巢式PCR注意事项
实验七 PCR扩增技术
【实验试剂】
• • • • • • • • DNA模板; Taq酶，扩增缓冲液，ddH2O; 琼脂糖N; DNA分子量标准; 50TAE电泳缓冲液(储存液); 6*loading buffer; 溴化乙锭溶液(EB)：0.5 mg/ml；管里按以下比例配置50 l反应 体系： • 模板DNA0.5 l • 上游引物1 l • 下游引物1 l • 10扩增缓冲液5 l • dNTP4 l • Taq酶0.5 l • ddH2O38 l
【注意事项】
• • PCR反应灵敏度很高，为了防止污染，使用的 0.2 ml的PCR薄壁管和吸头都应该是无污染的。 加试剂前，应短暂离心10 s，然后再打开试剂的 管盖，以防止污染试剂。 配置PCR反应体系时，Taq酶应该最后加入。使 用工具酶的操作必须在冰浴的条件下进行，使 用后应立即将工具酶放回冰箱。
• 酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用， 以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。 需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。 • 引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度 是否对称，是PCR失败或扩增条带不 理想、容易 弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问 题，两条引物一条浓度 高，一条浓度低，造成低 效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引 物合成单 位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要 注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物 条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如 一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有 可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条 引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡 其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多 次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降 解失效。④引物设计不合理，如引物长度不够， 引物之间形成二聚体等。
PCR原理及注意事项
PCR一、PCR的原理PCR;Polymerase Chain Reaction;聚合酶链式反应;由Kary Mullis博士在1985年于美国的PE-Cetus公司工作期间发明..该技术基本原理如下：在模板DNA、primers和4种dNTPs存在下;依赖于DNA polymerase的酶促合成反应..DNA polymerase以单链DNA为模板;借助一小段双链DNA来启动合成;通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合;形成部分双链..在适宜的温度和环境下;DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3´-OH末端退火;并以此为起始点;沿模板5´→3´方向延伸;合成一条新的DNA互补链的过程并依次循环..1.PCR反应的基本成分包括：Templates DNA待扩增DNA、Primers、4种脱氧核苷酸dNTPs、DNA聚合酶和适宜的Buffer对于高GC含量的模板有时加入3% DMSO..类似于DNA的天然复制过程;其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物..2.PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①.模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后;使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离;成为单链;以便它与引物结合;为下轮反应做准备；②.模板DNA与引物的退火复性：模板DNA经加热变性成单链后;温度降至55℃或60℃左右;引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③.引物的延伸：DNA模板--引物结合物在Taq DNA聚合酶或Phusion DNA聚合酶或Pfu DNA聚合酶的作用下;以dNTPs为原料;靶序列为模板;按碱基互补配对半保留复制原理;合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链;新链又可成为下次循环的模板..3.PCR的反应动力学PCR的三个反应步骤反复进行;使DNA扩增量呈指数上升..反应最终的DNA 扩增量可用Y＝1＋X n计算..Y代表DNA片段扩增后的拷贝数;X表示实际扩增效率;平均约为75%;n 代表循环次数..平均扩增效率的理论值为100%;但在实际反应中平均效率达不到理论值..如果进行30个Cycles;实际扩增倍数往往为106-107理论上以Y=2n计算;为109..反应初期;靶序列DNA片段的增加呈指数形式;随着PCR产物的逐渐积累;被扩增的DNA 片段不再呈指数增加;而进入线性增长期或静止期;即出现“停滞效应”;这种效应称平台期..PCR 扩增效率及DNA聚合酶、PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素与之都有关..大多数情况下;平台期的产生不可避免..二、PCR的种类1.常规PCR2.反转录PCRreverse transcription;RT- PCR先在逆转录酶的作用下;以mRNA为模板;Primer 1常用OligodT引物为引物合成与其互补的cDNAcomplementary DNA;再以cDNA为模板;Primer 2为引物进行PCR反应..常用逆转录酶有AMVavian myeloblastosis virus;酶活最适温度42℃和MMLVmoloney murine leukemia virus; 酶活最适温度37℃..RT-PCR是一种快速简便敏感度极高的检测mRNA转录量或蛋白表达水平的方法..半定量RT-PCR以组织中普遍表达且表达量恒定的管家基因的mRNA表达为对照;将目的基因mRNA 与之一起逆转录成各自cDNA;最后计算它们的比值来达到对mRNA表达半定量的目的..3.实时荧光定量PCRQuantitative Real-time PCR;Q-RT-PCR在PCR反应体系中加入荧光基团SYBP Green 1或Taqman或分子信标等;利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程;最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法..利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化;通过Ct值C 代表Cycle;T代表threshold和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析..Ct值：扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数..荧光阈值是前3-15个循环荧光信号的标准偏差的10倍..用途：绝对定量检测起始模板数的精确拷贝数;通常用到标准曲线；相对定量确定经过不同处理的样本目标转录本之间或不同基因之间的基因表达差异；基因型/等位基因分析;例如SNP检测；转基因生物监测等4.重组PCR又称重叠PCR;overlap PCR：制备杂合基因5.多重PCR又称复合PCR;multiplex PCR两对或两对以上引物在一个反应体系中扩增多条目的基因片段6.不对称PCR：使用浓度相差100倍的正反引物;得到单链DNA7.反向PCR：扩增引物相反方向DNA 序列目的基因之外的序列;从而研究未知序列8.巢式PCRNest PCR：高特异性扩增;一对引物扩全长;一对引物扩内部部分序列此外;还有Touchdown PCR、锚定PCRA-PCR、Allele- specific PCRAS-PCR、单链构型多态性PCRSSCP-PCR和低严格单链特异性引物PCRLSSP- PCR等..。
PCR反应前的注意事项
PCR反应前的注意事项1，模板的用量模板的用量往往取决于模板类型和反应体系。
以50 μl反应体系为例，人基因组DNA，建议起始量为0.1-1.0 μg；大肠杆菌基因组DNA，10-100 ng；λDNA，0.5-5 ng；质粒或病毒DNA，0.1-10 ng。
浓度过高会导致非特异性扩增，过低会导致产物量下降。
正常情况下，适当提高模板浓度，减少循环次数，可提高PCR扩增的保真度。
2，模板完整性模板的完整性主要是通过核酸电泳来判断，电泳结果若在23 kb 左右有一条完整条带，则证明DNA完整性比较好。
电泳结果中若出现弥散或无明显条带，则DNA可能发生降解。
3，模板的纯度模板的纯度一般通过分光光度计测定，通常OD260/OD280比值在1.8～2.0认为DNA的纯度比较好，大于2.0可能存在RNA污染，小于1.8可能存在蛋白质污染。
另外，模板中如果有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白等的污染，会大大降低扩增效率。
引物1，引物设计在PCR扩增时，引物是决定扩增特异性与产量的最重要因素之一，所以引物序列的设计尤为重要。
通常可借助引物设计软件辅助引物设计，比如NCBI网站的Primer BLAST在线工具、Primer 5在线工具、Primer Premier引物设计软件、Oligo 引物设计软件等。
另外，小编也整理了一份引物设计原则供小伙伴们参考：2，引物使用建议终浓度要求在0.1-1 μM，通常使用0.2 μM。
对于简并引物、随机引物，可适当增加引物使用量，切记用量不要过高，否则会降低PCR的特异性。
若模板量多且结构复杂（如人基因组DNA）时，适量减少引物用量提高特异性；反之，模板量少（如质粒模板）时，适当增加引物用量，提高PCR产量。
PCR 试剂PCR反应除了模板和引物外，还需要准备DNA聚合酶、dNTPs、镁离子、反应缓冲液和稳定剂等组份按照一定配比组成的试剂作为反应环境。
为了实验的方便性，商业化PCR试剂大多做成2x即用型PCR Mix，大大节约了加样时间、最大限度地减少了人为误差、降低污染几率。
PCR注意事项总结
PCR注意事项总结pcr注意事项PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。
假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节包括① 模板核酸的制备，② 引物的质量和特异性，③ 酶的质量和质量，以及④ PCR循环条件。
要找到原因，我们还应该分析和研究上述环节。
模板：① 模板中含有多种蛋白质，② 模板包含Taq酶抑制剂，③ 模板中的蛋白质没有被消化和去除，尤其是染色体中的组蛋白，④ 在提取和制备模板过程中损失过多，或吸入苯酚。
⑤模板核酸变性不完全。
当酶和引物质量良好时，没有扩增带。
样品的消化和处理以及模板核酸的提取过程很可能有问题。
因此，为了制备有效、稳定的消化和处理溶液，程序也应该是固定的，不能随意改变。
酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。
需注意的是有时忘加taq酶或溴乙锭。
引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是pcr失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。
有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。
②引物的浓度不仅要看od值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做pcr有可能失败，应和引物合成单位协商解决。
如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。
③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。
④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。
Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率有很大影响。
浓度过高会降低PCR扩增的特异性。
浓度过低会影响PCR扩增的产量，甚至会使PCR扩增失败而没有扩增条带。
反应体积的改变：通常进行pcr扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。
PCR注意事项
影响PCR的主要因素PCR技术必须有人工合成的合理引物和提取的样品DNA，然后才进行自动热循环，最后进行产物鉴定与分析。
引物设计与合成目前只能在少数技术力量较强的研究院、所进行，临床应用只需购买PCR 检测试剂盒就可开展工作，PCR自动热循环中影响因素很多，对不同的DNA样品，PCR反应中各种成份加入量和温度循环参数均不一致。
现将几种主要影响因素介绍如下。
一、温度循环参数在PCR自动热循环中，最关键的因素是变性与退火的温度。
如操作范例所示，其变性、退火、延伸的条件是：94℃60s, 37℃60s, 72℃120s，共25～30个循环，扩增片段500bp。
在这里，每一步的时间应从反应混合液达到所要求的温度后开始计算。
在自动热循环仪内由混合液原温度变至所要求温度的时间需要30～60s，这一迟滞时间的长短取决于几个因素，包括反应管类型、壁厚、反应混合液体积、热源（水浴或加热块）以及两步骤间的温度差，在设置热循环时应充分给以重视和考虑，对每一仪器均应进行实测。
关于热循环时间的另一个重要考虑是两条引物之间的距离；距离越远，合成靶序列全长所需的时间也越长，前文给出的反应时间是按最适于合成长度500bp的靶序列拟定的。
下面就各种温度的选择作一介绍。
1．模板变性温度变性温度是决定PCR反应中双链DNA解链的温度，达不到变性温度就不会产生单链DNA模板，PCR也就不会启动。
变性温度低则变性不完全，DNA双链会很快复性，因而减少产量。
一般取90～95℃。
样品一旦到达此温度宜迅速冷却到退火温度。
DNA变性只需要几秒种，时间过久没有必要；反之，在高温时间应尽量缩短，以保持Taq DNA聚合酶的活力，加入Taq DNA聚合酶后最高变性温度不宜超过95℃。
2．引物退火温度退火温度决定PCR特异性与产量；温度高特异性强，但过高则引物不能与模板牢固结合，DNA扩增效率下降；温度低产量高，但过低可造成引物与模板错配，非特异性产物增加。
PCR的基本步骤及注意
PCR的基本步骤及注意聚合酶链反应（PCR）是一种体外扩增特定DNA序列的技术，可以在短时间内生成大量目标DNA分子。
这项技术有助于分子生物学、基因工程、医学诊断和法医学等领域的研究。
1.临床分配试剂和试管：将PCR反应所需的试剂和试管按需求分配到不同的试管中。
要确保试剂处于适当的温度，避免暴露于高温和冷藏温度。
2.准备DNA样本：从所需样本中提取目标DNA序列。
此步骤可能需要使用DNA提取试剂和特定的样本处理方法。
3.DNA扩增：在PCR试管中，添加目标DNA序列的模板，然后加入DNA聚合酶、引物（前向和反向引物）和缓冲液。
将试管放入PCR热循环仪。
4.PCR循环条件：PCR循环通常包括三个步骤：变性、退火和延伸。
变性步骤将模板DNA变性为两条单链DNA；退火步骤允许引物与目标序列配对；延伸步骤将DNA聚合酶沿引物向目标DNA序列延伸，并在每个PCR循环中产生新的DNA分子。
5.PCR循环次数：PCR反应包含多个PCR循环，每个循环都由变性、退火和延伸步骤组成。
PCR循环次数的选择取决于所需扩增的目标DNA的数量。
6.凝胶电泳：将PCR反应产物进行凝胶电泳检测。
通过电泳可以将PCR产物分离出来，并根据其大小进行检测和分析。
PCR注意事项如下：1.PCR试剂的储存和使用：所有PCR试剂都应存储在适当的温度下，并且在使用之前应检查其有效期。
如果试剂过期，可能会对PCR反应产生不可预测的结果。
2.样本处理和DNA提取：样本处理和DNA提取步骤的准确性对PCR结果的可靠性至关重要。
应遵循标准样本处理和DNA提取的步骤，并确保使用无污染的试剂和材料。
3.引物的设计：引物是PCR反应中的重要组成部分，其设计应遵循一定的原则。
引物应具有与目标DNA序列特异性互补的序列，并且长度应适当，通常在20-30个碱基对之间。
4.反应混合物的准备：在混合PCR反应的试管中，应遵循正确的操作步骤，确保所有试剂都得到正确添加，并完成适当的混合。
pcr的实验流程及注意事项
pcr的实验流程及注意事项嘿，搞科研的小伙伴们！今天咱们来唠唠pcr这个超重要的实验的流程及注意事项呀！这pcr实验啊，就像一场精密的魔法之旅呢！先说说实验流程吧。
第一步，那肯定是要准备好样本啦，这样本就像是pcr魔法的原材料，必须精心挑选，确保它的质量呀，啧，可不能随随便便拿个样本就开始呢。
然后呢，得把各种试剂都准备好，像什么引物啦，Taq酶啦，dNTP啦，这些可都是这场魔法的关键道具呢。
接着，就到了配置反应体系的时候啦。
这一步可得小心谨慎，就像在搭建一座精密的小城堡。
各种试剂的量都得按照比例来，多一点少一点都可能影响整个pcr的结果呢，这可不像做饭，调料多点少点可能只是味道有点差别。
把反应体系配置好后，就可以把它放到pcr 仪里面啦，这pcr仪就像是一个魔法小盒子，能让样本在里面发生神奇的变化。
然后咱们再来说说注意事项呀。
在准备样本的时候，一定要避免样本被污染哦，要是样本被污染了，那这pcr实验就像被施了坏魔法一样，结果肯定不对啦。
这就好比你在做蛋糕的时候，不小心把脏东西混进去了，那蛋糕能好吃吗？还有啊，配置反应体系的时候，加试剂一定要准确无误，可不能手抖。
而且呀，pcr仪的参数设置也很关键呢，温度、时间这些参数就像是魔法咒语，错了可不行。
再就是，在整个实验过程中，要保持实验室的清洁，这就像保持魔法场地的纯净一样。
如果实验室里乱糟糟的，到处都是灰尘或者其他杂质，那很可能就会干扰pcr实验的结果。
这就像在一个嘈杂的环境里想要安静地读书一样困难。
哎呀呀，pcr的实验流程和注意事项可真的要牢记于心呢。
咱们做实验的，只有严格按照流程走，注意每一个小细节，才能让pcr实验顺利进行，得到准确的结果呀。
这就像要登上山顶，每一步都要踩稳踩扎实一样。
千万不能马虎大意，不然之前的努力可就都白费啦。
咱们一定要像对待宝贝一样对待pcr实验，这样才能在科研的道路上不断前进，探索更多的奥秘呢！。
基因扩增检验操作规程(3篇)
第1篇一、目的为确保基因扩增检验结果的准确性和可靠性，规范操作流程，特制定本规程。
二、适用范围本规程适用于本实验室开展的基因扩增检验项目，包括但不限于：病原体检测、基因突变检测、基因表达检测等。
三、操作流程1. 样本准备（1）收集样本：严格按照标本采集要求采集样本，确保样本质量。
（2）样本处理：根据检测项目要求，对样本进行适当处理，如灭活、提取、纯化等。
2. 核酸提取（1）采用合适的核酸提取方法，如磁珠法、柱分离法等，提取目标DNA或RNA。
（2）提取过程中注意避免交叉污染，确保提取的核酸纯度高。
3. PCR扩增（1）配制PCR反应体系：根据检测项目要求，配置PCR反应体系，包括引物、探针、模板DNA/RNA、dNTPs、缓冲液、Taq酶等。
（2）设置PCR反应程序：根据检测项目要求，设置PCR反应程序，包括变性、退火、延伸等步骤。
（3）进行PCR扩增：将反应体系置于PCR仪中进行扩增，确保扩增过程中温度、时间等参数准确。
4. 扩增产物检测（1）采用实时荧光定量PCR技术或琼脂糖凝胶电泳等方法检测扩增产物。
（2）根据检测结果，判断是否存在目标基因或突变。
5. 数据分析（1）根据检测数据，进行定量分析或定性分析。
（2）对结果进行解释和报告。
四、注意事项1. 操作人员应熟悉基因扩增检验原理、操作流程和设备使用方法。
2. 操作过程中应严格按照操作规程进行，确保实验结果的准确性。
3. 注意避免交叉污染，使用一次性无菌用品，对实验台面、仪器等进行定期消毒。
4. 核酸提取、PCR扩增等环节应严格按照要求进行，确保核酸质量。
5. 对实验数据进行准确记录，确保数据真实可靠。
6. 实验结果报告应包括实验方法、结果分析、结论等。
五、附则1. 本规程由实验室负责人负责解释。
2. 本规程自发布之日起实施，原有相关规定与本规程不一致的，以本规程为准。
3. 实验室应定期对操作规程进行修订和完善。
第2篇一、目的为确保基因扩增检验结果的准确性和可靠性，特制定本操作规程。
验证PCR注意事项
验证PCR注意事项PCR（聚合酶链反应）是一种被广泛应用的基因检测技术，可以在短时间内扩增小片段DNA，使其数量快速增加。
然而，PCR技术操作繁琐，在实验过程中存在许多需要注意的事项，下面我将详细回答并讨论PCR技术的注意事项。
1. 实验室准备：在进行PCR实验前，要充分准备实验室所需的基本设备和试剂，如PCR仪、热循环程序控制器、离心机、PCR试剂盒等。
还需要保证空间干净整洁，避免交叉污染。
2. 基因组DNA提取：PCR反应的第一步是提取样本中的DNA，注意要选择适当的提取方法。
常用的方法有酚/氯仿法、磁珠法、硅胶膜法等，具体选择取决于样本类型和实验目的。
此外，提取过程中要避免样本的污染，严格遵守操作规程。
3. 靶标序列选择与设计：设计引物是PCR反应成功的关键。
引物应与目标DNA序列互补，长度在18-30碱基之间，GC含量约为50-60%。
引物间应该没有互补碱基片段，以避免引物二聚体的产生。
在设计引物时，可以利用一些在线工具进行引物评估，确保引物的特异性和稳定性。
4. 引物浓度的优化：引物浓度的优化对PCR反应的成功与否至关重要。
引物过多会导致引物二聚体或非特异性扩增，引物过少则可能导致不稳定的扩增。
一般来说，引物的最佳浓度为0.1-0.5μmol/L。
5. PCR反应体系的优化：PCR反应体系主要包括引物、DNA模板、dNTPs、聚合酶、缓冲液和Mg2+等。
体系中各个组分的浓度和比例需要优化，以确保PCR反应的成功。
一般来说，每个PCR反应管中最终反应体积为20-50μl，引物浓度为0.2-0.5μmol/L，模板DNA浓度为10-200ng。
6. 热循环程序设置的优化：PCR反应的关键步骤是反应体系的热循环程序。
温度和时间的设置需要根据引物和目标序列的特性进行优化。
常规的PCR热循环程序包括：变性（94-98C）、退火（50-68C）和扩增（72C）等步骤，反应周期数一般为25-40个。
pcr注意事项
PCR做了很多，根据论坛和自己的经验总结了一下几点，算是抛砖引玉吧，呵呵：
1）PCR实验一定要保管好试剂，防止交叉污染，尤其是ddH2O2的交叉使用，极易引起污染（惨痛的教训）！
2)NA处理最好用硅烷化塑料管以防粘附在管壁上，所有缓冲液吸头、离心管等用前必须高压处理，常规消耗用品用后作一次性处理，避免反复使用造成污染。
3)PCR在超净台内进行，操作前后紫外灯消毒。
（不一定需要）
4)超净台内设内供PCR用微量离心机、一次性手套、整套移液器和其它必须品；移液品用一次性吸头和活塞的正向排液器，防止移液器基部污染。
5)PCR操作应戴手套并勤于更换。
5)成套试剂，小量分装，专一保存，防止它用。
配制试剂用新器具，用后作一次性处理。
6)试剂管用前先瞬时离心（10s），使液体沉于管底，减少污染手套与加样器机会。
7)最后加模板DNA（包括在石蜡油后），马上盖好，混匀，瞬时离心（10s），使水相与有机相分开。
加入模板且忌喷雾污染，所有非即用管都应盖严。
加模板DNA后应更换手套。
8)引物稀释时，要首先瞬时离心，以避免粉末状引物在开盖时弹出管外。
9)实验设阳性、阴性对照。
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1.如果要提高扩增效果，具备回收的条件的话，回收后继续第二次PCR是没有问
题的。如果不具备回收条件，不回收直接稀释后进行二次PCR也可，因为内引物
同样具有相当的特异性，如果设计合理，第一次非特异性的扩增产物为模板，不
能和第二对引物有效结合，这样的非特异产物的模板不能在第二次扩增中产生目
的条 带。这也正是NESTED PCR的优点。
2.主要是控制好引物的比例，也就是说，如果第一次PCR的 引物如果过量的话，
剩余引物二次PCR的时候同样能有一定的产量，这相对于第二次PCR而言就是非
特异性的产物。解决的方法很简单，第一次PCR时，引物 尽量摸索最低的加入
量，增加循环次数，尽量消耗体系中残余的引物。二次PCR时，增加内引物的量，
二者还是有一定竞争关系，道理不言而喻了。