紫外分光光度法和荧光分析法

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差示分光光度法
▪ 普通分光光度法一般只适于测定微量组分， 当待测组分含量较高时，将产生较大的误差。 需采用示差法。
▪ 即提高入射光强度，并采用浓度稍低于待 测溶液浓度的标准溶液作参比溶液。
▪ 设：待测溶液浓度为cx，标准溶液浓度为 cs(cs < cx)。则：
▪ Ax= εb cx As = εb cs
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仪器主要部件
光源
单色器 吸收池 检测器
信号显 示系统
光 源: 常采用氘灯和钨卤灯 钨灯最适宜的使用波长范围为320～1000nm。 氘灯能发出光的波长范围一般为190～400nm
单色器：棱镜或光栅 吸收池：玻璃或石英吸收池 检测器：光电池、光电管、光电倍增管及二极管阵列检测器
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仪器分类
▪ 单光束紫外可见分光光度计 ▪ 准双光束紫外可见分光光度计 ▪ 双光束紫外可见分光光度计 ▪ 双波长紫外可见分光光度计
光谱分析法
一、紫外—可见光分光光度法 二、荧光分析法
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基本原理 仪器主要部件
主要应用
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基本原理
概述：紫外-可见分光光度法是通过被测物 质在紫外-可见光区的特定波长或一定波长 范围内光的吸收度，对该物质进行定性和 定量分析的方法。主要用于药品的鉴别、 检查和含量测定。
范围： 紫外光区（200~400nm）
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原理 与紫外-可见法异同点
应用
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原理
荧光—分子吸收电磁波后，从其最低激发 态重新发射紫外线或可见光的现象
利用某些物质被一定波长的光照射后所产 生的，能够反映该物质特性的荧光来进行 定性定量的分析方法——荧光分析法。
在溶液中，当荧光物质
的浓度较低时,其荧光强 度与该物质的浓度通常
有良好的正比关系,即
例 苯磺舒：用含盐酸的乙醇[取盐酸溶液（9-1000）2ml，加乙醇制成 100ml]制成没1ml中含20ug的溶液，在225nm与249nm的波长处有 最大吸收，在249nm波长处的吸收度为0.67 。 甾体激素类药物：丙酸倍氯米松的乙醇溶液（20ug/ml），在 239nm的波长处应有最大吸收，吸光度为0.57~0.60;在239nm与 263nm波长处的吸光度比值应为2.25~2.45
▪ ΔＡ＝Ａx －Ａs =εb(cx － cs ）=εbΔc
▪ 测得的吸光度相当于普通法中待测溶液与
标准溶液的吸光度之差ΔＡ。示差法测得的
吸光度与Δc呈直线关系。由标准曲线上查得 相应的Δc值，则待测溶液浓度cx ：
▪ cx = cs + Δc
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双波长分光光度法
▪ 不需空白溶液作参比；但需要两个单色器获得两 束单色光(λ1和λ2)；以参比波长λ1处的吸光度Aλ1 作为参比，来消除干扰。在分析浑浊或背景吸收 较大的复杂试样时显示出很大的优越性。灵敏度、 选择性、测量精密度等方面都比单波长法有所提 高。
▪ Ｉ＝Ｉ0 e-εbc
▪ 假定入射光强度Ｉ0 在整个波长范围内保持恒定：
▪ dI 0 /dλ＝0
▪ 则：dI/dλ＝－Ｉ0 bc e -εbc dε/dλ
▪
＝－Ｉ0 bc dε/dλ
▪ （例子：课本233页）
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其他
▪ 卡尔曼滤波法 ▪ 偏最小二乘法 ▪ 小波变换 ▪ 三波长分光光度法 ▪ 系数倍率法 ▪ ……
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4.结构分析
▪ 1.判别物质的异构体，如互变异构体， 顺反异构体，开链和成环异构体，旋 光异构体，空间异构体等。反式异构 体空间位阻小，共轭程度较完全。最 大吸收峰波长，最大摩尔吸收系数， 大于顺式。
▪ 2.推测物质的共轭体系和部分骨架
▪ 一般需与色谱，红外，质谱，波谱等 多种仪器联合作物质的结构分析。
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2、药物的含量测定
如巴比妥类药物的含量测定（巴比妥类药物 在碱性介质中电离为具有紫外吸收特征的结构）、 芳酸及其脂类药物含量测定、维生素A含量测定 （在325~328nm的波长范围内有最大吸收）等。
三点校正法
本方法是在三个波长处测得吸光度，根据校正公式计算吸光度 校正值后，再计算含量。其原理主要基于以下两点：
①杂质的无关吸收再310~340nm的波长范围内几乎呈一条直线， 且随波长的增大吸光度下降。
②物质对光吸收呈加和性的原理，即在某一样品的吸收曲线上， 各波长的吸光度是维生素A与杂质吸光度的代数和，因而吸收曲线 也是二者吸收的叠加。
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3、药物的鉴别
对比吸收光谱特征数据 对比吸收度（或吸收系数）的比值 对比吸收光谱的一致性
▪ ΔＡ＝A λ2 －A λ1 ＝（ελ2 －ελ1 ) b c ▪ 两波长处测得的吸光度差值ΔＡ与待测组分浓度
成正比
▪ （例子：课本366页）
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导数分光光度法
▪ 导数分光光度法在多组分同时测定、浑浊样品分析、 消除背景干扰、加强光谱的精细结构以及复杂光谱 的辨析等方面，显示了很大的优越性。
▪ 利用吸光度(或透光度)对波长的导数曲线来进行分 析：
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主要应用
1、药物的杂质检查
利用药物与杂质对光的选择性吸收性质的差异，若药物在杂质的 最大吸收波长处没有吸收，则可在此波长处测样品溶液的吸收度，通 过控制样品溶液吸收度来控制杂质的量。
例：地蒽酚中二羟基蒽醌的检查 二羟基蒽醌的三氯甲烷溶液 在432nm处有最大吸收，而 地蒽酚在该处几乎无吸收。
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IF=KC
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光照
分子基态
激发态
辐射跃迁 荧光
可见光区（400~760nm）
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Beer-Lambort
*A为吸收度；
定律A=log
1 T
=Ecl
*T为透光率；
*E为吸收系数（以
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1% 1cm
） 表示，溶液浓度为1%（g/ml），厚度为1cm时的吸光度值
*c为溶液浓度；
*l为样品总厚度。
适用条件：入射光为单色光 溶液是稀溶液 固体、 液体和气体样品在同一波长 下，各组分吸光度具有加和性
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紫外分光光度测定方法
▪ 普通测定分光光度法
▪ 1.单组分的测定 ▪ 通常采用 A-C 标准曲线法定量测定。 ▪ 2.多组分的同时测定 ▪ ⑴若各组分的吸收曲线互不重叠，则可在各自
最大吸收波长处分别进行测定。这本质上与单组 分测定没有区别。 ▪ ⑵若各组分的吸收曲线互有重叠，则可根据吸 光度的加合性求解联立方程组得出各组分的含量。 ▪ Aλ1= εaλ1bca ＋ εbλ1bcb ▪ Aλ2= εaλ2bca ＋ εbλ2bcb