RARα mRNA和RARβ mRNA在过量RA致神经管畸形发生中的表达

第１６卷第２期　２００７年４月　

中国组织　

ＣＨＩＮＥＳＥ　ＪＯＵＲＮＡＬＯＦ　化学与细胞化学杂志　ＨＩＳＴＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ　ＡＮＤ　ＣｙＩＤＣＨＥＭＩＳＴＲＹ　Ｖｏ１．１６．ＮＯ．２　Ａｐｒ．２００７　

ＲＡＲａ　ｍＲＮＡ和ＲＡＲｆ３　ｍＲＮＡ在过量ＲＡ致　神经管畸形发生中的表达　

芦志红　刘　凯　高英茂　刘　皓　（天津医科大学组织胚胎学教研室，天津３０００７０；　山东大学医学院组织胚胎学教研室，济南２５００１２）　［摘要］　目的探讨过量ＲＡ对金黄地鼠胚胎神经管ＲＡＲａ和ＲＡＲ，ａ　ｍＲＮＡ表达的影响。方法采用原位杂交及图　像分析，半定量分析正常及ＲＡ致畸金黄地鼠胚胎神经管中ＲＡＲａ和ＲＡＲ，ａ　ｍＲＮＡ表达水平的变化。结果过量ＲＡ可使　ＲＡＲａ和ＲＡＲ，ａ　ｍＲＮＡ在金黄地鼠神经管中的表达水平呈现短时下降，随后又大幅上升的变化。结论过量ＲＡ引起的　ＲＡＲａ和ＲＡＲＩ３　ｍＲＮＡ表达水平的变化与ＲＡ致金黄地鼠神经管畸形相关。　（关键词］　ｅＡｉａ　ｍＲＮＡ；ＲＡＲＩ３　ｍＲＮＡ；　维甲酸；　神经管畸形；　金黄地鼠　（中图分类号］　Ｒ３２１．６　［文献标识码］　Ａ　

ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ　ＯＦ　ＲＡＲＧｔ　ｍＲＮＡ　ＡＮＤ　ＲＡＲｐ　ｍＲＮＡ　ＩＮ　ＴＨＥ　ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ　ＯＦ　ＮＥＵＲＡＬ　ＴＵＢＥ　ＤＥＦＥＣＴＳ　ＩＮＤＵＣＥＤ　ＢＹ　ＥＸＣＥＳＳＩＶＥ　ＲＥＴＩＮＯＩＣ　ＡＣＩＤ　Ｉ　ｕ　Ｚｈｉｈｏｎｇ，ＩＡｕ　Ｋａｉ　，Ｇａｏ　Ｙｉｎｇｍａｏ　，Ｌｉｕ　Ｈａｏ　（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｅｍｂｒｙｏｌｏｇｙ，Ｔｉａ　ｉｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，　Ｔｉａ　ｉｎ　３０００７０，Ｃｈｉｎａ；　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｅｍｂｒｙｏｌｏｇｙ，Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，　Ｓｈａｎｄｏｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊｉｎａｎ　２５００１２，Ｃｈｉｎａ）　

（Ａｂｓｔｒａｃｔ￣　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｅｘｃｅｓｓｉｖｅ　ｒｅｔｉｎｏｉｃ　ａｃｉｄ（ＲＡ）ｏｎ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ　ｏｆ　ＲＡＲａ　ａｎｄ　ＲＡＲ／３　ｍＲＮＡ　ｉｎ　ｎｅｕｒａｌ　ｔｕｂｅｓ　ｏｆ　ｇｏｌｄｅｎ　ｈａｍｓｔｅｒｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｈｒｏｕｇｈ　ｉｎ　ｓｉｔｕ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｍａｇｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ．ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ　ｏｆ　ＲＡＲａ　ａｎｄ　ＲＡＲ／３　ｍＲＮＡ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｎｏｒｍａｌ　ａｎｄ　ｄｅｆｅｃｔｅｄ　ｎｅｕｒａｌ　ｔｕｂｅｓ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｅｘｃｅｓｓ　ＲＡ　ｗａｓ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ｉｎ　ｇｏｌｄｅｎ　ｈａｍｓｔｅｒｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｅｘｃｅｓｓ　ＲＡ　ｍａｄｅ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓ—　ｓｉｏｎｓ　ｏｆ　ＲＡＲａ　ａｎｄ　ＲＡＲ／３　ｍＲＮＡ　ｄｅｃｌｉｎｅ　ｆｉｒｓｔ，ａｎｄ　ｔｈｅｎ　ｉｎｃｒｅａｓｅ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｉｎ　ｎｅｕｒａｌ　ｔｕｂｅｓ　ｏｆ　ｇｏｌｄｅｎ　ｈａｍｓｔｅｒ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＲＡＲａ　ａｎｄ　ＲＡＲ／３　ｍＲＮＡ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｅｘｃｅｓｓｉｖｅ　ＲＡ　ｉＳ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｎｅｕｒａｌ　ｔｕｂｅ　ｄｅｆｅｃｔｓ　ｉｎ　ｇｏｌｄｅｎ　ｈａｍｓｔｅｒ．　［Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ］　ＲＡＲａ　ｍＲＮＡ；　ＲＡＲ／３　ｍＲＮＡ；　Ｒｅｔｉｎｏｉｃ　ａｃｉｄ（ＲＡ）；　Ｎｅｕｒａｌ　ｔｕｂｅ　ｄｅｆｅｃｔｓ；　Ｇｏｌｄｅｎ　ｈａｍｓｔｅｒ　

随着现代工业的发展和环境污染的日趋严重，　人类先天性畸形发生率也逐年上升。神经管畸形　（ｎｅｕｒａｌ　ｔｕｂｅ　ｄｅｆｅｃｔｓ，ＮＴＤｓ）是最为常见且危害性　最大的一类先天性畸形。研究证实，过量维生素Ａ　及维甲酸（ｒｅｔｉｎｏｉｃ　ａｃｉｄ，ＲＡ）等维生素Ａ衍生物　在小鼠、金黄地鼠、鸡等动物均可导致ＮＴＤｌ＿１］。　本实验在已建立的维甲酸（ｒｅｔｉｎｏｉｃ　ａｃｉｄ，ＲＡ）致　［收稿日期］２００６—０７－２８　［修回日期］２００６—１０—２０　［作者简介］芦志红，女（１９７６年１，汉族，博士，讲师。　＊通讯作者（Ｔｏ　ｗｈｏｍ　ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ　ｓｈｏｕｌｄ　ｂｅ　ａｄｄｒｅｓｓｅｄ）　金黄地　讨维甲　ＲＡＲａ，　的关系　鼠ＮＴＤ动物模型上　引，用原位杂交方法探　酸受体ａ和』３（ｒｅｔｉｎｏｉｃ　ａｃｉｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒａａｎｄ￣，　ＲＡＲ／３）基因转录状况与ＲＡ致ＮＴＤ发生　以期探明过量ＲＡ致ＮＴＤ发生的分子机　制，为ＮＴＤ的预防和治疗提供实验依据。　

材料和方法　１．制备过量ＲＡ致神经管畸形的动物模型　成年未经产雌性金黄地鼠８Ｏ只，体重（１００±　１０）ｇ．　鼠１：　颗粒饲料喂养，普通饮水。晚７—１Ｏ时与雄　

１合笼，交配者次日定为受精后１ｄ。孕鼠随　

维普资讯 http://www.cqvip.com １６Ｏ　中国组织化学与细胞化学杂志　第１６卷　机分为实验组和对照组，每组各４０只。实验组于　受精后８ｄ下午６时，一次性灌服０．８　全反式维　甲酸花生油悬液，剂量为８０　ｍｇ／ｋｇ，对照组按体　重灌服等量花生油。　２．分组与标本制备　将实验组和对照组孕鼠各分为６小组，分别在　灌胃后３、６、１４、２２、４６、９６ｈ处死动物，剖腹取　出妊娠子宫并浸于４　多聚甲醛中固定２４ｈ，　０．０１ｍｏｌ／Ｉ　ＰＢＳ冲洗２４ｈ，经梯度酒精脱水后石蜡　包埋，连续切片（厚５ｇｍ），裱片于多聚赖氨酸处　理的载玻片上，置４５℃温箱中烤干４８ｈ使切片紧　密粘贴，然后置４℃冰箱内保存备染。标本制备过　程中所用试剂均用ＤＥＰＣ水配置，且严格控制　ＲＮＡ酶污染。　３．地高辛标记ＲＡＲａ和ＲＡ邸ｃＲＮＡ探针的　制备　ＲＴ－ＰＣＲ扩增ＲＡＲａ、ＲＡＲｐ目的基因片断，　酶切纯化后与表达载体ｐＴｒｉＥｘ－４连接，转化人大　肠杆菌进行基因克隆，提取重组载体，体外转录标　记制备ｃＲＮＡ探针。　４．原位杂交染色　切片经常规脱蜡入水；０．３　Ｈ。Ｏ。甲醇溶液封　闭１０ｍｉｎ，灭活内源性过氧化物酶；３％柠檬酸新　鲜稀释的胃蛋白酶３７℃消化５　ｍｉｎ；滴加预杂交液　３７℃温育４ｈ；滴加含地高辛标记ＲＡＲａ及ＲＡＲｐ　ＲＮＡ探针的杂交液３７℃孵育２４ｈ；滴加封闭液　３７℃封闭３Ｏ　ｍｉｎ；滴加生物素化鼠抗地高辛抗体　３７℃孵育ｌｈ；滴加ＳＡＢＣ　３７℃孵育２０ｍｉｎ；滴加　生物素化过氧化物酶，３７℃孵育３０ｒａｉｎ；ＤＡＢ显　色。脱水，透明，封片观察。空白对照切片以不含　探针的预杂交液代替杂交液进行孵育，结果为阴　性。　５．图像分析及统计学处理：　将原位杂交染色结果输入图像分析仪（ＭＰＩ－　ＡＳ－１０００），分别测量各期实验组与对照组鼠胚　（每组２０个）神经上皮阳性细胞的光密度（ＯＤ　值），计算各期中所有鼠胚神经管相应部位的光密　度平均值，各期实验组与对照组之间进行ｔ检验。　

结　果　１．ＲＡＲａ　ｍＲＮＡ在正常及致畸金黄地鼠胚胎　神经管中的表达　ＲＡＲａ原位杂交染色结果呈棕黄色，位于胞浆　内。各正常对照组与实验组胚胎神经管上皮细胞中　均有表达（图１）。ＲＡＲａ　ｍＲＮＡ在正常对照组胚　胎神经管中的表达随胚龄增加而逐渐下降，即灌服　花生油后３、６ｈ，其表达水平较高，随后１４、２２、　４６ｈ其表达水平明显降低，９６ｈ表达水平进一步下　降。与正常对照组相比，实验组在灌服０．８　ＲＡ　花生油悬液后３ｈ，ＲＡＲａ　ｍＲＮＡ表达水平明显低　于正常对照组（Ｐ＜０．０１）；６ｈ时其表达水平则明　显高于正常对照组（Ｐ＜０．０１）；１４、２２、４６ｈ其表　达水平下降，但与对照组相比无显著差异；９６ｈ时　其表达增强至高于对照组的水平，两者差异显著　（Ｐｄ０．０１）（表１）。　

表１　过量ＲＡ对金黄地鼠胚胎神经管ＲＡＲａ　ｍＲＮＡ表达的影响　Ｔａｂｌｅ　１　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｅｘｃｅｓｓｉｖｅ　ＲＡ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＲＡＲｕ　ｍＲＮＡ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｎｅｕｒａｌ　ｔｕｂｅ　ｏｆ　ｇｏｌｄｅｎ　ｈａｍｓｔｅｒ　ｅｍｂｒｙｏｓ　

Ｐｄｏ．０１　ＶＳ　ｃｏｎｔｒｏｌ　

维普资讯 http://www.cqvip.com 第２期　芦志红等．ＲＡＲａ　ｍＲＮＡ和ＲＡＲｐ　ｍＲＮＡ在过量ＲＡ致神经管畸形发生中的表达　１６１　２．ＲＡＲＪ３　ｍＲＮＡ在正常及致畸金黄地鼠胚胎　神经管中的表达　ＲＡＲＪ３原位杂交染色结果呈棕黄色，位于胞浆　内。各正常对照组与实验组胚胎神经管上皮细胞均　有表达（图２）。ＲＡ　ｍＲＮＡ在正常胚胎神经管　中的表达也呈时间依赖性改变。灌服花生油后３ｈ，　其表达水平最高，６、１４ｈ其表达水平明显减弱，　２２ｈ表达再次增强，４６、９６ｈ其表达水平又逐渐减　弱。实验组在ＲＡ处理后３、６ｈ，ＲＡＲｆｌ　ｍＲＮＡ　表达水平显著低于正常对照组（Ｐ＜０．０１，Ｐ＜　０．０５）；１４ｈ时其表达水平升高，且显著高于正常　对照组（Ｐ＜Ｏ．０１）；随后，在２２ｈ时其表达水平　再次降低，且明显低于对照组（Ｐ＜０．０５）；４６、　９６ｈ其表达逐渐增强，至９６ｈ时其表达水平明显高　于对照组（Ｐ＜Ｏ．０５）（表２）。　

表２　过量ＲＡ对金黄地鼠胚胎神经管ＲＡＲｆｌ　ｍＲＮＡ表达的影响　Ｔａｂｌｅ　２　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｅｘｃｅｓｓｉｖｅ　ＲＡ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＲＡＲＪ３　ｍＲＮＡ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｎｅｕｒａｌ　ｔｕｂｅ　ｏｆ　ｇｏｌｄｅｎ　ｈａｍｓｔｅｒ　ｅｍｂｒｙｏｓ　

Ｐ＜ｏ．０５。　Ｐ＜ｏ．Ｏｌ　ＶＳ　ｃｏｎｔｒｏ１　讨　论　研究证实，正常胚胎的形态发生，尤其是中枢　神经系统的发生与ＲＡ靶向发育调控基因有关。在　大鼠和小鼠的研究中发现，在胚胎发育早期，沿中　枢神经系统前后轴有各种ＲＡ受体的表达，而且发　现各种受体亚型均有自己独特的表达模式。本实验　原位杂交结果显示，正常对照组自受精后第８ｄ晚　６时灌服花生油后３ｈ一９６ｈ，在金黄地鼠胚胎神经　管中均有ＲＡＲａ和ＲＡＲＪ３　ｍＲＮＡ表达。尽管两者　的表达模式有所不同，但其表达峰值均出现在灌胃　后３ｈ一６ｈ（约为受精后第９ｄ），即神经管闭合的起　始阶段。这提示，内源性ＲＡ通过与ＲＡＲａ和　ＲＡ　结合而作用于相关发育调控基因，参与对神　经管闭合过程的调节。　动物实验和人类相关研究证实，过量维生素Ａ　和维甲酸是胚胎致畸因子。Ｃｏｈｌｏｎ于１９５３年首先　发现过量维生素Ａ可致大鼠胚胎发生ＮＴＤ［３］。过　量ＲＡ的致畸作用可能与ＲＡ在时间和空间上不适　当的激活或抑制了某些形态发生相关调控基因有　关ｌ＿４　］。本实验室在过去的研究中已证实，剂量为　８０　ｍｇ／ｋｇ的ＲＡ可使金黄地鼠出现各种严重的　ＮＴＤ。本实验结果显示，实验组在灌服ＲＡ后３ｈ，　ＲＡＲａ和ＲＡＲＪ３　ｍＲＮＡ的表达水平均显著低于对　照组（Ｐ＜Ｏ．０１）。如前所述，此时正值神经管闭　合的起始阶段，该结果提示，ＲＡＲａ和ＲＡ　ｍＲ—　ＮＡ表达水平的下降可能是过量ＲＡ致ＮＴＤ的机　制之一。推测其可能的过程是，过量ＲＡ结合过多　的ＲＡＲａ和ＲＡＲＪ３，而后与靶基因的ＲＡＲＥ结合，　从而过度激活或抑制这些下游靶基因，而最终导致　ＮＴＤ。为减少这种损害，胚胎可能通过某种途径，　使ＲＡＲａ和ＲＡＲＪ３　ｍＲＮＡ的表达下调，以尽可能　减少ＲＡＲａ和ＲＡＲｊ３的表达量。本实验结果还显　示，在短暂下降后，ＲＡＲａ和ＲＡＲＪ３　ｍＲＮＡ表达　水平均有一大幅升高的过程。在ＲＡＲａ，该过程很　短暂，至用药后１４ｈ即降至与对照组相当的水平；　而在ＲＡ　，该过程则相对较长，一直持续到用药　后９６ｈ。究其原因，我们认为，可能是因为前期　ＲＡＲａ和ＲＡＲＪ３　ｍＲＮＡ的表达下调幅度过大，通　过反馈机制而产生的一种补偿作用。