是外层轨道上具有未配对的电子。
由于电子倾向于配对，中图分类号：S816 文献标志码：A 文章编号：1001-0769(2024)02-0093-04摘 要：超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)能够清除各类生物体内因氧化应激产生的过多自由基，通过歧化反应将氧自由基转化为氧气和过氧化氢。
超氧化物歧化酶（SOD）活性检测试剂盒说明书
Beijing Solarbio Science & Technology Co., LtdTel: 400-968-6088超氧化物歧化酶（SOD）活性检测试剂盒说明书微量法注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。
货号：BC0175规格：100T/48S产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。
试剂名称规格保存条件提取液液体110 mL×1瓶2-8℃保存试剂一液体5 mL×1瓶2-8℃保存试剂二液体100 μL×1支2-8℃保存试剂三液体4 mL×1瓶2-8℃保存试剂四液体0.25mL×1支2-8℃保存溶液的配制：1、试剂二：使用前先离心再吹打混匀。
根据样本量将试剂二用蒸馏水稀释10倍后使用，当天用完。
2、试剂四：根据样本量将试剂四用蒸馏水稀释5倍后使用，当天用完。
产品说明：SOD（EC 1.15.1.1）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，催化超氧化物阴离子发生歧化作用，生成H2O2和O2。
SOD不仅是超氧化物阴离子清除酶，也是H2O2主要生成酶，在生物抗氧化系统中具有重要作用。
通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子(O2-)，O2-可还原氮蓝四唑生成蓝色甲臜，后者在560nm 处有吸收；SOD可清除O2-，从而抑制了甲臜的形成；反应液蓝色越深，说明SOD活性愈低，反之活性越高。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。
如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、细胞超声破碎仪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）1.细胞、细菌样本：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清，按照每500万细菌或细胞加入1mL提取液，超声波破碎（功率200w，超声3s，间隔10s，重复30次）。
左有权讲座之超氧化物歧化酶(SOD)临床应用——(SOD治疗各种疾病作用与原理)
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SOD（超氧化物歧化酶）—湿疹和皮炎的改善作用
皮炎或是湿疹都是由于外界或内在各种刺激因素所引起的皮肤的炎症反应。机体的炎 症反应必然有吞噬细胞参与，同时产生超氧阴离子（O2—·），从而对皮肤造成强烈 的刺激和操作。皮肤炎症过程产生的大量自由基，使皮疹、皮炎、粉刺难于治愈。
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超氧化物歧化酶（SOD）与年龄、疾病的关系
1、美国老化医学学会（American Aging Associ etion）的报告指出对不同年龄组的6418例健康人的SOD活性进行 测定，发现年龄与SOD含量具有密切相关性。随着年龄的增大，人体SOD活性将逐渐下降。人的免疫功能也随之下 降，易得各种疾病。40岁是一个重要年龄段，体态发胖，出现黑斑就是自由基过剩的反应。研究报告指出：60岁以 上的老人体内SOD含量仅为年青人的50%左右，糖尿病人SOD含量是正常人的45%，而肿瘤患者体内SOD值不到 正常人的三分之一。所以体外补充适量的SOD，是保持肌体活力，延缓衰老的重要措施之一。 2、SOD与疾病 医学研究证明：SOD与多种疾病相关，是百病之源，如肿瘤、糖尿病、心脑血管疾病、骨关节炎、心肌炎、免疫 力低下疾病，特别是免疫下降引起的类风湿、红斑狼疮等病。 目前SOD作为药用酶在美国、德国、日本、澳大利亚等国已在临床应用在自身免疫疾病上，如类风湿性关节炎、 红斑狼疮等疾病治疗，不论是口服还是肌肉注射取得十分明显疗效。在治疗心肌缺血症与缺血再灌注综合症及某些 心血管疾病方面也取得重要成果。在用做抗辐射、抗肿瘤、心肌炎、早产婴儿氧中毒症的解毒药也取得重要进展。 在临床上，也开始应用SOD，用来辅助放疗和化疗，以降低大剂量照射引起副作用，效果极为明显。
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SOD（超氧化物歧化酶）—国内外临床应用
SOD检测的临床意义与应用
SOD检测的临床意义与应用SOD（超氧化物歧化酶）是一种重要的抗氧化酶，负责将体内产生的超氧自由基（O2•-）转化成较稳定的氧气（O2）和过氧化氢（H2O2），以保护细胞免受氧化损伤。
SOD检测对于评估机体抗氧化能力、研究氧化应激相关疾病，以及提供临床诊断、预后判断和治疗监测方面有着重要的临床意义和广泛的应用。
首先，SOD检测可用于评估机体抗氧化能力。
氧化应激是指存在过多的活性氧自由基与抗氧化防御系统失衡的状态，可导致细胞膜、DNA、蛋白质的氧化损伤，并参与多种疾病的发生发展。
SOD作为抗氧化防御系统的重要成员，其活性的测定可反映机体对抗氧化应激的能力。
通过测量SOD活性，可以评估机体的氧化应激水平，进而指导合理的抗氧化治疗和预防措施。
其次，SOD检测对研究氧化应激相关疾病具有重要意义。
多种疾病如肿瘤、心血管疾病、神经系统疾病等都与氧化应激过程密切相关。
SOD作为氧化应激的重要调节剂，其异常活性或表达有可能导致氧化应激过程的紊乱，从而对疾病的发生和发展产生重要影响。
因此，对于这些氧化应激相关疾病的研究，SOD活性的测定可以提供重要的指导和研究依据，帮助揭示氧化应激在疾病中的作用机制，为相关疾病的治疗和预防提供新的突破口。
此外，SOD检测可在临床诊断、预后判断和治疗监测中发挥重要作用。
在一些疾病中，如类风湿关节炎、糖尿病等，SOD活性的变化与疾病的进展、预后和治疗效果密切相关。
因此，通过对SOD活性的测定，可以提供疾病的诊断、预后和治疗效果的评估，指导临床治疗方案的制定和调整。
最后，SOD检测还可以应用于药物评价和抗氧化剂的筛选。
许多药物和抗氧化剂的疗效与其对机体抗氧化能力的调节紧密相关。
因此，通过测定药物或抗氧化剂对SOD活性的影响，可以评估其对机体氧化应激状态的调节能力，为药物疗效评价和抗氧化剂的筛选提供指导。
总之，SOD检测在评估机体抗氧化能力、研究氧化应激相关疾病、临床诊断预后和治疗监测以及药物评价等方面具有重要的临床意义和广泛的应用。
SOD检测意义
SOD检测意义
SOD超氧化物歧化酶的增高或降低可提示一些生理性或病理性
状态，也可判断药物及手术治疗效果等。
超氧化物歧化酶SOD可使自由基发生歧化反应，SOD与自由基水平呈现负相关，因此SOD可间接反映人体自由基代谢，监测肝病、心脑血管疾病、肿瘤、内分泌疾病等的患者体内的自由基水平，了解机体损伤情况以及治疗效果。
机体受到自由基损伤时，SOD水平会降低，可见于老年人以及锰、维生素等抗氧化营养素摄入不足等的生理性情况；也可见于脑梗死、脑出血、颅脑损伤、心梗等病理性状态；高压氧、放疗、再灌注治疗后也会有SOD降低。
一般对SOD进行实时动态监测会有较重要的疾病诊治参考价值，建议患者向专科医生咨询，遵医嘱进行检查和治疗。
小鼠超氧化物歧化酶(SOD)ELISA检测试剂应用方法
小鼠超氧化物歧化酶（SOD）ELISA检测试剂应用方法小鼠超氧化物歧化酶（SOD）ELISA检测试剂说明书检测原理试剂盒采纳双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。
往预先包被超氧化物歧化酶（SOD）抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻di洗涤。
用底物TMB 显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最后的黄色。
颜色的深浅和样品中的超氧化物歧化酶（SOD）呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品活性。
样品收集、处理及保存方法1.血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避开任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞快速当心地分别。
2.血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。
3000转离心30分钟取上清。
3.细胞上清液：3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。
4.组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。
3000转离心10分钟取上清。
5.保存：假如样本收集后不适时检测，请按一次用量分装，冻存于20℃，避开反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。
自备物品1.酶标仪（450nm）2.高精度加样器及枪头：0.510uL、220uL、20200uL、2001000uL3.37℃恒温箱操作注意事项试剂盒保存在28℃，使用前室温平衡20分钟。
从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶wan全溶解后再使用。
试验中不用的板条应立刻放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。
浓度为0的S0号标准品即可视为阴性对比或者空白；依照说明书操作时样本已经稀释5倍，最结束果乘以5才是样本实际浓度。
严格依照说明书中标明的时间、加液量及次序进行温育操作。
全部液体组分使用前充分摇匀。
试剂盒构成名称96孔配置48孔配置备注微孔酶标板12孔×8条12孔×4条无标准品0.3mL*6管0.3mL*6管无样本稀释液6mL3mL无检测抗体HRP10mL5mL无20×洗涤缓冲液25mL15mL按说明书进行稀释底物A6mL3mL无底物B6mL3mL无停止液6mL3mL无封板膜2张2张无说明书1份1份无自封袋1个1个无注：标准品（S0S5）浓度依次为：0、20、40、80、160、320U/mL试剂的准备20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份的20×洗涤缓冲液加19份的蒸馏水。
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大鼠超氧化物歧化酶（SOD）酶联免疫分析
试剂盒使用说明书
本试剂盒仅供研究使用。
检测范围：48T
2.5 U/mL - 80 U/mL
使用目的：
本试剂盒用于测定大鼠血清、血浆及相关液体样本中超氧化物歧化酶（SOD）含量。
实验原理
本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中大鼠超氧化物歧化酶（SOD）水平。
用纯化的大鼠超氧化物歧化酶（SOD）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入人超氧化物歧化酶（SOD），再与HRP标记的超氧化物歧化酶（SOD）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的超氧化物歧化酶（SOD）呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中大鼠超氧化物歧化酶（SOD）浓度。
1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。
若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融
2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
操作步骤
1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀
释。
2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、
待测样品孔。
在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。
加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
4.配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用
5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此
重复5次，拍干。
6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
7.温育：操作同3。
8.洗涤：操作同5。
9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色
15分钟.
10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。
测定应在加终止
液后15分钟以内进行。
操作程序总结：
计算
以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标
准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
注意事项
1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。
2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。
3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。
一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
4．请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。
如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。
5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6．底物请避光保存。
7．严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.
8．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。
9．本试剂不同批号组分不得混用。
10. 如与英文说明书有异，以英文说明书为准。
保存条件及有效期
1．试剂盒保存：；2-8℃。
2．有效期：6个月。