基于Gateway技术的植物表达载体的构建
沙冬青AmDREB3基因的克隆及植物表达载体构建
沙冬青AmDREB3基因的克隆及植物表达载体构建张锋;王学峰;董博;王茅雁【期刊名称】《内蒙古农业大学学报：自然科学版》【年(卷),期】2012(0)Z1【摘要】脱水应答元件结合蛋白(Dehydration-responsive element/DRE binding proteins,DREBs)属于植物AP2/EREBP(APETALA2/Ethylene-responsive element binding protein)转录因子大家族中的一个亚族,在植物对低温、干旱和盐碱等非生物胁迫的适应中起重要作用。
本论文从强耐寒耐旱植物蒙古沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)中克隆到AmDREB3基因的编码区cDNA,对其编码蛋白的结构域和系统进化关系进行了分析,并将其成功构建到分别由CaMV35S和拟南芥rd29A启动子驱动的植物表达载体pCAMBIA3301上,为进一步通过转基因植物等方法验证该基因在耐逆性中的功能奠定了基础。
【总页数】5页(P133-137)【关键词】沙冬青;DREB;基因克隆;序列分析;载体构建【作者】张锋;王学峰;董博;王茅雁【作者单位】内蒙古农业大学生命科学学院【正文语种】中文【中图分类】S793.9【相关文献】1.强旱生植物沙冬青AmERF基因的克隆及生物信息学研究 [J], 李晓东;白晨;郭九峰;于卓;孙国琴;张惠忠2.沙冬青脱水素基因的克隆及表达载体的构建 [J], 乔慧蕾;王瑞刚;郭九峰;孙国琴;李国婧3.蒙古沙冬青AmDREB2.2基因的克隆与植物表达载体构建 [J], 张至玮;李章磊;高飞;曹玉震;夏波林;周宜君4.转录因子DREB1A基因的克隆与Gateway克隆技术构建植物表达载体 [J], 佟友丽;赵飞;冯君伟;李玉花5.蒙古沙冬青AmWRKY53基因表达分析及表达载体构建 [J], 夏波林;邢怡德;高飞;姜承勇;周宜君因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
农杆菌介导的油菜子叶瞬时表达
农杆菌介导的油菜子叶瞬时表达谭小力;诸葛锐军;李冠英;卢长明;王政;张志燕【摘要】A method for transient expression based on Agrobacterium infiltration into cotyledons of Brassica napus L. cv Ningyou 16 was developed with the Green Florescent Protein (GFP) as a marker gene. GFP expression vector pB2GW7. 0-gfp was constructed and transferred into agrobacterium. The addition of P19 protein improved the transient expression level of GFP in cotyledon. Reverse transcription assay showed that GFP was expressed after 4-8 days of agrobacterium infiltration. Confocal microscopical analysis revealed that epidermal cells and guard cells could be transformed by agrobacterium-based transformation method. The entire process only took 20 days from sowing seed to protein analysis. Therefore, this new method is simple and rapid. It has a potential application in dissection genes expression and function in Brassica napus.%实验以甘蓝型油菜宁油16为材料,绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,建立了农杆菌介导的油菜子叶瞬时表达系统.我们构建了GFP表达载体pB2GW7.0-gfp,并成功转化农杆菌.实验中通过添加P19来提高GFP在油菜子叶中的瞬时表达量.并提取了注射有P19和pB2GW7.0-gfp农杆菌混合液的油菜子叶RNA,经RT-PCR鉴定,发现在4 ～8 d GFP均能表达.激光共聚焦显微镜分析表明农杆菌介导的油菜子叶瞬时表达系统能够转化油菜子叶的表皮细胞和保卫细胞.甘蓝型油菜子叶瞬时表达方法简便、快速、可靠,从种子播种到获得荧光蛋白表达,全过程只需要20d.表明在研究油菜基因的表达和功能方面有潜在的应用前景.【期刊名称】《生物学杂志》【年(卷),期】2012(029)006【总页数】4页(P93-96)【关键词】甘蓝型油菜;子叶;农杆菌;瞬时表达【作者】谭小力;诸葛锐军;李冠英;卢长明;王政;张志燕【作者单位】江苏大学生命科学研究院,镇江212013;江苏大学生命科学研究院,镇江212013;江苏大学生命科学研究院,镇江212013;中国农业科学院油料作物研究所,武汉430062;江苏大学生命科学研究院,镇江212013;江苏大学生命科学研究院,镇江212013【正文语种】中文【中图分类】Q786油菜在世界各地广泛种植，在油料作物中其产量仅次于大豆与棕榈，位居第三。
实验方案gateway
实验方案Gateway® 反应的基本原理∙BP反应—构建Gatew ay® 入门克隆∙LR 反应—构建Gatew ay® 表达克隆∙一管模式—从PCR 产物构建Gatew ay® 表达克隆∙Gatew ay® 载体转化—将您喜爱的克隆载体转化成Gatew ay® 载体TOPO® TA 克隆- 创建Gateway® 入门克隆∙∙步骤一–制备PCR 产物使用Taq 聚合酶和自己的方案生成PCR 产物。
通过最后7 到30 分钟的延伸步骤，结束PCR 反应。
步骤二- 进行TOPO® 克隆反应1. 按所示顺序使用试剂，以建立以下一种TOPO® 克隆反应。
对于电穿孔，将盐溶液稀释 4 倍以制备稀释盐溶液。
试剂化学转染电穿孔法新鲜的PCR 产物0.5 至 4 µl 0.5 至 4 µl盐溶液 1 µl --稀释盐溶液-- 1 µl无菌水至终体积为 5 µl 至终体积为 5 µlTOPO® 载体 1 µl 1 µl总体积 6 µl 6 µl∙2. 轻轻混合并在室温下孵育 5 分钟。
3. 置于冰上，然后开始转化One Shot® 化学感受态 E. coli，步骤如下步骤三- 转化One Shot® 化学感受态E. coli1. 每次转化时，解冻置于冰上的一小瓶One Shot® E. coli 细胞。
2. 在一小瓶One Shot® 化学感受态E. coli 中加入 2 µl TOPO® 克隆反应液，轻轻混匀。
3. 在冰上孵育 5 至30 分钟。
4. 将细胞置于42°C 下热休克30 秒，不振荡。
立即将试管转移至冰上。
5. 加入250 µl 室温S.O.C. 培养基。
非生物胁迫诱导的棉花酵母双杂交文库构建及GhJAZ1互作蛋白筛选
核农学报2023，37（11）：2158~2165Journal of Nuclear Agricultural Sciences非生物胁迫诱导的棉花酵母双杂交文库构建及GhJAZ1互作蛋白筛选蔡肖李兴河王海涛刘存敬唐丽媛张素君张建宏*（河北省农林科学院棉花研究所/农业农村部黄淮海半干旱区生物学与遗传育种重点实验室/国家棉花改良中心河北分中心，河北石家庄050051）摘要：非生物胁迫导致棉花生长发育受到抑制，严重影响棉花的产量和品质。
为了深入探究棉花非生物逆境响应的分子作用机制并鉴定GhJAZ1的互作蛋白，本研究以陆地棉标准系TM-1为材料，采用Gateway重组技术构建了非生物胁迫诱导的陆地棉酵母双杂交cDNA文库，获得的初级文库总克隆数为1.2×107 CFU，次级文库总克隆数为1.6×107 CFU，重组阳性率100%，酵母文库滴度为5.0×107 cells·mL-1，酵母克隆平均插入片段>1 000 bp，符合建库标准，可用于后续酵母双杂交筛选。
以GhJAZ1为诱饵，构建pGBKT7-GhJAZ1诱饵蛋白表达载体，经毒性检测及自激活活性检测，明确了诱饵质粒在酵母系统中无毒性和自激活活性，可直接用于酵母文库筛选。
利用酵母双杂交筛选构建的非生物胁迫诱导的酵母cDNA文库，得到72个初筛阳性克隆，经测序、序列比对和酵母回转验证，获得11个与GhJAZ1相互作用的候选蛋白。
选取其中4个候选蛋白，利用酵母双杂交进一步确认了GhJAZ1与候选蛋白的相互作用关系。
本研究结果为深入分析棉花非生物胁迫响应的调控网络奠定了良好的基础，为解析GhJAZ1低温应答分子机理提供了重要参考。
关键词：棉花；互作蛋白；酵母双杂交；非生物胁迫；GhJAZ1DOI：10.11869/j.issn.1000‑8551.2023.11.2158JAZ（Jasmonate ZIM-domain）蛋白作为E3泛素连接蛋白降解复合体SCF COI1的靶蛋白，是茉莉素（jasmonic acid，JA）信号转导途径中重要的转录抑制因子之一［1-2］。
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基于Gateway技术的植物表达载体的构建郭姗姗;张蒙;单卫星【摘要】[目的]为方便基于植物瞬时表达技术的高通量功能基因筛选,利用Gateway技术实现植物表达载体和表达文库的构建,将35S启动子和Gateway技术入门载体pDONR222的同源重组区连接到植物表达载体pCAMBIA0380上,构建Gateway技术兼容的植物表达载体.[方法]分别扩增35S启动子与pDONR222上attP特异识别序列之间的功能区,并将其依次连人根癌农杆菌(Agrobacterium tume faciens)介导的植物表达载体pCAM-BIA0380的多克隆位点区,利用带有attB特异识别区域的GUS基因,对构建的载体功能进行测试.[结果]成功构建了基于Gateway技术的植物表达载体p1104D;载体重组基因的选择性测试结果表明,p1104D对目的基因片段的大小无严格选择性;载体重组效率测试结果表明,p1104D重组平均滴度为5.11×105cfu/mL;GUS报告基因瞬间表达试验结果表明,改造后的载体可以实现目标基因的顺利表达.[结论]基于Gateway技术的植物表达载体p1104D的构建,为实现cDNA文库的高效构建和目标基因的高通量功能筛选提供了可能,有望推动植物-病原互作研究中关键基因的鉴定与克隆.【期刊名称】《西北农林科技大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2010(038)011【总页数】7页(P161-166,172)【关键词】Gateway技术;植物表达载体;瞬时表达;功能克隆【作者】郭姗姗;张蒙;单卫星【作者单位】西北农林科技大学生命科学学院,陕西,杨凌,712100;西北农林科技大学植物保护学院,陕西,杨凌,712100;西北农林科技大学植物保护学院,陕西,杨凌,712100;西北农林科技大学植物保护学院,陕西,杨凌,712100;陕西省农业分子生物学重点实验室,陕西,杨凌,712100【正文语种】中文【中图分类】Q785由Invitrogen公司开发的Gateway技术是一种通用型克隆方法，其基于λ噬菌体位点特异性重组系统，利用位点特异重组构建入门载体［1－3］，整个过程没有限制性内切酶和连接酶的参与。
在文库构建方面，Gateway技术避免了传统cDNA文库构建中cDNA内切酶位点易被切断、非cDNA片段易插入而导致的cDNA完整性低［4］、无效克隆数量多等问题。
这种重组克隆建库的方法，具有阳性克隆率高［5］、快速、灵活等优点。
但是在获得入门载体后，需要经过进一步重组才能够将目的基因转化到其他表达系统中［1，6－9］，这将花费更多的时间和试验成本，不利于功能基因组学研究中目标基因的高通量功能克隆的应用。
由于Gateway技术具有良好的可扩展性，基于Gateway技术的载体改造已经成功应用于许多领域，如Zhu等［10］曾改造Gateway技术中的载体，以用作真菌中的高通量表达；Busso等［11］曾构建了基于Gateway技术的目标载体，以在大肠杆菌中用作高通量克隆和表达筛选。
但利用基于Gateway技术改造的载体，在植物中进行高通量功能筛选的研究，尚未见报道。
本研究以植物表达载体pCAMBIA0380和Gateway入门载体pDONR222为基础，构建了具有35S启动子及Gateway载体重组功能区域的植物表达载体，以期为利用Gateway技术构建植物表达载体和表达文库奠定基础。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 质粒、菌株和标记基因 pDONR222载体购自Invitrogen公司；pCAMBIA1305.1、pBi121载体和pCAMBIA0380载体为西北农林科技大学生物技术中心第二工作室所有；大肠杆菌菌系DH10B、DB3.1和农杆菌菌系GV3101均为西北农林科技大学生物技术中心第二工作室保存菌；标记基因为GUS基因。
1.1.2 主要试剂 rTaq酶、PrimeSTARTMHS酶与T4DNA连接酶，购自TaKaRa公司；pGEM－T Easy载体试剂盒，购自Promega公司；Pfu酶、限制性内切酶与dNTP，购自Fermentas公司；胶回收试剂盒，购自Axygen公司；质粒小提试剂盒，购自OMEGA公司；DNA纯化试剂盒，购自威格拉斯公司。
引物的合成和序列测定工作，均由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。
1.2 带35S启动子的pCAMBIA0380载体的构建1.2.1 35S启动子区的引物设计与PCR扩增根据pBi121载体中35S区的序列设计1对引物（35SF／35SR），引物序列为：35SF：5′－GAT TAC GAA TTC GTC CCC AGA TTA GCC TTT TCA ATT TC－3′；35SR：5′－CCA TGG ATC CTA GAG CTC TGA AGC GTG TTC TCT CCA AAT GAA ATG－3′。
在上游引物35SF中加入EcoRⅠ酶切位点（见下划线），下游引物35SR中分别加入BamHⅠ和SacⅠ酶切位点（见下划线），并在酶切位点的5′端加上保护碱基。
以pBi121载体为模板、35SF和35SR为引物，扩增35S的基因序列，反应体系为：10×Pfu Buffer（含 MgSO4）2μL，10mmol／L dNTP 0.5μL，上、下游引物（10μmol／L）各1μL，pBi121 1μL，Pfu酶0.5U，无菌ddH2O补齐20μL。
反应条件为：94℃预变性2min；94℃30s，60℃30s，72℃2min，30个循环；72℃延伸5min。
PCR扩增产物用10g／L琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收试剂盒回收目的片段后，用普通的Taq酶进行末端加A：10×rTaq Buffer 5μL，25mmol／L MgCl24μL，rTaq酶1.25U，10mmol／L dNTP 1μL，加入灭菌的ddH2O至50 μL。
72℃处理30min后，加尾产物用DNA纯化试剂盒纯化，克隆到pGEM－T Easy载体，挑取阳性克隆测序验证。
1.2.2 35S启动子与pCAMBIA0380载体的连接将连有正确35S启动子的T载体克隆与pCAMBIA0380载体分别用EcoRⅠ与BamHⅠ双酶切，10 g／L琼脂糖凝胶电泳后，用胶回收试剂盒分别回收约830bp和7kb的片段。
将35S片段与线性载体按照3∶1（物质的量比）比例混合后，用T4DNA连接酶连接；连接产物纯化后，转化感受态大肠杆菌DH10B，经Kan筛选后，挑取阳性克隆；经PCR与EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定，得到带有35S启动子的pCAMBIA0380载体，将其命名为p1104S。
1.3 带有pDONR222上attP重组序列及其覆盖区的p1104S载体的构建1.3.1 pDONR222 attP接头引物的设计与PCR扩增根据pDONR222载体序列和Gateway试剂盒中attP1接头的核心序列，以核心序列为准，向5′端上游寻找ATG，以第一个ATG为起始设计上游引物pdonr F；在attP2接头的3′端下游设计下游引物pdonr R。
引物序列如下：pdonr F：5′－TGC CAA CTT TGT ACA AAA AAG CTG－3′；pdonr R：5′－CCA GGA AAC AGC TAT GAC CAT G－3′。
以pDONR222载体为模板，以pdonr F和pdonr R为引物，扩增attP重组序列及其覆盖区的基因序列，反应体系为：5×PrimeSTARTMBuffer（含 Mg＋）10μL，10mmol／L dNTP 1μL，上、下游引物（10 μmol／L）各1μL，pDONR222 1μL，PrimeSTARTM HS酶1.25U，无菌ddH2O补齐50μL。
反应条件为：98℃10s，68℃3min，30个循环。
用10g／L琼脂糖凝胶电泳检测并用凝胶回收试剂盒回收。
1.3.2 重组质粒的构建采用H indⅢ内切酶对p1104S载体进行酶切，用10g／L琼脂糖电泳检测并凝胶回收约7.5kb的目标条带。
使用Pfu酶将载体的黏性末端补齐为平末端，在回收产物中依次加入10×PfuBuffer（含 MgSO4）5μL、10mmol／L dNTP 1μL、Pfu酶1.25U，用无菌的ddH2O补齐至50μL，在PCR 仪上72℃延伸30min。
使用DNA纯化试剂盒对补平后的产物进行纯化。
将线性平末端的p1104S回收的attP重组序列和中间功能区的基因片段按照1∶4（物质的量比）的比例混合，使用T4DNA连接酶16℃连接过夜。
连接产物转化感受态大肠杆菌DB3.1，在含有Kan与Cm抗性的培养基上筛选。
对阳性克隆测序验证，测序上游引物序列为：5′－ACG TCT TCA AAG CAA GTG GAT TG－3′，下游引物序列为：5′－ATC GGG GAA ATT CGA GCT GG－3′，将构建完成的载体命名为p1104D。
1.4 重组载体的功能检验1.4.1 带attB序列的GUS基因的扩增根据attB序列以及pCAMBIA1305.1中GUS基因的序列设计引物，将接头序列加到GUS基因的两端，引物序列如下：GUS F：5′－TCG TCG GGG GAC AAC TTT GTA CAA AAA AGT TGG ATG GTA GAT CTG AGG GTA AAT TTC－3′；GUS R：5′－GGC GGC CGC ACA ACT TTG TAC AAG AAA GTT GGG TAA TTC ACA CGT GAT GGT GAT G－3′。
以pCAMBIA1305.1载体为模板、GUS F和GUS R为引物，扩增带attB序列的GUS基因序列，反应体系为：5×PrimeSTARTM Buffe r（含 Mg＋）10 μL，10mmol／L dNTP 1μL，上、下游引物（10 μmol／L）各1μL，pCAMBIA1305.1 1μL，PrimeSTARTM HS酶1.25U，无菌ddH2O 补齐50μL。
PCR反应条件为：98℃10s，68℃3min，30个循环。
用10g／L琼脂糖凝胶电泳检测后，以凝胶回收试剂盒回收约2.1kb的目的片段。
1.4.2 BP重组反应将pDONR222原质粒、改造后质粒p1104D分别与带有attB 接头的GUS基因进行BP反应，按照Gateway指南设定重组反应体系为：带attB序列的GUS基因75～100ng，p1104D或pDONR222质粒250ng，5×BPClonaseTMReaction Buffer 2μL，TE buffer补齐体系至7μL。