抗菌肽的制备

出版日期：2009 年 4 月 30 日 农历四月初六 饲料添加剂是保障畜禽饲料安全的关 键因子， 也是影响猪肉品质和出口创汇的 直接因素。 开发动物内源性抗菌肽产品用 于畜牧业， 保障饲料安全性， 提高猪肉品 质，是国家重大科技专项“食品安全关键技 术” 的一个重要领域。 随着现代畜禽饲养 业集约化提高， 病原传播和入侵及各种应 激 作 用 日 益 强 化 ，使 得 肠 道 表 达 量 有 限 的 抗菌肽难以对畜禽自身的保健起很大作 用。 长期以来，人 们 一 直 通 过 在 动 物 饲 料 中添加抗生素、抗菌 药 物 类 生 长 促 进 剂 来 控 制 腹 泻 、维 持 健 康 、促 进 生 长 及 提 高 饲 料利用率。 但是大量 使 用 抗 生 素 、抗 菌 药 物在抑制病原 微生物的 同 时 ，也 抑 杀 了 动 物体内生理性微生物 ，破 坏 了 微 生 物 种 群 或群落间相互制约的 微 生 态 平 衡 ，从 而 导 致动物， 特别是幼龄动物对病原微生物的 易 感 性 ；同 时 ，抗 生 素 、抗 菌 药 物 的 长 期 使 用 会 导 致 耐 药 菌 株 的 产 生 ，而 这 些 耐 药 菌 株在一定条件下又能将耐药因子传递给其 他细菌，使其他异种菌也变成耐药菌株，为 动物疾病的控制与治疗带来麻烦。 有些人 畜共用的抗生素所产生的耐药菌株。 甚至 会对人类疾病的防治造成严重影响。因此， 很多国家通过立法禁止使用部分抗生素、 抗 菌 药 物 。 为 了 寻 找 抗 生 素 的 替 代 品 ，生 产出既能防止畜禽疾病发生，促进生长，副 作用又小、无残留、无耐药性的绿色饲料添 加剂， 国内外许多畜牧兽医工作者进行了 随着抗生素的大量广泛用于饲料中和 人们对食品和环境质量的要求越来越高， 人 们 对 抗 生 素 的 副 作 用 认 识 日 益 加 深 ，抗 生素在饲料业中的应用， 已面临着淘汰或 禁用的局面。 应用无毒无公害的新型抗菌 剂代替抗生素作饲料添加剂， 已成为当前 国内外饲料学科的一项重要内容。 随着我 国进入 WTO ，抗生素作饲 料 添 加 剂 必 将 严 重影响畜产品在国际市场的竞争力， 应用 生物技术研究与开发新型抗菌剂是我国饲 料科学界一项紧迫的任务。 抗菌肽具广谱抗菌作用， 对畜禽具促 生长、保健和治疗疾病的功能，属无毒副作 用、无残留、无致细菌耐药性的一类环保型 制剂。 可应用生物工程的技术方法生产抗 病菌的转 基因 动 植 物 产 品 , 同 时 可 以 通 过 基因工程的技术方法大量的表达抗菌肽, 使之成为新一代肽类抗菌药的来源， 具有 出广阔的应用前景。 1 抗菌肽的分类 1 .1 哺乳动物抗菌肽 哺乳动物抗菌肽广泛存在于嗜中性 白细胞、黏膜和 皮 肤 等 。 例 如 , 在 猪 肠 中 存 在 富 含 pro-arg 、Cecropin P1 、有 78 个 氨 基 酸残基的 NK-lysin 、 在猪白细胞中分离出 5 个小分子抗菌肽 , 它们仅含 16～18 个氨基 酸残基 ; 在绵 羊 中 至 少 已 发 现 10 种 抗 菌 肽 基 因 ; 牛 中 至 少 已 发 现 30 种 抗 菌 肽 ; 另 外 , 牛奶中也分离 到 3 种 抗 菌 肽 , 它 们 具 有 抑 制肠毒性大 肠 杆 菌 , 单 核 细 胞 增 多 性 李 氏 杆菌的生长。 防御素是哺乳 动物中研究最 多的抗菌肽 , 包括两大类 :α- 防御素和 β- 防 御素。 主要存在于哺乳动物的白细胞、吞噬 细胞或小肠 的 潘 氏 细 胞 中 , 特 别 是 在 嗜 中 性白细胞中。 防御素通常由 27～54 个氨基 酸残基组 成 , 通 过 保 守 半 胱 氨 酸 构 成 3 个 稳定的链内二硫键使肽环合形成稳定的反 向平行的 β 片状结构。 哺乳动物防御素具 有保守的 6 个 半 胱 氨 酸 , 能 形 成 3 个 稳 定 的链内二硫 键 , 这 也 是 区 别 其 他 抗 菌 肽 的 主要特征之一。 防御素抗微生物谱比较广 泛,包 括 革 兰 氏 阳 性 菌 和 阴 性 菌 、螺 旋 体 、 真 菌 和 一 些 被 膜 病 毒,此 外,对 恶 性 细 胞 也 具有毒杀作用。 1.2 昆虫抗菌肽 从天蚕的免疫血淋巴中分离得到的 高 效 抗 菌 肽 Cecropins 是 最 早 发 现 的 抗 菌 肽 。 此 后 在 许 多 昆 虫 中 也 鉴 定 出 有 Cecropins 或类似 分 子 。 Lee 等 在 猪 的 肠 中 也 发 现 了 一 个 Cecropin, 这 可 能 暗 示 Cecropins 广 泛 存 在 于 动 物 中 。 Cecropins 对 各 种 大 肠 杆 菌 和 其 他 革 兰 氏 阴 性 细 菌,如 沙 门 氏 菌,具 有 很 强 活 性,且 对 某 些 革 兰 氏 阳性菌也具 有 杀 伤 活 性 , 但 对 霉 菌 和 其 他 真核细菌无细胞毒性作用。 Cecropins 为一 线性阳离子肽家 庭 , 链 长 35～40 个 氨 基 酸 残基。 Cecropins 的 cDNA 序列分析显示其 前体分子含 62～64 个 氨 基 酸 残 基 , 具 有 保
特别策划 饲料聚焦 ·
大量的研究。 研究发现， 动物抗菌肽具有代替传统 抗生素的潜力， 是近几年开发的一类新型 饲料添加剂，其优点主要表现在：抑制微生 物的生长非常迅速；抗菌谱广，不仅对植物 病原菌有强抑制作用， 而且对畜禽和水产 动物的病原菌也有很强的抑制作用； 无免 疫原性，对人畜无毒副作用；具有良好的溶 解性和热稳定性； 对较高的离子强度或较 助于基因工程的手段， 根据抗菌肽构效和 功能的关系， 将已知的抗菌肽结构进行改 造或将已知功能的抗菌肽活性部位杂合， 希望获得抗菌活力更强， 抗菌谱更广的抗 菌肽。 目前， 国内作为添加剂生产应用的主 要 是 蚕 抗 菌 肽 AD- 酵 母 制 剂 ，大 多 数 的 畜 禽试验也是围绕这种抗菌肽进行的。 温刘 发等通过在断奶仔猪的饲料中用抗菌肽代
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菌肽可促进小鸡生长和减少排泄物氮含 量。 陈晓生等，在肉鸭日粮中添加液体的蚕 抗 菌 肽 AD- 酵 母 制 剂 发 现 ，肉 鸭 血 清 代 谢 激素的活动显著增强，IGF-1 浓 度 升 高 ，营 养物质合成加强，尿素氮浓度显著降低，体 内氮排出减少， 抗菌肽能使肉鸭的产肉率 提 高 ，腹 脂 率 、内 脏 器 官 比 重 降 低 ，在 适 当 剂量时， 使用效果与金霉素基本一致。 此 外，国外有报道称，抗菌肽对饲料防霉也有 一定的效果。 以上研究虽然为抗菌肽的应用奠定 了 基 础 ，但 在 应 用 过 程 中 皆 出 现 了 单 一 抗 菌 肽 抗 菌 谱 窄 ， 活 性 难 以 保 持 的 现 象 ，使 抗菌肽难以在应用中发挥其应有的作用。 为获得杀菌活力强、 抗菌谱广的抗菌肽， 国内外研究者对杂合抗菌肽进行了广泛 的 研 究 。 金 丰 良 等 利 用 家 蝇 抗 菌 肽 Cecropin 和 猪 小 肠 中 的 抗 菌 肽 Cecropin P 和 蟾蜍中的抗菌肽 maganin 的 氨 基 酸 序 列 进 行了改造和杂和， 获得了具有自主知识产 权的杀菌谱广、杀菌活力更强的抗菌肽，并 在 改 造 的 酵 母 系 统 中 获 得 了 高 效 表 达 ，在 30 升发酵罐中得 到 扩 大 表 达 ，使 抗 菌 肽 的 表 达 量 达 到 了 28 毫 克 ／ 升 ，是 国 内 抗 菌 肽 表达的最高水平， 使抗菌肽在饲料中应用 成为可能。 广东海大集团畜牧水产研究中心 郭吉余 赵敏 刘兆金 511400
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抗菌肽的制备
大的 pH 变化 具 有 较 好 的 耐 受 性 ， 甚 至 有 抵抗消化道多肽酶水解的能力。因此，抗菌 肽越来越受到研究人员的关注。 天然抗菌肽作为饲料添加剂具有众多 传统抗生素所没有的优点， 但它在昆虫组 织中的含量很少， 直接从动物体中纯化抗 菌 肽 得 率 低 ，工 序 繁 琐 ，成 本 太 高 ，并 且 在 应用中表现出单一天然抗菌肽抗菌活力低 和抗菌谱窄等缺陷。 这些都不利于昆虫抗 菌肽在饲料添加剂中的广泛应用。 另一种 制 备 抗 菌 肽 的 方 法 是 采 用 化 学 合 成 法 ，这 种方法虽然简单容易，但价格比较昂贵，在 应用中受到了限制。目前，国内外学者都借 替抗生素，对仔猪的腹泻、生产性能等作了 比较，结果表明，抗菌肽在仔猪断奶应激期 间抗腹泻效果不比抗生素差， 适量的抗菌 肽比抗生素促生长的效果要好， 但高剂量 的抗菌肽则降低了仔猪的生长， 推测造成 这一现象的原因是高剂量的抗菌肽破坏了 猪肠道内微生物种群的平衡， 降低了猪肠 道的免疫力。黄永彤等发现，抗菌肽对肉鸡 有促进生长和提高免疫力作用， 与中草药 抗 生 素 相 比 ，在 出 栏 率 、平 均 体 重 、饲 料 效 率等方面两者均无显著性差异， 且在出栏 前 3 天停喂。 温刘发等通过饮水方式给粤 黄 鸡 添 加 抗 菌 肽 的 饲 养 试 验 结 果 表 明 ，抗
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守的信号序列和前导序列。 该基因在蚕中 有 3 个 ; 果蝇中有 4 个。 损伤和感染时诱导 该基因表达。 如注射细菌碎片或 LPS 后几 小 时 内 昆 虫 脂 肪 细 胞 中 特 异 性 mRNA 大 量 增 加 ,24 小 时 内 即 可 在 血 淋 巴 液 中 检 测 出 Cecropins 。 天然免疫细胞膜受体识别微 生物成分后 , 通过 Toll 通路而激活 NF-KB 样子。 蜂毒溶血肽是蜜蜂毒液中的一种多 肽 , 由 26 个 氨 基 酸 残 基 组 成 。 蜂 毒 溶 血 肽 可直接与红细胞的膜脂作用具有较强的溶 血作用。 Apila 是从蜜蜂体液中提取的一 种短肽 , 由 18 个氨基酸组成 , 具有高效广 谱的抗菌作用而对真核细胞无毒性。 1.3 蛙类抗菌肽 Zaslff 在 非 洲 爪 蟾 皮 肤 中 发 现 了 小 分子抗菌肽 , 称为 Magainins 。 此后相继发 现 了 多 种 蛙 类 抗 菌 肽, 如 在 非 洲 爪 蟾 中 就 有 十 多 种 抗 菌 肽, 不 仅 在 皮 肤 颗 粒 腺 表 达,也 有 存 在 于 胃 黏 膜 和 小 肠 道 细 胞 。 蛙类抗菌肽具有协同效应, 但不同的蛙 类抗菌肽很少具有同源性。 1.4 植物抗菌肽 Thionins 是最早从植物 中 分 离 的 抗 菌肽。 它们对革兰氏阳性菌、阴性菌、真 菌、酵母及哺乳动物细胞均有毒性。 其他 一些结构上与昆虫、 哺乳动物防御素结 构相似的植物抗菌肽, 称为植物防御 素。 1.5 细菌抗菌肽 细菌抗菌肽包括阳离子肽和中性 肽, 革 兰 氏 阳 性 菌 和 革 兰 氏 阴 性 菌 均 有 分泌。 例如乳 酸链球菌肽是由乳球菌产 生 的 含 3～4 个 氨 基 酸 残 基 的 短 肽 , 它 是 一种耐酸性物质 , 即使在 胃这样低 pH 环 境 中 稳 定 性 也 很 高, 能 抑 制 革 兰 氏 阳 性 菌如梭状芽孢杆菌和李氏杆菌。 2 抗菌肽的抗菌机理 抗菌肽具有广谱杀菌作用 , 抗菌作 用主要是由于在两亲性的 α 螺旋结构作 用下 , 使原核 细胞质膜上形成离子通道 ,
这种离子通道的形成改变了细胞内外的 渗透压 , 使细胞内物质大量外渗 , 起 到 杀 菌 作用。 姜明等通过电镜观察了柞蚕抗菌肽 对 大 肠 杆 菌 的 作 用,发 现 经 一 定 时 间 的 作 用后 , 在细菌外壁形成了喇叭状缺 口 , 这 说 明抗菌肽分子是以一端插入细菌细胞膜, 通 过 “打 孔 ”形 成 一 个 通 道 , 使 细 菌 细 胞 膜 破裂 , 原 生质“泄漏”而死亡。 从这点看 , 抗 菌肽的正电荷与细菌胞膜的磷脂头负电 荷 间 的 作 用 至 关 重 要,在 肽 分 子 中 N 端 α 螺 旋 的 双 亲 性 是 裂 解 细 菌 的 主 要 部 分 ,C 末端的酰胺化与广谱抗菌有关。 从而可看 出抗菌肽的抗菌机理与通过阻断大分子 的生物合成来发挥作用的抗菌素的抗菌 机 理 完 全 不 同,且 病 原 菌 不 易 对 其 产 生 耐 药 性, 因 此 该 物 质 将 成 为 新 抗 菌 药 的 来 源.。 3 抗菌肽的应用研究 温 刘 发 等 (2001) 报 道 , 通 过 50 升 发 酵 罐培养中间试验，在优化发酵条件后，用甲 醇诱导启动醇氧化酶启动子而成功表达抗 菌肽基因并分泌抗菌肽到菌体外， 培养液 中 抗 菌 肽 的 杀 菌 活 力 达 5000 单 位 ／ 毫 升 。 进一步改进培养基配方， 掌握较适宜的培 养条件，包括 PH 、温度、供气量及 搅拌速度 等 ，发 酵 生 产 周 期 可 缩 短 到 24 小 时 ，杀 菌 活力达 5600 单位 ／ 毫升。 以这些工程酵母 发酵液作试验，通过饮水摄入剂量为 60 单 位 ／ 只 /天 的 粤 黄 鸡 饲 养 试 验 结 果 表 明 ， 抗
菌肽可促进小鸡生长和减少排泄物氮含 量 , 对 粤 黄 鸡 具 有 促 生 长 、保 健 和 治 疗 疾 病 的功能。 蚕抗菌肽酵母制剂作饲料添加剂 的应用效果显著。 4 抗菌肽作饲料添加剂应用的优势 抗菌肽能耐受饲料制粒时的高温。 规 模化发酵生产抗菌肽时经高温浓缩工序， 可充分杀灭酵母菌体而不导致抗菌肽失 活， 产品在推广应用后不会出现工程菌的 扩散而导致环境生态问题。 抗菌肽杀菌机 理独特，病原菌不易对抗菌肽产生耐药性， 以工程菌工业化发酵生产抗菌肽， 可大规 模生产，生产周期短，生产成本低且不受季 节和气候变化等外在环境的影响。 再者，抗 菌肽产品具广谱抗菌作用， 对畜禽具促生 长、 保健和治疗疾病的功能， 属无毒副作 用、无残留、无致细菌耐药性的一类环保型 制剂。 总之， 抗菌肽有着独特的不同于抗生 素 的 抗 菌 机 理, 它 广 泛 存 在 于 多 种 生 物 体 内, 是 生 物 体 对 外 界 病 原 物 侵 染 而 产 生 的 一系列免疫反应的产物， 具有较强的广谱 抗菌能力。 寻找各种动物内源性抗菌物质， 以现代生物技术方法工业化生产这些在抗 病原菌上具有动物“种”专一性或特异性的 系列产品， 必将成为替代抗生素的新型饲 料添加剂。 广东佛山科学技术学院动物科学系 田萍 姚武群 528231
绿色饲料添加剂—— —抗菌肽
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