基因克隆实验报告

实验单元6：基因克隆

学号No.：姓名Name：日期Date：2014，04，26

摘要：

基因克隆是在体外将目的基因（或其它有意义的DNA片段）同能够自我复制的载体DNA连接，然后将其转入宿主细胞或受体生物进行表达或进一步研究。通过PCR法扩增目的基因片断的过程中，由于往往不清楚目的基因的DNA序列，获得的目的片断通常需要通过TA克隆的方法，重组到T-载体中，通过序列测定清楚DNA序列。本实验应用RT-PCR技术从团头鲂肝脏RNA中扩增β-actin基因cDNA片段，并克隆到质粒载体pMD18-T，鉴定测序。结果显示：只有少数组别成功克隆出目的基因片段。

关键词：基因克隆；T-A克隆；团头鲂；β-actin基因

一、前言

对PCR产物进行克隆是分子生物领域以及基因工程领域中常用的方法，随着PCR方法应用的多元化，PCR产物的克隆显得尤为重要。以前对PCR产物进行克隆实验，采用的方案大概有以下几种：一是用Klenow酶或单链核酸酶（如S1核酸酶或绿豆核酸酶）将PCR产物的两端切成平末端，然后克隆到也切成平端的质粒载体上，或在PCR产物的两端加上人工接头（Linker），经过限制性内切酶处理以后，再克隆到用相应限制性内切酶酶切产生的载体上；二是在设计PCR产物时，在引物的)!端引入特异性的内切酶识别序列，在PCR反应结束后，将PCR产物用相应的限制性内切酶进行处理，使之两端产生粘性末端，以便于克隆到载体的相应酶切位点上[1]。这两种方法都很烦琐，而且，第一种方法的克隆效率很低，第二种方法在进行酶切处理时，如果PCR产物本身含有相应的酶切位点时，则有可能切断PCR产物。

近年来发展了几种PCR产物的直接克隆方法，一种是T4 DNA 聚合酶补平，另一种是T-A克隆法。其中，T-A克隆法不仅操作简便，而且大大提高了克隆效率，已经成为克隆PCR产物的主要方法之一。但是，在采用T-A克隆法时，随

着插入片段长度的增加，克隆效率明显下降，尤其是当PCR产物长度大于3000bp 时，其克隆效率甚至会低于平末端的克隆效率。有的学者针对不同长度的PCR 产物尝试了不同的T-A克隆法，并且对其克隆效率进行了比较，对不同长度的PCR 产物提出了相对优化的克隆法。结果表明，对于较短的PCR产物500bp左右），采用常规的T-A克隆法即可得到较高的克隆效率；对于中等长度的PCR产物(3000bp左右)，用温度循环T-A克隆法可获得较高的克隆效率；对于较长的PCR 产物（6000bp左右），用二次重组T-A克隆法可以提高克隆效率[2]。

二、材料与方法

2.1 材料

实验材料：

新鲜的团头鲂肝脏、Trizol、氯仿、异丙醇、75%酒精（用DEPC水和无水乙醇配制）、DEPC水、琼脂糖、Loading Buffer、无RNA酶的枪头（1mL、200μL、10μL）、无RNA酶的1.5mL离心管、（1mL、200μL、10μL）移液枪、反转录酶、RNA酶抑制剂、oligo引物、反转录buffer、10mmol/LdNTP、无RNA 酶的10μLPCR管、无菌水、buffer、正向和反向引物、模板、rTaq、dNTP、无菌10μLPCR管、DNA纯化试剂盒、pMD18-T、感受态细胞、LB液体培养基（含氨苄和不含氨苄）、无菌枪头（1mL、200μL、10μL）、无菌0.5mL离心管

2.2 方法

实验流程

新鲜肝脏组织

mRNA

cDNA

放大

2.2.1 RNA提取

（1）先向玻璃匀浆器中加1mL Trizol并放在冰上预冷，取约30-100 mg新鲜组织至匀浆器中，迅速匀浆至无可见组织块。将匀浆液转移至2 ml离心管中，室温静置5 min。

（2）向离心管中加入200～300 μL氯仿（约为RNAiso的1/5体积量），振荡混匀至液体不粘稠。室温静置5-15 min。

（3）12，000 g，4℃离心15 min。

（4）吸取上清液至1.5ml离心管中，加入0.5ml异丙醇，颠倒数下混匀，室温静置5-10分钟。

（5）12，000 g，4℃离心8 min，弃上清。

（6）加入1ml 75%乙醇，轻微振荡数下，12，000 g，4℃离心5min，弃上清。（7）用75%乙醇重复洗涤一次（可选）。

（8）室温干燥3-5min（不能完全干燥）。加入20~50ul DEPC水溶解，电泳检测。

2.2.2 反转录PCR

1）总RNA5 μL + DEPC水补充到11 μL

2）20 μmol/L Poly（T）引物 1 μL

3）稍离心后使溶液到管底后，在PCR仪上68℃孵育10 min，立即将PCR管插入冰中，放置2－5 min

4)继续加入以下组分：

M-MLV 5× Reaction Buffer 4 μL

10mmol/L dNTP 2 μL

RNasin Ribonuclease Inhibitor 1 μL （40u）

M-MLV Reverse Transcriptase 1 μL （200u）

用手指轻弹PCR管底部混匀，短暂离心后42℃PCR仪中反应1 h。反应结束后，可用于下一步实验，抑或保存于-20℃冰箱中备用。

2.2.3PCR

反应体系（50ul体系）：

10×buffer 5ul （若5×buffer则2ul）

25mM MgCl25ul

Template 5ul

Primer F 2ul

Primer R 2ul

2.5 mMdNTP 4ul

rTaq 2ul

ddH2O 补足至50ul

程序设置：94℃ 3 min

94℃30 s

55℃30 s 30个循环

72℃30 s

72℃10 min

…

反应结束后，取2 μL在浓度为1％的琼脂糖凝胶上电泳检测。

2.2.4T-A克隆

1)DNA回收

电泳—切胶—胶回收试剂盒

电压电泳液

2)连接

pMD18-T vetor 0.5μL

Solution I 2.5μL

回收的DNA 2-7μL（依浓度而定）

灭菌水补充至10 μL

4℃or 16℃连接0.5-2h。

3). 转化、涂平板

①在超净工作台内将连接产物加入含有100μl感受态细胞的离心管中。反复用枪头轻吸2-3次以混匀。然后置于冰中30min。

②从冰中取出离心管，置于42℃循环水浴中90s（热激），然后迅速置于冰中2min。

③在超净工作台上，每个离心管加入600μl LB液体培养基（不含氨苄），放到摇床上，37℃培养60min，转速不超过100rpm。此过程主要是让细菌复苏并表达质粒编码的抗生素抗性基因。

④常温4000 rpm离心1min，吸去部分上清（大约剩100μl），留下细胞沉淀，吹匀后用玻璃棒涂布于含氨苄的平板上（50μl/个）。注：玻璃棒蘸取酒精后，在酒精灯上烤一下，要稍微放置冷却，以免太热导致细胞死亡。涂布时一定要均匀