禽流感病毒检测方法论文
禽流感的流行特点和检测技术
中国动物保健2021.06禽流感（avian influenza ，AI ）的潜伏期一般较短，通常为4～5d 。
发病时精神沉郁，食欲、饮欲降低甚至废绝，被毛散乱，体温升高，趴卧不动，偶有流泪。
头部、面部水肿，脚鳞发紫出血，肉垂和鸡冠呈干枯紫色，甚至坏死。
呼吸困难，咳嗽，听诊呈啰音；下痢，粪便呈淡黄或白色。
出现神经症状，共济失调，不能站立或行走。
并且该病为人畜共患病，处理不好不但会危害养禽业的经济发展，还会危害人类身体健康。
1禽流感的流行病学特点1.1传染源主要由感染或携带禽流感病毒的鸡、鸭、鹅等家禽，野外野生鸟类，特别是迁徙性水禽相互传染所致。
1.2传播途径主要通过病禽的分泌物、排泄物、尸体，污染的饮水、饲料和其他物体，直接或间接接触引发感染，主要感染途径为呼吸道和消化道，以及直接接触病毒毒株感染。
人工接种可通过气溶胶经口鼻内、气管内、眼结膜、腹腔、肌肉、静脉和泄殖腔内等途径使易感禽类感染。
1.3易感动物禽流感病毒在世界范围内广泛分布。
许多家禽、野禽、人类、特别是鸭等迁徙水禽，发生病毒感染的概率比其他禽类高，而家养的鸡和火鸡所发生的流感最为严重。
1.4特点多为大流行，世界范围流行。
过去呈三年小流行，五年大流行。
该病主要在寒流较多，气温变化大的秋冬、冬春交替季节流行。
2禽流感的检测技术2.1血清学诊断技术中和试验中和试验的操作步骤复杂，容易造成材料的浪费，临床上不常用，但其为最原始的病毒检测技术，常用来做标准与其他检测方法作比较。
本试验常用鸡胚或组织培养细胞作为样本鉴定禽流感病毒。
中和试验是具有高度的灵敏性和特异性的血清学方法，抗体只和病毒上表面抗原相对应，特别是已吸附的宿主细胞上的病毒颗粒表面的抗原相对应。
所以，在某种特定血清型的中和实验中，抗体只和组内的其他病原发生有限的交叉反应。
琼脂扩散试验琼脂扩散试验检测禽流感时，以具有血凝素活性的鸡胚尿囊液作为样品，采用已知的阳性血清和未知抗原进行病毒抗原型的特异性鉴定。
禽流感病毒检测方法研究进展
亓文宝［１］等用钌联吡啶标记 Ｈ９亚型 ＡＩＶ的单克隆抗体， 用生物素标记 Ｈ９亚型 ＡＩＶ的多克隆抗体，优化生物素化多抗 和钌标单抗最佳工作浓度，确定临界值和反应谱，对所建立的
收稿日期：２０１８－１０－１７
方法进行敏 感 性、特 异 性 和 重 复 性 试 验。 结 果 表 明 所 建 立 的 Ｈ９亚型 ＡＩＶ型特异性电化学发光免疫检测方法可以用于临床 样品检测，对 Ｈ９亚型禽流感的监测和防控具有重要意义。 " #& 纳米荧光检测方法
张曼［３］等根据 ＧｅｎＢａｎｋ已登录的 ＡＩＶ的 Ｍ基因、ＮＤＶ的
Ｆ基因和 ＦＡＶ－４的基因序列合成 ３对引物，通过优化反应条
件，建立了同时 鉴别 ３种 病 毒 的 多重 ＰＣＲ方法，并 对其 特 异
性、敏感性和重复性进行检验。该方法能快速鉴别 ３种病毒，
敏感性较强，结 果 显 明 所 建 立 的 ＡＩＶ、ＮＤＶ和 ＦＡＶ－４多 重
２０１８年第 １１期（总第 ３５４期）
畜禽业
试验研究
禽流感病毒检测方法研究进展
王 瞡
（海南省动物疫病预防控制中心，海南 海口 ５７０１００）
摘 要：禽流感被我国列为一类传染病，其病毒具有变异性强、传播速度快、病亡率高的特征，严重威胁养禽业的发展及 人类生命安全。全球对其疫情防控的原则是早发现、早隔离、早诊断、早控制，因此，建立有效的检测方法尤为重要。从 病原学和血清学两方面入手，对禽流感最新研究方法进行综述，以期为准确高效地诊断该病提供技术支撑。 关键词：禽流感；聚合酶链式反应；酶联免疫吸附试验；检测方法 中图分类号：Ｓ８５２．６ 文献标识码：Ａ ＤＯＩ：１０．１９５６７／ｊ．ｃｎｋｉ．１００８－０４１４．２０１８．１１．００８
禽流感病毒的监测及诊断
定结 果 为 阳 性，则 说 明 尿 囊 液 中 很 可 能 含 有 ＡＩＶ。 如果第一代分离物 血 凝 试 验 结 果 呈 阴 性，尿 囊 液 样 本 再 用 鸡 胚 传 １～２ 代 ，采 用 相 同 方 法 观 察 鸡 胚 的 发 育情况和检测尿囊液中的血凝活性。因为有些检测 样本中的病毒含量 很 低，需 要 通 过 鸡 胚 连 续 培 养 来 获得高滴度的病毒。 经鸡胚培养分离出具有血凝活性的 ＡＩＶ 后，可 以通过血 凝 抑 制 试 验 （ＨＩ）、神 经 氨 酸 酶 抑 制 试 验 （ＮＩ）来鉴定 ＡＩＶ 的 亚 型。 病 毒 分 离 法 和 血 清 学 方 法的优点 在 于 它 们 可 以 用 来 准 确 判 断 是 否 发 生 了 ＡＩＶ 的感染。 然 而 它 们 却 难 以 监 测 环 境 中 由 于 突 变不断产 生 的 新 的 ＡＩＶ 变 异 株［１０］，这 主 要 是 由 于 人们常常缺乏 针 对 新 出 现 的 ＡＩＶ 抗 原 变 异 株 起 特 异 性 反 应 的 血 清 、抗 体 及 相 关 的 标 准 诊 断 试 剂 。 ２．２ 病毒特异性抗 原 的 检 测 法 病 毒 特 异 性 抗 原 检测法采用的 原 理 主 要 利 用 针 对 ＡＩＶ 特 异 性 抗 原 的抗体来捕获 ＡＩＶ 特异性抗原，例如琼脂扩散试验 及酶联免疫吸 附 试 验 等 。 ［１１］ 目 前 已 有 检 测 ＡＩＶ 特 异 性 抗 原 的 试 剂 盒 问 世 。 ［１２］ 由 于 ＡＩＶ 的 核 蛋 白 （ＮＰ）相对保守，不 易 变 异，所 以 目 前 采 用 的 病 毒 抗 原捕获免 疫 测 定 主 要 是 用 来 检 测 ＡＩＶ 的 核 蛋 白。 ＡＩＶ 特异性抗原检测法的优点是快速，据报道有些 方法可以在３０ｍｉｎ 之 内 得 到 检 测 结 果 。 ［１３］ 目 前 可 以检 测 ＡＩＶ Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３ 及 Ｎ７ 亚 型 的 抗 体 的 ＥＬＩＳＡ 方法均已 建 立 。 ［１４］ 但 抗 原 测 定 法 目 前 存 在 的主要问题是检测敏感度低于病毒分离法及病毒核 酸检测法，同时 对 所 测 样 品 的 质 量 要 求 较 高。 检 测 ＡＩＶ 特异性抗 体 的 试 剂 盒 则 可 用 于 评 估 鸟 类 或 禽 类是否曾接触或感染过 ＡＩＶ。 ２．３ ＡＩＶ 的 毒 力 测 定 ＡＩＶ 的 毒 力 主 要 是 通 过 ６ｗ龄 鸡 体 实 验 的 静 脉 内 致 病 指 数 （Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｉｎｄｅｘ，ＩＶＰＩ）来判定，即若 ＡＩＶ 在６ｗ 龄 鸡 体 内 的ＩＶＰＩ大 于１．２ 时 ，则 认 为 被 检 毒 株 属 于 ＨＰＡＩＶ［９］。另一 常 用 的 判 定 毒 力 方 法 是，当 ＡＩＶ 经静脉途 径 感 染 ４～８ ｗ 龄 鸡 后，若 在 １０ｄ内 引 起 至少 ７５％ 的 鸡 群 死 亡，则 也 可 以 将 所 测 定 的 ＡＩＶ 毒株划 归 为 ＨＰＡＩＶ［９］。 研 究 结 果 表 明，目 前 所 发 现的 ＨＰＡＩＶ 大多是 Ｈ５ 或 Ｈ７ 亚 型。 尽 管 仍 有 不 少 Ｈ５或 Ｈ７亚型的 ＡＩＶ 是 ＬＰＡＩＶ，可是一旦它们 经基 因 突 变 或 基 因 重 配 后 就 很 有 可 能 形 成 ＨＰＡＩＶ，感 染 新 的 宿 主 。 判 断 Ｈ５ 或 Ｈ７ 亚 型 的 ＬＰＡＩＶ 有 无 可 能 成 为 ＨＰＡＩＶ 的一个 常 用 标 准 是：通 过 序 列 测 定 检 查 病 毒 ＨＡ 前体 中 的 蛋 白 酶 裂 解 位 点 附 近 是 否 含 有 多 个碱性氨 基 酸。 人 们 发 现 在 ＨＡ 前 体 蛋 白 裂 解 位
禽流感流行病抗体检测HI试验方法 的诊断与预防
禽流感流行病抗体检测HI试验方法的诊断与预防摘要】禽流感是由A型流感病毒引起的禽类一种从呼吸系统到全身败血症等多种症状的传染病。
此后,这种疫病更名为禽流感。
高致病性禽流感发病率、死亡率高,感染的鸡群常常“全军覆没”;低致病性禽流感可使禽类出现轻度呼吸道症状,食量减少,产蛋量下降,出现零星死亡;非致病性禽流感不会引起明显的症状,仅使传染的禽类体内产生病毒抗体。
【关键词】禽流感流行病诊断【中图分类号】R511.7 【文献标识码】A 【文章编号】1672-5085（2013）49-0078-021 流行病学一般禽流感的病毒都会有很多的病种、水禽和野生的鸟类都是能够可以让禽流感传播的病菌。
家里面养的鸡和火鸡都是很容易传播病菌的，然后就是雏鸡和孔雀，鸭、鹅和鸽这样写动物都是病菌传播的比较少的。
传染源为多种带毒动物或患病动物,最重要是水禽,如鸭、鹅。
2 临床症状2.1临床表现我们常常以呼吸道和消化道症状为主。
排黄绿色粪便、产蛋下降、神经症状、角弓反张肿头、冠和肉髯紫黑色血斑、跖部鳞片出血、饮水量减少。
分为3种即急性型、呼吸道型、野禽的隐性型感染。
2.2病理变化高致的病变一般就是坏死，主要的就是消化器官为主；有的病性直接就会破坏泌尿生殖道，不是致病的病情就会不影响病理的变化。
2.3诊断方法及程序2.3.1 流行病学禽流感病毒的宿主广泛,鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑和雉鸡等家禽及野鸟、水禽、海鸟等均可感染。
一般鸡和火鸡都是对病毒禽流感最严重危害的，然而鸭子体内的病毒就比其他的禽类多很多。
2.3.2 临床症状禽流感的潜伏期一般都是从几个小时到3d都是不一定的，有的时候时间的长短都是看感染病毒的毒力和剂量、感染的一些途径、还有就是感染禽的种别和禽体得一些状态。
3 稀释液的配制一定使用PH7.2的PBS液，摄氏121度灭菌15分钟，冷却后，摄氏4度恒温保存备用。
灭菌的时间和温度及恒温保存是关键要素，不能随意改变。
也可先配制浓缩的PBS液保存，每次使用时稀释。
禽流感病毒通用型荧光RT—PCR快速检测方法的应用
禽流 感病毒通 用型荧光 Ｒ — ＣＲ快 速检测 方法的应用 ＴＰ
王 海 斌 （ 天津市动物卫生监督所 ３ ０ １ ） ０２ １
荧光 Ｐ Ｒ技术 是将 荧 光 素标记 的探 针与 引物 一 Ｃ 起， 在荧 光 Ｐ Ｒ仪 中反应 ， Ｃ 电脑 对整 个 反应 进行 实 时 监测 ， 免 了交 叉 污染 ， 大提 高检 测 的敏感 性 。荧 避 大 光 Ｐ Ｒ的与 普通 Ｐ Ｒ 比较 ，敏感 性 提 高 约 １０倍 ， Ｃ Ｃ ０ 可检 测到组 织 中的微 量病 毒 。 液 体 吸干 ，室 温 干燥 １５分钟 。加入 １ 升 Ｄ Ｐ ～ ５微 ＥＣ 水 ， 弹混 匀 ， 轻 溶解 管壁 上 Ｒ Ａ，ｌｃ 以下备用 。 Ｎ 一 ８《 ＝
微升氯仿 ， 震荡混匀。 静置 ５ 分钟 ，２ ０ 转 ／ １ ０ ０ 分钟离 心 １ Ｏ分钟 。
分别 吸取 各 管 中的上 层 液 相 转 移 至 新 的 １ ． ５毫 升 无 Ｒ Ａ酶 污染 的离 心 管 中 ，加 人 ２ ０微升 一 ０ Ｎ ０ ２℃
３ 结 果 判 断
检测 样 本 Ｃ 值 小 于等 于 ３ ， 曲线 有 明显 的 指 ｔ Ｏ且 数增 长期 ， 定结 果有 效 ， 测 可直 接报 告样 本 阳性 。
荧 光 Ｐ Ｒ反 应 条 件 如 下 ：第 １步 ，０Ｃ，０分 Ｃ ５￣ ３ 钟 ；５ｃ， ９ ｃ ３分钟 ， 个 循 环 ； ２步 ，５【， ；０Ｃ， １ 第 ９ ａ ５秒 ６ ￣ ＝ ４ ０秒 ，０个 循 环 。反应 体 系设 为 ２ 微 升 。 ４ ５ 对 于 Ｒ ｃｅ 光 Ｐ Ｒ仪 ，变 性 温度 改 为 ９ ｏ ｏｈ 荧 Ｃ ３Ｃ，
预冷 的异丙醇 ， 做好标记 ， 颠倒混匀 。静置 ５分钟 ，
禽流感实验室检测技术方案
禽流感实验室检测技术方案禽流感，这个让无数人闻之色变的词汇，已经成为我们生活中无法回避的一部分。
如何快速、准确地检测出禽流感病毒，成为了当务之急。
今天，就让我来为大家详细介绍一下禽流感实验室检测技术方案。
我们需要明确检测的目标。
禽流感病毒有多种亚型，我们要检测的是哪些亚型，需要根据实际情况来确定。
一般来说，H5和H7亚型的禽流感病毒对我国养殖业和公共卫生安全威胁较大，因此，我们将重点检测这两种亚型。
我们要选择合适的检测方法。
目前，实验室检测禽流感病毒的主要方法有病毒分离、血清学检测和分子生物学检测。
病毒分离是传统的检测方法，准确性较高，但操作复杂，耗时较长。
血清学检测通过检测抗体来判断病毒感染情况，速度快，但准确性相对较低。
分子生物学检测，尤其是实时荧光定量PCR技术，具有高灵敏度、高特异性、快速简便等优点，成为近年来禽流感病毒检测的主流方法。
下面，我将详细介绍实时荧光定量PCR技术在禽流感实验室检测中的应用。
一、实验材料1.样本：采集疑似感染禽流感的家禽咽喉拭子、泄殖腔拭子等。
2.试剂：实时荧光定量PCR试剂盒、病毒提取试剂盒等。
3.仪器：实时荧光定量PCR仪、离心机、恒温箱等。
二、实验步骤1.样本处理：将采集的拭子样本放入病毒提取试剂盒中，按照说明书操作，提取病毒RNA。
2.模板制备：将提取的病毒RNA与实时荧光定量PCR试剂盒中的缓冲液、酶混合，进行模板制备。
4.结果分析：观察实时荧光定量PCR仪上的扩增曲线和溶解曲线，判断样本是否为阳性。
三、注意事项1.实验过程中要严格遵循无菌操作原则，防止样本污染。
2.实验室人员要具备一定的分子生物学实验技能，确保实验顺利进行。
3.实验结果要及时记录，并与临床诊断相结合，为疫情防控提供有力支持。
通过实时荧光定量PCR技术，我们可以快速、准确地检测出禽流感病毒，为我国养殖业和公共卫生安全保驾护航。
当然，实验室检测只是禽流感防控工作的一部分，我们还需要加强疫情监测、疫苗接种、生物安全等措施，共同抵御禽流感病毒的侵袭。
肉鸡致病性禽流感检测调查与防治
摘 要：随着时代的发展，养禽业的发展速度和规模扩张越来越快，并逐渐成为我国农民实现收入增长的一项重要产业。
在养禽业中，肉鸡养殖的效益较为明显，但是禽流感作为影响行业发展的一大难题，对肉鸡养殖业健康的发展危害很大。
因此，本文以肉鸡禽流感为研究对象，对其流行病学和防治措施进行了深入调查和分析。
从而实现对该种疾病的有效防治。
关键词：肉鸡；禽流感；防治禽流感，顾名思义就是一种禽类的流行性感冒，具有感染性和疾病综合征，其主要是由A型（Avian）流感病毒引起，因此禽流感的英文简称为AI[1]。
一般而言，感染了禽流感的禽类会患有全身性的传染病或者是呼吸器官方面的传染病。
本文将肉鸡为研究对象，重点探究肉鸡禽流感的防治方法，希望能够为我国肉鸡养殖业的健康发展提供一定的帮助作用。
1 禽流感概述禽流感主要是由A型（Avian）流感病毒引起的禽类烈性传染病。
该类传染病有多种临床综合症状，如LPAIV和HPAIV，即低致病性和高致病性禽流感。
对于肉鸡来说，感染了LPAIV后会引起肉鸡患有轻度呼吸系统疾病，表现为食量下降、情绪抑郁、体重减小等。
目前，造成禽流感的A型流感病毒可以分为不同的亚型，其中根据神经氨酸酶和血凝素等表面抗原可以分为16种血凝素亚型和9种神经氨酸酶。
2 材料和方法2.1 材料2.1.1 肉鸡致病性禽流感的调查材料（1）疾病调查对象鉴于研究的方便性，本研究将2014～2015年内本地某较大规模的肉鸡养殖场所有发病的肉鸡为主要分析和研究对象。
（2）血清调查被调查的血清是取自本地2014～2015年某较大规模肉鸡养殖场的发病和未发病的不同日龄的肉鸡。
在检测检验中，肉鸡血清有的是在禽流感发病初期采取的，有的是在其发病15d之后采取的血清，有的则是采自疫苗免疫肉鸡的血清。
2.1.2 诊断试剂（1）阳性血清和抗原禽流感阳性血清和抗原都是从本地兽医研究所购买，其中禽流感阳性血清和抗原的批号分别为1402081、1500328、1450476、1502984。
禽流感病毒的分离与鉴定技术
禽流感病毒的分离与鉴定技术孙建宏,刘景利,张从禄①（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，黑龙江哈尔滨150001）①摘要：禽流感病毒的诊断一般是通过鸡胚分离病毒，检测其血凝活性，并应用琼脂扩散试验或其他试验确定其是否为禽流感病毒，再进一步进行亚型鉴定、致病力测定。
如果是H5或H7亚型，还应采用PCR等方法对血凝素裂解位点的氨基酸序列进行测定。
①关键词:流感病毒;分离;鉴定①禽流感（Avianinfluenza，AI）由正黏病毒科A型流感病毒属的流感病毒引起。
该病毒的血清型分为15个HA亚型和9个NA亚型。
禽流感病毒可感染各种家禽和野禽，但多数呈亚临床感染。
一些H5和H7亚型可引起高致病性禽流感，可使鸡群100%死亡。
高致病性禽流感因其传播快、危害大，有的血清型可感染人，世界动物卫生组织（OIE）将其列为A类动物疾病，我国将其列为一类动物疫病。
①禽流感病毒的诊断可以根据临床症状、剖检变化做出初步诊断，进一步确诊需进行实验室检测。
目前一般是通过病毒分离和血清学试验检测病毒或是检测感染鸡的抗体进行鉴定。
近年来，随着分子生物学技术的发展，RT-PCR方法日臻成熟，也逐渐成为一种常用的诊断技术。
文章对这些禽流感的诊断技术分别做一些介绍。
①1禽流感病毒的分离①样本可采集死禽样本或活禽样本。
死禽样本一般采集肠内容物或泄殖腔拭子、鼻拭子、咽喉拭子以及内脏组织（气管、肺、气囊、肠、脾脏、肾、脑、肝脏和心脏等）；活禽样本可采集气管拭子、泄殖腔拭子。
由于采集棉拭子时幼禽容易受伤，所以还可取粪便。
①采集的拭子放入1.0mLPBS（pH7.0～7.4，含抗生素）的离心管中，静止作用30min。
对于泄殖腔拭子和粪便，用过滤器过滤除菌，上清液作为样本。
内脏样本应无菌取样，放于灭菌的玻璃研磨器，用PBS配成100g/L的悬液，加入1/10体积的抗生素，将处理过的样本移至离心管内，3000r/min离心10min，取上清液接种。
①采集或处理的样本在2℃～8℃条件下保存应不超过24h；如果需长期保存，需放置-70℃条件，但应避免反复冻融（最多冻融3次）。
禽流感病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立
禽流感病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立王楷宬;王素春;朱琳;仲焕香;黄保续【摘要】为满足禽流感病毒高通量快速检测的需要,建立了一种能够检测各亚型禽流感病毒的实时荧光定量RT-PCR检测方法,并对该方法的特异性和灵敏度进行评估,使用该方法与农业行业标准NY/T772-2013中的禽流感病毒RT-PCR方法同时进行临床样品检测.结果显示,该方法检测耗时短、特异性好,检测下限达10-4ng/μL,与传统的RT-PCR方法阳性符合率为100％.结果表明,本方法能实现对禽流感病毒的安全、特异、快速、灵敏、简单、高通量检测,从而弥补了现有传统检测技术的不足.【期刊名称】《中国动物检疫》【年(卷),期】2019(036)004【总页数】6页(P64-69)【关键词】禽流感病毒;实时荧光定量RT-PCR;检测【作者】王楷宬;王素春;朱琳;仲焕香;黄保续【作者单位】中国动物卫生与流行病学中心,山东青岛266032;中国动物卫生与流行病学中心,山东青岛266032;中国动物卫生与流行病学中心,山东青岛266032;南京农业大学,江苏南京210095;中国动物卫生与流行病学中心,山东青岛266032【正文语种】中文【中图分类】S852.65禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）为单股负链RNA病毒，由 8个独立的RNA节段组成。
该病毒的显著生物学特征之一是亚型众多、变异频繁。
迄今为止从禽类体内已经分离到上千种毒力各异的毒株，根据病毒粒子表面的血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）的抗原性差异，将其分为18种HA亚型（H1～H18）和11种 NA 亚型（N1～N11）[1-3]。
禽流感分布很广，世界各地均有分离出该病病原的报道。
其病原致病性有高致病性和低致病性之分。
禽流感的发生给养禽业造成严重危害。
据联合国粮农组织（FAO）报告，2003—2004年禽流感在越南暴发导致的损失预计为该国GDP的0.3%～1.8%[4]。
ELISA 技术在禽流感诊断研究中的应用
ELISA 技术在禽流感诊断研究中的应用摘要：禽流感（AI）是目前禽类流行的主要疫病之一，给养禽业和人类健康带来了巨大危害。
由于禽流感病毒血清型众多，致病疫情多样，因此，适时的检测和早期快速诊断是预防和控制禽流感的前提条件。
ELISA 方法以其特异、灵敏、快速、简便，可迅速检测大量样品，使用仪器设备少，利于基层操作等优点成为AI 流行病学普查及早期快速诊断的最实用和有效的方法。
关键词：禽流感ELISA 诊断禽流感（Avian Influenza，AI）是由A 型流感病毒所引起禽类的感染和/或疾病综合征，1878 年首次发生于意大利，目前已在全世界广泛流行，被国际兽疫局确定为A 类传染病。
禽流感病毒感染后引起的临床症状和病理变化，因感染禽的种类、年龄、免疫状况、继发或混合感染状况、病程长短及感染毒株的毒力等不同而异，易与多种禽类疫病相混淆。
因此，诸多高致病性禽流感病毒感染致人死亡的事件使禽流感的防制工作提升到前所未有的公共卫生学高度。
禽流感疫情的多样性和公共卫生学意义，使得禽流感的早期、快速诊断对于疫病的控制尤为重要，传统的鸡胚分离、琼脂扩散试验、血凝抑制试验（HI）等检测禽流感的方法，由于敏感性不高或检验时间较长，不能满足基层检疫和疫病防制的需要，因此禽流感的确诊必需依赖实验室诊断。
ELISA 检测技术以其高敏感性、高特异性、经济、简便的特点，在畜禽疫病诊断和监测中发挥了重要作用。
1 间接ELISA1.1 基于全病毒的间接ELISA黄金海等[1]应用醛化的鸡红细胞经吸附释放方法获得纯化的禽流感病毒（H9N2 亚型AIV）经处理后作为ELISA 检测方法的包被抗原。
并以不同的含量进行包被，建立了定量检测禽流感抗体水平的间接ELISA 方法。
该试验建立的ELISA 方法不仅可检测出血清中禽流感抗体的P/N 值，还可用回归方程算出ELISA 效价，实现定量测定，这为检测鸡群的抗体水平，制定合理的免疫程序提供了科学的依据。
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关于禽流感病毒检测方法的分析与讨论【中图分类号】r446【文献标识码】a【文章编号】1672－3783(2011)08－0270－01
【摘要】禽流感病毒的检测方法主要分为血清学检测和分子生物学检测两大类。
血清学检测方法包括琼脂凝胶扩散试验(agp)、血凝抑制试验(hi)、酶联免疫吸附试验( elisa)、神经氨酸酶抑制试验(nit)和病毒中和试验(vn)。
分子生物学检测方法包括rt-pcr、多重rt-pcr、多种改进的rt-pcr和基因探针技术。
【关键词】禽流感病毒;检测;血清学;分子生物学
禽流感病毒(aiv)属于正黏病毒科(orthomy xoviridae)流感病毒属,是一种a型流感病毒。
a型流感病毒感染人、猪、马、海豹、水貂、鲸及所有禽类。
在正黏病毒科中a型流感病毒是唯一感染禽类的病毒型。
禽流感病毒呈世界性分布,绝大多数禽流感病毒为隐性感染,感染动物不表现任何临床症状,只有少数禽流感病毒具有
迅速传播和高致死性的特性,称之为高致病性禽流感病毒(hpaiv)。
1 血清学检测
目前世界上普遍接受的检测禽流感病毒及抗体的标准方法有血清学诊断方法,如琼脂凝胶扩散试验(agp)可鉴定病毒或检测型特
异性的血清抗体或基质蛋白(matrix protein，mp);红细胞凝集试验(ha)和红细胞凝集抑制试验(hi)可鉴定病毒或血清抗体的亚型;神经氨酸酶抑制试验(nit)可鉴定病毒或血清抗体亚型等。
采用鸡
胚中和试验鉴定病毒或血清抗体的亚型也是一种可以接受的方法,
但相对于hi繁琐。
2 分子生物学检测技术
2.1 rt-pcr 该方法的基本原理是将从病料或鸡胚尿囊液中抽提出的禽流感病毒rna作为模板,以所设计的上游引物为引物,加入反转录酶和dntp于适合的缓冲液和温度下合成cdna(即反转录的过程)。
再以该cdna为模板,加入根据目的片段设计的上、下游引物,在dna聚合酶作用下利用dntp在pcr仪上合成新的dna链,扩增过程以变性、退火和延伸为一个循环,经25个左右的循环,dna的拷贝数理论上可达295个以上,即3355万倍,扩增产物的量已足够用琼脂糖凝胶电泳检测出来。
2.2 多重rt-pcr 在rt-pcr的基础上,再加入其他亚型或其他种病毒的特异性引物,以目的片段的不同长度相区别,可同时诊断多
个亚型或多种病毒,使检测的效率和适用性大大提高。
研究建立了禽流感病毒(aiv)a型、h5、n1、h9、n2亚型特异性rt-pcr及h5/n1、h9/n2、a/h5/n1多重rt-pcr检测技术,该方法具有快速、敏感、特异等优点,为临床样品中aiv型及h5n1、h9n2亚型鉴定和诊断的有效方法。
2.3 改进rt-pcr 在rt-pcr核酸扩增的基础上,通过再次扩增或利用特异性核酸探针联合另一种检测方法,将信号扩大2次发展起来的rt-nested pcr、实时荧光定量rt-pcr、电化学发光法、
rt-pcr-elisa等方法,进一步提高了敏感性和特异性。
在这些方法
中,禽流感病毒a型检测的灵敏性已略高于病毒分离法的水平(有些达0.150%鸡胚感染量),h亚型检测的灵敏性略低或相当于病毒分离法。
其中一些方法的敏感性已能满足直接从病料中检测出病毒亚型的要求。
2.3.1 巢氏pcr法(rt-nested pcr) 该方法灵敏度高,可检测到0.2 pg的病毒核酸,能适用于临床样品的检测。
2.3.2 实时荧光定量rt-pcr 该方法是近几年发展起来的新技术,既保持了pcr技术灵敏、快速的特点又克服了假阳性和不能定量的缺点。
目前主要有4种方法用于dna扩增产物的检测:双链dna 结合染料法、分子信标(molecular beacon)法、杂交探针法、taq man 探针法。
应用一步法rt-pcr和荧光水解型探针,引物设计参照禽流感病毒ha基因序列,可用于检测a型禽流感病毒和及其h5、h7两个亚型。
其敏感性很高,可从低至10 fg(约1000个)的靶rna分子或0.150%鸡胚感染量的病毒中检测出a型,可从低至100 fg(约1000~10000个)的靶rna分子中检测出h5、h7亚型。
将1550个气管或泄殖腔拭子的检测结果与传统病毒分离的方法相比,型鉴定结果相符率为89%(其余样品仅有一种方法的结果呈阳性);h5、h7亚型的鉴定结果则与病毒分离的方法基本一致。
2.3.4 rt-pcr-elisa 本方法通过elisa将信号进一步放大,并有探针特异性结合,与普通pcr方法相比,特异性和敏感性大大提高,敏感性方面已超过了鸡胚分离法。
通过该法对禽流感病毒弱毒株(h5n2、h7n1亚型)进行检测,与鸡胚分离法相比阳性率高出39%。
2.4 基因探针检测技术
2.4.1 地高辛标记:利用pcr技术建立并优化了检测禽流感病毒核酸的地高辛标记的cdna探针杂交法,具有良好的特异性和敏感性。
2.4.2 基因芯片技术应用寡核苷酸芯片技术对aiv亚型的检测进行了初探,将根据禽流感病毒的m基因、ns基因、h5基因、h7基因、h9基因设计而成的靶dna探针,点样于载体上制成芯片,能同时检验禽流感的型与亚型。
其主要操作过程是:以通用引物反转h5、h7、h9亚型禽流感病毒(鸡胚尿囊液样品)成cdna,在反转过程中以cy-5荧光染料标记,cdna与芯片杂交过夜(16~18 h),洗片后扫描图像。
结果能准确检测h5、h7亚型禽流感病毒,对h9亚型禽流感病毒的检测则不够理想。
3 结语
由于禽流感是一种全球性的烈性传染病,可在禽、猪和人中进行传播。
aiv极易发生基因重组与突变,弱毒株存在转强的危险,而目前尚无一套固定成熟的防制方法,因此,禽流感对养禽业构成了巨
大的威胁。
同时,aiv不仅是人流感的最大基因库,而且是可感染人类的新病毒,已对人类构成了巨大威胁,因此预防禽流感具有重要
的公共卫生意义。
参考文献
［1］王秀荣,邓国华,于康震,等.在dna芯片平台上探测aiv
不同亚型cdna ［j］.中国农业科学,2005,38(2):394~398.
［2］张应国,宋建领,胡媛媛,等.禽流感病毒及多重rt-pcr检
［3］陈宣烁,钟婉玲,郑小敏,等.禽流感病毒分子生物学的研
作者单位：110014 沈阳市红十字会医院。