微生物发酵法制备富含γ-氨基丁酸的桑叶复合粉
2.γ-氨基丁酸(GABA)的分布及测定方法
γ-氨基丁酸（GABA）的分布及测定方法周青生物化工2110805057一、分布：γ-氨基丁酸在动、植物体内都有分布，在动物体内，GABA主要分布于神经组织中，在哺乳动物的脑组织内分布最为集中，其含量是单胺类含量的1000倍，而在外围器官中含量很少。
在植物体内，GABA是细胞自由氨基酸库的重要组分，胞液中有几种构型，可形成类似脯氨酸的环状结构。
高等植物组织中GABA含量通常在0.3～32.5μmol／g之间，超过许多蛋白质类氨基酸的含量。
在一些与根瘤菌共生固氮植物的根瘤中，GABA以结合态形式存在，苜蓿中结合态形式的GABA高达干重的6.6%[1]。
除此之外，GABA还存在于以下植物中，见表一。
①薄层色谱：原理：用一定波长的光照射在经薄层层析后的层析板上，对具有吸收或能产生荧光的层析斑点进行扫描，用反射法或透射法测定吸收的强度，以检测其浓度。
方法：展开剂是正丁醇：醋酸：水=4：1：1。
分别吸取5μl γ-氨基丁酸标准品溶液和样品洗脱液，点于自制的硅胶薄层板上，以正丁醇：醋酸：水体积比为4：1：1为展开剂展开，取出晾干，用体积分数0.2％茚三酮乙醇溶液显色，105℃烘数分钟，直至获最大斑点，用Camag TLC scanner 3 扫描仪扫描。
扫描条件为：反射式双波长锯齿扫描,扫描波长λS=515nm,参比波长λR=680nm，狭缝50×0.45 mm。
黄怀生用最小二乘法对标准溶液点样量和色谱峰面积值进行回归分析，其相关系数可达到0.99以上[14]。
黄美娥[15]用此方法测得得蕨菜叶、茎中γ-氨基丁酸的质量分数分别为0.319％、0．141％。
采用双波长扫描法[16]，可以避免分离度不佳的其他氨基酸的相互干扰；二、双波长扫描可以排除背景干扰使基线平直；三、能提高灵敏度。
②纸电泳法：原理：纸上电泳法，以纸为支持剂，使带电的γ-氨基丁酸于纸上在外电场作用下定向移动，从而达到分离目的。
方法：取上清液用于点样于滤纸上，以标准GABA溶液做对照，在电压300V、室温条件下电泳60min，电泳缓冲液为吡啶-冰醋酸混合溶液[吡啶：冰醋酸：蒸馏水(体积比)=2：2：121，pH4.7]。
富含γ—氨基丁酸的桑茶的生理功能
《中国食品添加剂》 Ｃｈｌｎａ Ｆｏｏｄ Ａｄｄｉｔｉｖｅｓ ２００２ ＮＯ．１ 富含 一氨基丁酸的桑茶的生理功能 金丰秋金其荣 （无锡市紫丰技术开发有限公司，无锡２１４０００） 摘要：本文介绍富含 一氨基丁酸的桑茶的生理功能：降糖、降血脂、降血压、碱肥、防癌的作用和机理 及其正 确的使用方法。 关键词：桑茶，ｙ一氨基丁酸，生理功能
Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｍｕｌｂｅｒｒｙ Ｌｅａｆ Ｔｅａ
Ｊｉｎ Ｆｃｒ￣ｌｉｕ ＪｉｎＱｉｔｏｎｇ （Ｗｕｙ３ Ｚｉｆｅｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏ．，Ｌｔｄ，Ｗｕｘｉ ２１４０００） Ａｈｓｌｒａｅｔ：Ｍｄｋ￣．ＬｅａｆＴｅａ．ｗｉｔｈ ｐｌｅｎｌｉｆｕｌ 一ａｍｂ￣ｂｏｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ（ＧＡＢＡ），ｈａｓ，ｓＯｍａｎｙ ｐｈｙｓｉ０ｌ ｆｕｎｅｔｉｍｓｉｎｄｕ４ｎｇ
ｂｌｏｏｄ ｓｕｇａｒ ｒｅｄｕｃ．ｄｃｎ，ｂｌｏｏｄｆａ１ ｒｅｄ￣ｔｉｃｎ，ｂｌ￣＇ｄｐｒｅｓｓｍｅ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ、ｋｅｅｐｆｉｔ ａｎｄ ｃ￣ｍｏｅｒ ｐｒｅｖｍｔｉｃｎ ｅｒｅ Ｔｈｅｓｅｗｉｌｌ ｂｅｉｍｍｄｕｃｅｄ
ｉｎｔｈｅ ｐａｌｅｒ． Ｋｅｙ ｖ，￣ｘｌｓ：ＭｕｌｂｍｙＩ Ｔｅａ，ｙ一∞ 埘ｃ ａｃｉｄ，Ｐｈ＞ｄｏｇｉｃａｌｆｕｎｃｔｉｏｎ
一、
概述
桑叶是桑树的叶子又名“铁扇子”，我国安徽、浙 江、江苏、四川、湖南等地都有栽种，我国古代药学家 李时珍的传世之作《本草纲目》中说：“桑叶可计煎 代茗，常服可令人聪明，肤色光泽，变白，轻身不老， 养颜健胃，安魂镇神称之为神仙叶。” 对于桑叶的保健功能，《本草纲目》提到：疏散风 热、消炎介毒、安神利脏、增强智力、美白减肥、健胃 通气、明目长发 最近（１９９０—１９９５）随着日本学者 广泛而深入的研究，桑叶的保健功能确认如下：①降 血压②降胆固醇⑧降血糖④抑制癌细胞，延长试验 动物寿命 其中日本群马县与神奈川县研究结果都 证实了桑叶的抗癌与减肥效果，提高免疫功能。 日本国内桑茶、桑叶荼、桑饴以及含卜脱氧野 尻霉素（ＤＮＪ）的桑叶浸膏等众多降血压、降血糖、降 血脂、减肥、预防癌症的产品已经工业化生产，并深 受消费者欢迎
_氨基丁酸的生理功效及其在乳品中的强化途径
γ-氨基丁酸（γ-Aminobutyric acide GABA）又称氨酪酸，是一种非蛋白质天然氨基酸，它是中枢神经系统中最重要的抑制性神经递质，具有降低血压，改善脑机能、抗惊厥、预防和治疗癫痫、活化肾肝、促进精子受精等功能[1]。
人体本身对GABA有一自我调节的系统，当缺乏时会产生焦躁、不安、疲劳、忧郁、失眠、等症状。
在人脑中，虽然GABA可由脑部的谷氨酸在脱羧酶的作用下转化而成，但是年龄的增长和精神压力加大使GABA的积累异常困难，而通过日常饮食补充可有效的改善这种状况。
本文从GABA的来源、生理功能、强化方式等方面，系统的总结了最近几年有关GABA的研究成果，特别是乳酸菌利用L-谷氨酸合成GABA方面的工作。
1γ-氨基丁酸的发现早在1950年，Roberts和Frankel在哺乳动物的大脑中首先发现了GABA。
发现GABA是L－谷氨酸经谷氨酸脱羧酶(glutamic acid decarboxylase,GAD)脱羧而成，其代谢途径与三羧酸循环有关。
随后，GABA被证明是中枢神经系统的抑制性神经递质，具有重要的生理功能。
2γ-氨基丁酸生理学功能及作用机制近些年，GABA作为一种新型的功能因子，愈来愈受到人们的关注。
目前，尽管对GABA的功能尚未有完整的了解，但人们相信其有很多的生理功能，包括降低血压，镇静神经，促进精子受精，改善肝肾功能等。
GABA的生产和强化途径正成为医药、食品、农业等领域的一个热点研究内容。
2.1降低血压高血压是现代社会中、老年人常见疾病，能引起严重后果。
治疗高血压的药物较多，但不少药物具有一定程度的副作用，为此，寻找和开发副作用小的纯天然药物己成为技术领域研发工作的发展趋势。
经大量动物实验和临床医学中证明[2-8]，GABA有舒缓血管、降低血压生理功能。
哺乳动物的脑血管中有GABA－能神经支配，并存在相应受体，GABAγ-氨基丁酸的生理功效及其在乳品中的强化途径宋伟1，马霞1，张柏林2（1河北农业大学食品科技学院，河北保定071001；2北京林业大学食品科技系）摘要：综述了γ-氨基丁酸（GABA）在降低血压、改善脑机能、促进精子受精、活化肾肝方面的功能；阐述了γ-氨基丁酸的合成及强化，尤其是微生物中乳酸菌转化L-谷氨酸为GABA的方式和机制；最后比较了常用的γ-氨基丁酸的检测分析方法及其效果。
氨基丁酸的生理功能及富集的研究进展
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农产品加工·学刊
2012 年第 1 期
2.3 微生物发酵法 在早期的研 究 中 ， 发 酵 法 生 产 GABA 主 要 以 人
肠杆菌为生产菌， 发酵培养基为麸皮水解液、 玉米 浆、 蛋白陈、 矿物质等。 在发酵过程中， 利用人肠 杆菌脱羧酶的作用， 将 L- 谷氨酸转化为 GABA， 再 分离纯化得 GABA[21]。 赵景联[22]利用海藻酸钙包埋法 将大肠杆菌细胞制成大肠杆菌固定化细胞， 将转化 率提高到 100%。 但是大肠杆菌在生产安全性隐患较 大， 不能利用直接生产为食品添加剂。
据研究报道和文献专利[19]， 大豆芽、 辣椒、 南瓜、 茄子、 桑叶、 食用菌和蜜桔等均可成为制作富 GABA 的素材。 日本的罗蒂株式会社在中国申请“ 富含 GABA 的南瓜加工品的生产方法及由该方法制得的产 品” 发明专利， 在富含 GABA 的南瓜 加 工 品 的 生 产 过程中， 将谷氨酸加入南瓜中并通过南瓜中固有的 酶转化为 GABA， 采用未经盐渍处理的南瓜生产南瓜 加工品[14]。 我国的黄酒也含有丰富的 GABA， 如古越 龙山酒中 GABA 质量浓度可达 167~360 g/L， 说明有 些黄酒是一较理想的富含天然 GABA 的保健饮品[20]。
1 γ- 氨基丁酸的作用机制及生理功能
据 估 计 ， 40%左 右 的 中 枢 神 经 元 可 能 以 GABA 作为抑制性神经递质， 通过与 3 种特异性受体 GABAA， GABAB， GABAC 相互作用发挥生理活性[1]。 研究表明， GABA 在动物体内具有重要的生理功能。
GABA 的生理作用见表 1。
检测方法简单可行， 适合大规模工业化生产。 但是 异硫氰酸苯酯可能分解， 影响其生产过程的安全性。 2.2 食品原料中 GABA 富集法
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微生物发酵法制备富含γ-氨基丁酸的桑叶复合粉 作者：陈佩珊等 来源：《广东蚕业》 2019年第5期
陈佩珊 陈芳艳 （华南农业大学动物科学学院 广东广州 510642）[ 基金项目：广东省科技计划项目（2017A020208044）；国家农业部公益性行业（农业）科研专项（201403064）。
作者简介：陈佩珊（1994－），女，广西玉林人，2015级蚕学本科生。 通讯作者：陈芳艳，博士，副教授，硕士导师。] 摘 要 γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）具有神经传递、降血压、利尿和镇定等生理功能。为了开发富含GABA的桑叶产品，文章在实验室中从桑叶分离筛选到的植物乳植菌SG-5作为发酵菌种，应用于桑叶GABA的发酵富集，以桑叶为主要原料，开展四因素三水平的正交实验，得到最优配方和最优发件条件：最佳配方组合为葡萄糖2 %、蛋白胨8 %、K2HPO4 2.0 %和L-谷氨酸钠 1.5 %，各配方成分影响主次顺序从大到小依次为葡萄糖＞蛋白胨＞K2HPO4＞L-谷氨酸钠；最优发酵条件为温度为30 ℃，发酵时间36 h，接种量5%，初始含水量60%，各发酵条件影响主次顺序从大到小依次为培养温度、接种量、初始含水量、培养时间。在此最优条件下获得发酵桑叶粉的 GABA含量为31.46 mg/g，蛋白质含量为1.93 mg/g，总糖含量为34.13 mg/g，pH值为5.69。
关键词 桑叶粉；γ-氨基丁酸；植物乳杆菌；固态发酵培养 中图分类号: S888.2 文献标识码:B 文章编号:2095-1205(2019)05-01-05 γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA)是哺乳动物神经中枢的一种抑制性递质，具有调节血压、促使精神安定、促进脑部血流等作用[1～4]。1959年，Elliott 和Hobbiger通过实验证明静脉注射GABA可以使血压下降[5]。而Diana M. 等人的研究结果表明通过饮食富含GABA的功能食品亦可降低和预防高血压[6]。天然的GABA存在于蔬菜和水果等植物当中，但是其含量很低，直接在食品中添加人工合成的GABA，不属于天然产物，应用有条件限制[7～9]。通过微生物发酵的方法来提高食品中GABA的含量是一种有效的途径。可以发酵生产GABA的微生物有细菌、真菌和酵母[10～12 ]。这些菌能产生谷氨酸脱羧酶（GAD），并催化谷氨酸合成GABA。其中乳酸细菌是人和动物胃肠道中正常菌群，不仅具有抗菌、降低胆固醇、抑癌和增强免疫力等重要生物学功能，还可赋予食品特殊的风味，是具有安全性的食品微生物[13 ]。
桑叶是桑科植物的叶子，桑树在我国种植广泛，生命力极强，资源丰富。桑叶主要作为养蚕，它也是传统的中草药。桑叶作为药食两用资源的记载如《神农本草》《本草纲目》《中华人民共和国药典》均有详细的资料。20 世纪以来，我国及国际上对桑树等药物的有效成分进行大量的研究，明确其活性成分化学结构和药用功能等如黄酮类、多糖类、甾醇类、生物碱等，对这些活性物质治疗糖尿病、高血脂、高血压的疗效进行了深入的研究[14～18 ]。随着医学及相关科学的发展，桑树资源的医用价值也得到进一步拓展。本课题组研究桑叶的过程中发现桑嫩叶的GABA含量较高。在此基础上分离纯化出GABA并且用于灌胃高血压模型鼠，结果表明对高血压大鼠起到降低血压的作用。 为了提高桑嫩叶中GABA含量，达到开发降血压功能保健食品的目的，本研究将从桑叶中筛选分离出高产GABA杆物乳酸菌SG-5应用于桑叶粉的固态发酵的研究，以期低成本获得富含GABA桑叶粉，为今后开发预防和控制高血压的桑叶药食产品提供原料，拓展桑叶在医药卫生、保健食品等领域的新用途。
1 材料与方法 1.1 实验材料 材料：桑叶千目粉；试验菌株：SG-5菌株，从桑叶中分离纯化得到；试剂：GABA标准品购于Sigma公司，色谱纯；MRS培养基；LaCl3，Na2CO3，NaHCO3，KOH等均为市售分析纯。
1.2 实验方法 1.2.1 菌株的活化及扩大培养 取出冷冻的菌种，解冻后，挑取菌于MRS固体培养基上进行划线，于37 ℃恒温培养箱中培养24 h。24 h后MRS固体培养基上长出许多白色菌落，重复2次划线，出现单个菌落。挑取单菌落接入装有10 mL MRS液体培养基的离心管中，于37 ℃恒温培养箱中震荡培养8 h。8 h后离心管底部出现白色混浊，摇匀，按2 %接种量接入50 mL MRS培养基中于37 ℃恒温培养箱中培养8 h至混浊。7～8 h时菌体处于最活跃的状态，故选择接种种龄为7～8 h的SG-5菌加入桑叶粉中进行固态发酵实验。
1.2.2 固态发酵培养基配方 配制固态发酵培养基，以桑叶粉为基质，选择葡萄糖作为碳源，蛋白胨作为氮源，添加K2HPO4和L-谷氨酸钠作为生长因子。以发酵产物中GABA的含量为指标，研究葡萄糖添加量、蛋白胨添加量、K2HPO4和L-谷氨酸钠4个主要因素对固体发酵的影响，进行四因素三水平L9 (34 )正交试验确定最佳培养基配方。按正交试验设计表1安排实验。以10 g培养基为例，2 %葡萄糖即称量0.2 g葡萄糖加入到培养基中。
1.2.3 固态发酵条件的确定 发酵条件主要研究初始含水量、菌体接种量、发酵时间和发酵温度对固体发酵的影响，以产GABA的含量为指标，进行四因素三水平L9 (34 )正交试验确定固体发酵培养的最佳条件。按正交试验设计表2安排实验。
1.2.4 Berthelot比色法测定GABA的含量 参照陈恒文等的检测方法，以不同浓度的GABA标准样品绘制标准曲线[19]。得到回归方程为y=0.2283 x+0.0072 ，R2=0.9952 。
称取1 g样品，放入50 mL三角瓶中，加入20 mL无菌蒸馏水和适量玻璃珠，在37 ℃恒温培养箱中震荡2 h,转速约为170～220 r/min。将震荡后的浑浊液以8 000 r/min的转速离心10 min，取上清液，测定样品中GABA的含量。
1.2.5 蛋白质含量测定 蛋白质含量的测定按Bradford的方法[20 ]。以不同浓度的牛血清白蛋白标准样品绘制标准曲线，得到标准曲线公式y=0.8243 x-0.001 ，R2=0.9932 。
称取1 g经过干燥后的样品，加入蒸馏水9 mL，以170 ～190 r/min震荡30 min，过滤取滤液测定蛋白质的含量。
1.2.6 总糖含量的测定 采用蒽酮比色法测定总糖含量[21]。以不同浓度的葡萄糖标准品绘制标准曲线，到标准曲线公式y=0.3178 x+0.0046 ，R2=0.9947 。
称取1 g干燥后样品，加入1.25 % HCL 100 mL，沸水浴2h，过滤取滤液用蒸馏水定容至100 mL备用，加I2-KI以防变色，取滤液测定总糖的含量。
1.2.7 pH值测定 取样品1 g，加蒸馏水9 mL，于摇床上175 r/min震荡30 min，过滤取滤液，用pH仪测定滤液pH值。
2 结果与分析 2.1 确定培养基配方 研究葡萄糖添加量、蛋白胨添加量、K2HPO4和L-谷氨酸钠4个主要因素对固体发酵的影响，每个因素设3个水平，进行四因素三水平L9 (34 )正交试验，共9组试验号。以发酵产物产GABA的量为指标，实验结果见表3，对结果进行方差分析见表4～表6，确定最佳培养基配方。
正交试验结果(表4)表明，影响桑叶粉固态发酵配方的主次顺序从大到小依次为葡萄糖添加量、蛋白胨添加量、K2HPO4和L-谷氨酸钠。葡萄糖添加量对GABA产量的影响最为显著，其影响为(见表5)：三个水平中葡萄糖增加量与GABA产量成反比。当葡萄糖添加量为2 %时，GABA产量最高，且明显大于添加量为6 %和10 %，葡萄糖添加量2 %时GABA产量的平均值是添加量10 %时的三倍。其次，表6可见蛋白胨添加量对GABA产量的影响也较大，与葡萄糖添加量相反，随着蛋白胨的增加，GABA产量也越来越高。K2HPO4添加量的影响次于蛋白胨添加量，最佳添加量为2.0 %。L-谷氨酸钠添加量的影响最小，添加量在0.5 %和1.0 %时GABA产量并无多大差别。
分析结果得出培养条件的最佳组合为葡萄糖添加量2 %、蛋白胨添加量8 %、K2HPO4 2.0 %和 L-谷氨酸钠 1.5 %。
2.2 确定发酵条件 研究葡萄糖添加量、蛋白胨添加量、K2HPO4和L-谷氨酸钠4个主要因素对固体发酵的影响，每个因素设3个水平，进行四因素三水平L9 (34 )正交试验，共9组试验号。以发酵产物产GABA的量为指标，得到实验结果（表7）并进行方差分析，确定固体发酵培养的最佳条件。
正交试验(表8)结果表明，四个因素中，对影响桑叶粉固态发酵条件最大的是发酵温度、接种量、初始含水量、发酵时间。表9可见，当发酵温度设定为30 ℃时，GABA产量明显比发酵温度设定为35 ℃和40 ℃时高，30 ℃的GABA平均产量几乎是35 ℃时的两倍。其次，接种量对GABA产量的影响也较大，接种量与GABA平均产量不成线性关系。接种量为5 %时，GABA产量最高。初始含水量的影响次于接种量，最佳添加量为60.0 %。发酵时间的影响GABA产量最不显著，GABA产量平均值差别不大。
分析结果得出固态培养基配方的最佳组合：发酵温度为30 ℃，发酵时间为36 h，接种量5 %，初始含水量60 %。
2.3 发酵产物主要成分及pH值测定 发酵后的桑叶粉细粉末呈棕绿色，较松软，散发出发酵酸菜的气味，而发酵液气味较清香。对富含 γ-氨基丁酸桑叶粉发酵产物中的主要成分进行测定，测出在最佳配方及最佳培养条件下产GABA的量为31.46 mg/g，而未发酵桑叶粉产 GABA的量为2.77 mg/g，最佳条件下GABA的产量比未发酵前提高了近11 倍。发酵产品蛋白质含量为1.93 mg/g，总糖含量为34.13 mg/g，发酵产品的pH 为5.69 。
3 讨论与结论 自从出现微生物发酵法生产GABA，最常用的菌种有乳酸菌和大肠杆菌，通常利用乳酸菌生产较安全，大肠杆菌通常与基因工程相结合进行改造，生产GABA有一定的风险；其次为酵母菌、曲霉菌等[22]。据研究，以酵母菌为菌株，在对其发酵特性的研究基础上，菌株的 GABA 质量浓度为指标开展研究，培养基配方优化后，菌株的 GABA 质量浓度提高了近 4 倍，达到 3.63 g/L[23]。李科等发现植物乳杆菌 UL-4显示出良好的耐酸耐胆盐特性；在肠道具备一定的粘附和定植能力；菌株有良好的抑菌特性，尤其是金黄色葡萄球菌，抑菌圈达到15.77 mm；UL-4还