双光子显微镜的独特优势
基于双光子显微成像技术的活细胞研究
基于双光子显微成像技术的活细胞研究
活细胞是细胞学研究中的一个重要研究对象。
传统的细胞学研究方法通常需要对细胞进行染色或杀死细胞，以获取细胞的形态和结构信息。
然而，这种方法无法研究活体的生物过程，给细胞学研究带来了局限性。
随着现代生物学技术的发展，基于双光子显微成像技术的活细胞研究成为了细胞学研究的重要手段。
双光子显微成像技术是一种非侵入式、无损伤、高分辨率的成像方法。
它利用一种称为二光子激发的光学过程，在活体组织中直接成像活细胞的生物活动。
在这种技术中，激光束的能量与样品中的荧光标记物相互作用，从而引发二光子吸收过程。
这个过程产生的荧光信号可以被探测器捕捉并进行成像。
与传统的荧光显微镜相比，双光子显微成像技术的成像深度更大，光伤害也更小。
利用基于双光子显微成像技术的活细胞研究，可以获取活体细胞的三维成像，观察细胞内部分子的分布和定位，探究细胞分子间的相互作用和信号传递机制。
同时，这种技术还可以用于研究细胞的动力学过程，如细胞迁移、分裂等生物过程。
与传统的成像技术相比，双光子显微镜在深度成像和时间分辨率上都有很大的优势。
双光子显微成像技术的应用范围非常广泛。
例如，在神经科学中，这种技术可以用于研究神经元的突触形态和功能。
在免疫学研究中，它可以用于观察免疫细胞在淋巴结内的迁移和互动。
另外，双光子显微成像技术在药物筛选和开发中也有广泛应用。
总体而言，双光子显微成像技术的发展给细胞学研究带来了革命性变革。
它不仅可以提供更加精细的细胞成像，而且还可以研究活体细胞的生物过程，为生命科学的发展提供了强大的技术支持。
双光子吸收技术
双光子吸收技术双光子吸收技术（Two-photon absorption, TPA）是一种基于非线性光学效应的先进技术，具有广泛应用前景。
本文将介绍双光子吸收技术的原理和应用领域，并探讨其在科学研究和工程应用中的发展前景。
一、双光子吸收技术的原理双光子吸收技术是指当两个光子几乎同时与目标物质相互作用时，它们的能量叠加在一起，达到目标物质电子激发的能量阈值，从而引发非线性光学过程。
相比于单光子吸收技术，双光子吸收技术具有以下几点优势：1. 较高的空间分辨率：由于双光子吸收过程具有非常小的横向光强分布，使得在高分辨显微镜成像中能够获得更清晰、更精确的图像。
2. 较低的光损伤风险：双光子吸收技术采用红外光源，较短的波长可以减少光敏感材料的光损伤风险，提高材料的使用寿命。
3. 较大的穿透深度：红外光在生物组织中的穿透深度较大，可以实现对生物样本内部结构的观察和研究。
二、双光子吸收技术的应用领域双光子吸收技术在众多领域中具有重要的应用价值。
以下是其中几个典型的应用领域：1. 生物医学研究：双光子显微镜可以实现对生命体内动态过程的实时观察，例如细胞内亚细胞器的运动、荧光标记的蛋白质等。
这为生物医学研究提供了有力的工具。
2. 材料科学：双光子聚合技术可以实现微纳结构的精确制备，从而在材料科学领域发挥重要作用。
例如，通过控制双光子吸收过程可以实现高性能的光子晶体、光学波导和传感器等。
3. 光子学器件：双光子吸收技术可以用于制备各种光子学器件，包括非线性光学晶体、光学调制器和光电探测器等。
这些器件在光通信、光存储和光计算等领域有着广泛的应用。
三、双光子吸收技术的未来发展双光子吸收技术在科学研究和工程应用中具有巨大的潜力。
随着技术的不断发展，我们可以期待以下几个方面的进一步突破：1. 新型光源的研发：目前，红外激光仍然是双光子吸收技术的主要光源，但其成本较高，体积较大。
研究人员正在积极寻求更便携、更高效的光源，以推动技术的广泛应用。
新型光学成像技术——双光子荧光显微镜
新型光学成像技术——双光子荧光显微镜光学成像技术一直以来都是生物学研究的重要手段。
传统的荧光显微镜通过荧光标记物的发光来研究生物分子和细胞的功能，但由于深度限制和荧光标记对细胞和生物体的影响，限制了研究深度和准确程度。
然而双光子荧光显微镜的出现改变了这个现状，具备高分辨率、深度成像和非侵入性标记等特点。
一、双光子荧光显微镜的原理双光子荧光显微镜的成像原理是利用非线性荧光效应——双光子激发荧光效应，当两个光子的能量合成能够与荧光分子的跃迁能量匹配时，荧光分子受到激发，发生荧光发射。
与传统的单光子激发荧光不同，双光子激发荧光只在聚焦点产生明显的荧光信号。
这是因为在双光子激发荧光中，荧光产生需要两个光子的同步作用。
这种非线性过程不利于在样品各个层次产生荧光信号。
因此，在使用双光子荧光显微镜进行样品成像时，只在聚焦点周围的小范围内进行信号的检测，从而能够获得更高的分辨率和更深的成像深度。
二、双光子荧光显微镜的特点1. 非侵入性成像传统的荧光显微镜需要生物体或细胞中荧光标记物的标记才能进行成像。
而双光子荧光显微镜不需要使用任何外部标记物，可以直接在生物体中进行成像。
这种非侵入式成像能力使得双光子荧光显微镜在活体成像和组织工程等应用方面有着广阔的应用前景。
2. 高分辨率成像由于双光子荧光显微镜的成像原理，只在聚焦点周围的小范围内进行信号的检测，能够获得更高的分辨率。
深度成像时，同样具备更高的分辨率，在成像深度达到300μm时，其分辨率保持在数百奈米量级。
3. 深度成像双光子荧光显微镜能够获得更深的成像深度。
传统的荧光显微镜在成像深度达到几十微米之后，即使在同样的条件下，荧光信号的强度会急剧减弱，因此限制了深度成像的应用范围。
而双光子荧光显微镜能够在成像深度达到1mm时，仍然能够获得较高的荧光信号强度和分辨率。
三、双光子荧光显微镜的应用1. 细胞成像双光子荧光显微镜能够对单个细胞进行成像，展示细胞内分子的构成和运动过程，以及细胞能量代谢和信号传递的机制等。
多光子显微镜成像技术
多光子显微镜成像技术随着现代科学技术的不断发展，各种科技手段的新兴不断让人们惊叹。
而其中的多光子显微镜成像技术更是一个颇受当今科学家们青睐的方法。
该技术利用了高能激光束的特性，可以在明显的少光、荧光和较好的光深成像分辨率下进行神经元成像，细胞学成像等等。
本文将重点论述该技术及其在科学领域中的应用。
多光子显微镜成像技术的原理多光子显微镜成像技术的原理是利用红外光的能量，将其他比较长波长的荧光颜色刺激出来。
在相同能量的激光束下，与其他方法相比，该技术的像素亮度及空间分辨率要更高。
此外，多光子显微镜不容易损伤样品，能够渗透深度更大的组织。
多光子显微镜成像技术的优点多光子显微镜成像技术有许多优点，比如它是一种全息成像技术，因此可以在一个大试样区域内得到分辨率更高的测量结果。
其次，只需要在样品上使用极低的功率水平，因此该技术可以被用作非侵入性成像方法。
最后，多光子显微镜成像技术可以用于生命科学，物理学和化学领域中的各种生物成像。
多光子显微镜在生物学研究中的应用多光子显微镜非常适合于研究生命科学中的神经元成像以及细胞动态过程中的荧光蛋白 (GFP) 活体成像。
由于其不会对样品产生任何损伤，因此可以将其运用于观察活体标本中的细胞和组织系统。
顺便提一句，该技术在研究神经元成像中尤其受欢迎，因为它可以在各种不同的深度跟踪不同区域中的神经元。
这种非侵入性、活体成像的技术，为神经科学领域提供了可靠的有效性的工具。
多光子显微镜在物理学研究中的应用多光子显微镜同样可以用于研究物理学中的许多程序，例如生物分子的振动和红外激光颗粒的分布。
多光子显微镜技术在研究物理学中的类似振动现象时特别有用，因为可以直接测量样品内部的振动。
样品中的部分振动被转换为荧光，其激发为产生唯一荧光产物所使用的多光子跃迁的结果。
这种方法可以被用于制备出的样品，例如包含Kimron集团SERS芯片的识别染料结晶。
总之，多光子显微镜成像技术正变得越来越流行，并且一直在不断发展。
双光子成像在中医药领域的应用
双光子成像在中医药领域的应用作者：林思思阿列克谢·沃瑞克哈特斯基唐勇来源：《世界中医药》2020年第11期摘要双光子显微镜作为现代最重要的光学显微镜技术，具有3D成像、在体成像、光漂白和光毒性低等特点。
该技术已被运用到与中医药相关的细胞成像、组织成像和在体成像研究中，为中医药治疗相关疾病提供更科学和直观的理论依据。
本文对现有的双光子显微镜技术在中医药领域的应用研究进行概述，以期为中医药研究提供新方向。
关键词双光子显微镜;中医药;细胞成像;组织成像;在体成像Application of Two-photon Microscopy in the Field of Traditional Chinese MedicineLIN Sisi1，Alexei Verkhratsky1，2，TANG Yong1，3（1 College of Acupuncture and Tuina，Chengdu University of TCM，Chengdu 610075，China; 2 The University of Manchester，Manchester M139PL，United Kingdom; 3 Key Laboratory of Sichuan Province for Acupuncture and Chronobiology，Chengdu 610075，China）Abstract Two-photon microscope，as the most important optical microscope technology，showed remarkable advantages of 3D imaging，in vivo imaging，photobleaching and low phototoxicity.It has been utilized in cell imaging，tissue imaging and in vivo imaging related to traditional Chinese medicine （TCM） to provide a more scientific and intuitive theoretical basis for the treatment of related diseases by TCM.This paper summarizes the application research of the existing two-photon microscope technology in the field of TCM，in the hope of providing new directions for the research of TCM.Keywords Two-photon microscope; Traditional Chinese medicine; Cell imaging; Tissue imaging; In-vivo imaging中图分类号：R2-03文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.11.002双光子显微镜是现代重要的光学显微镜，具有3D成像、活体动物成像、检测灵敏度高、空间定位性高、光漂白和光损伤低等特点，在生物学、神经科学等领域中广泛运用。
双光子技术的原理及应用
双光子技术的原理及应用前言双光子技术是一种基于量子力学原理的新型光学技术，它利用低能量、超快速的激光脉冲产生的双光子效应，实现了很多传统光学方法所无法实现的功能。
本文将介绍双光子技术的原理以及其在各个领域的应用。
原理双光子技术的原理基于量子力学的超快速过程，主要包括以下几个方面：1.双光子吸收：双光子吸收是指两个光子几乎同时被一个激发态的原子或分子吸收。
在传统的光学中，光子与物质的相互作用是单光子吸收，而双光子吸收则是两个光子几乎同时被物质吸收。
这种过程需要满足一定的能量和动量守恒关系。
2.被激辐射的双光子发射：双光子激发还可以引起双光子的辐射，这在传统的光学中是不可能实现的。
双光子辐射是指一个激发态的原子或分子在光子碰撞下同时发射两个光子。
3.非线性光学效应：双光子技术利用了非线性光学效应，而传统光学则是基于线性光学理论。
非线性光学效应是指光与物质相互作用时，光的输出与输入之间不是简单的比例关系。
通过调整光的强度、频率和相位等参数，可以实现一系列非线性效应，如频率倍增、非线性折射和光学相位共轭等。
应用双光子技术在各个领域都有广泛的应用，下面将分别介绍几个典型的应用场景。
生物医学1.双光子显微镜：双光子显微镜是一种高分辨率、无损伤的生物成像技术。
它利用双光子吸收效应，通过调控激光脉冲的强度和频率，可以实现对生物样品的深层次显微观察，对活体细胞、组织甚至整个小动物的三维结构和功能进行研究。
2.光合成研究：双光子技术可以应用于光合成研究中。
通过双光子激发，可以提供足够的能量给叶绿素分子，激发出叶绿素的激发态，从而研究光合作用的机制和动力学过程。
材料科学1.量子点材料：双光子技术可以用于研究和制备量子点材料。
通过调控激光脉冲的参数，可以实现对量子点的精确定位和操控，进而研究其光电性能和应用。
2.光学器件加工：双光子技术可以实现高分辨率的光学器件加工。
利用双光子吸收效应，可以在材料表面产生微细结构，如光子晶体、微透镜和微型通道等，用于光子学、光电子学和光学通信等领域。
双光子显微成像技术的最新进展
双光子显微成像技术的最新进展双光子显微成像技术是一种新兴的生物显微技术，它可以在活体组织内实现高分辨率、三维成像，因此在生物医学研究中引起了广泛关注。
近年来，双光子显微成像技术得到了快速发展，出现了许多新的应用和改进，本文将对双光子显微成像技术的最新进展进行介绍。
一、什么是双光子显微成像技术？双光子显微成像技术是利用长波长的激光经过非线性作用，产生双光子激发荧光来实现显微成像的技术。
它与传统的荧光显微镜相比有很大的优势，可以在活体组织深处实现高分辨率、三维成像，对于生物医学研究有很大的价值和应用前景。
二、双光子显微成像技术的最新进展1. 激光技术的改进激光是双光子显微成像技术的核心部分，它需要具备高功率、短脉冲、高稳定性等特点。
近年来，激光技术一直在不断改进和更新，现在已经出现了一些新型的激光器，如飞秒激光器、光纤激光器等，它们具有更高的功率和更短的脉冲宽度，可以提高显微成像的质量和速度。
2. 显微成像系统的改进显微成像系统是双光子显微成像技术的另一个重要组成部分，它需要具备高度的稳定性、精度和灵敏度。
近年来，显微成像系统也得到了一些改进，如新型的探测器、新型的光学透镜、新型的样品扫描器等，这些改进可以提高显微成像的分辨率和灵敏度，有效地解决了一些技术难题。
3. 应用扩展双光子显微成像技术除了在生物医学研究中得到广泛应用外，还可以在其他领域得到应用。
例如，在材料科学中，双光子显微成像技术可以用来研究材料的光学性质、表面形貌和微观结构；在环境科学中，双光子显微成像技术可以用来研究地球表面的生物和生态系统。
随着技术的不断改进和应用范围的不断扩大，双光子显微成像技术的研究将会更加深入和广泛。
三、双光子显微成像技术的前景双光子显微成像技术在生物医学研究中具有广泛的应用前景，尤其在癌症、神经科学、血管形成等领域有着重要的应用。
未来，随着技术的不断发展和改进，双光子显微成像技术的分辨率将会进一步提高，成像速度会更加快速，应用范围也将不断扩大。
双光子激光扫描荧光显微镜及其应用
表 1 几种常见荧光分子的单光子 、双光子 和三光子的吸收截面 3 [5 ]
荧光分子
δ1 (λ/ nm) / 10 - 16cm2
ηδ2 (700nm)
/ 10 - 50cm4·s / 光子
ηδ3 (700nm) / 10 - 83cm6·s2/ 光子2
DAPI free
113 (345nm)
Dansy1
TWO PHOTON LASER SCANNING FL UORESCENCE MICROSCOPY AND ITS APPL ICATIONS
CHEN De2Qiang XIA An2Dong WAN G Ke2Yi HUAN G Wen2Hao
( Depart ment of Precision M achi nery and Inst rument ation , U niversity of Science and Technology of Chi na , Hef ei 230026)
图 1 单 、双光子激发过程示意图
图 2 单 、双光子激发所形成的荧光形貌 (样品为罗丹明 B 的水溶液. 上为单光子激发 ,下为双光子激发)
3 材料的吸收截面 δ
吸收截面 δ是双光子激发现象的重要参数 , 它 的大小反映了分子吸收双光子的本领. 对单光子激 发中的吸收截面 δ已有较为准确的文献记载 , 而对 双光子乃至多光子吸收截面 δ,目前尚缺乏全面 、准 确的记载. 因此 ,对常用的荧光分子多光子吸收截面 δ和光谱的进一步研究 , 将有助于多光子激发共焦 激光扫描荧光显微镜的进一步广泛应用.
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2 双光子激发原理简介
在激光照射下 ,基态荧光分子或原子吸收一个 光子后成为激发态 ,随后又弛豫到某一基态 ,同时以 光子形式释放能量而发出荧光. 这一过程就是通常 的单光子激发情况. 1931 年 ,Maria G ppert - Mayer 预言一个分子或原子可以在同一个量子过程中 ,同 时吸收两个光子而成激发态 ,这种情况就是双光子 激发过程[2 ] . 1961 年 , Kaiser 等在 CaF2 ∶Eu2 + 晶体 中首次观察到了这种双光子激发现象[3 ] . 图 1 简单 地描述了这种双光子激发的过程. 比如在单光子激 发情形 ,NADH 酶在 350nm 的光激发下产生 450nm 的荧光 ,而在双光子激发情形 , NADH 酶则需同时 吸收两个 700nm 的光子才能产生 450nm 的荧光. 这 就是说 ,双光子技术可以使我们无需使用紫外光源
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相关技术指标与进口必要性
双光子显微镜的独特优势有以下几点：
1）双光子显微镜采用长波长激发，长波长的光比短波长的光受散射影响较小，容易穿透标本，双光子显微镜的穿透深度通常是共聚焦显微镜的2到3倍。
对于皮层较深处神经元的活动观察更加全面。
2）焦平面外的荧光分子不被激发，成像的亮度和信噪比高。
更加适合活体
下微弱荧光信号的观察。
3）长波长的近红外光比短波长的光对细胞毒性小，比较适合活细胞长时间的动态观察。
4）使用双光子显微镜观察标本的时候，只有在焦平面上才有光漂白和光毒性。
所以，双光子显微镜比单光子显微镜更适合用来观察厚标本、更适合用来观察活细胞、或用来进行定点光漂白实验。
利用活体双光子显微镜，我们可以对脑科学的几个前沿领域进行更加深入的研究。
利用活体双光子显微镜的光遗传学操作能力，我们可以对某类神经元的激活和失活进行高精度的操作，对这些神经元的特殊功能的进行研究。
在活体水平下，我们可以对皮层在清醒、静息状态下就存在有组织的脑功能活动进行观察，从而加深我们对大脑在内外环境的监测、情节记忆及自我意识方面的理解。
利用活体双光子显微镜的多点光激活能力，我们可以研究多个神经细胞之间的连接和控制，来更好的了解神经信号之间复杂动态的编码过程。
目前国内没有同类产品，其他设备在各个技术层面都无法满足我单位要求，为更好的开展神经学研究，故申请购置此套设备。
主要技术指标：
1显微镜
1.1适用于活体动物操作的正置显微镜，物镜下自由空间高度＞23 cm；
1.2显微镜镜体置于XY电动载物台之上，可通过移动显微镜镜体的方式对样品进行定位和观察；
1.3显微镜镜体移动通过软件控制，XY方向行程＞35 mm，步进＜100 nm；
1.4配备长寿命落射荧光光源；
1.5配备可观察FITC和DsRed的滤色块；
1.6配备全角度物镜转盘，物镜可旋转、可倾斜，能够以任何角度垂直接近样品表面；
1.7配有放大倍率为4倍,NA＞0.2, WD＞20mm的物镜。
1.8配有高数值孔径长工作距离物镜（水镜）。
放大倍率为16倍，NA＞0.8,WD＞3mm；
1.9配有高数值孔径长工作距离物镜（水镜）。
放大倍率为40倍，NA＞0.6,WD＞
2.8mm；
1.10使用Pockels Cell对激光能量进行控制，响应时间＜10 心
2.调焦装置和载物平台：
2.1. 配备电动Z轴调焦装置，行程＞30 mm，步进＜200 nm；
2.2配备压电高速扫描平台，行程＞400叩；
2.3配备大样品电动载物平台，X轴行程＞150 mm，Y轴行程＞75 mm，步进＜200 nm；
3扫描装置
3.1. 提供三种扫描模式：普通振镜点扫描，普通振镜螺旋扫描，共振扫描；
3.2普通振镜螺旋扫描模式下成像速度＞6帧/秒（512大512像素）；
3.3共振扫描模式下成像速度＞30帧/秒（512大512像素）。
4.探测器
4.1配备两个或两个以上高灵敏PMT；
4.2 PMT安放位置接近物镜以提高信号探测效率；
4.3 PMT在550 nm的量子效率＞45%，暗电流＜1 nA；
5光漂白和光解笼锁装置
5.1独立的光漂白和光解笼锁光路，采用独立振镜控制，与成像光路可同时进行操作；
5.2自动光路校正：根据扫描图像自动校正漂白和解笼锁位置；
5.3可进行多点光漂白（或解笼锁）、可任意设定漂白（或解笼锁）的区域、时间、时程（时间控制精度10微
秒）；
5.4配备空间光调制模块，可同时对三维空间内的多个独立区域进行光遗传学操作，可同时进行操作的独立区域
数量＞10；
5.5空间光调制器可与扫描振镜协同工作，以保证进行光遗传学操作区域内的能量密度；
6软件和外围设备控制功能：
6.1软件可以实现多种图像采集模式：点扫描，自定义线扫描，矩形扫描，旋转扫描，任意区域扫描；
6.2三维大视野拼图
6.3软件可输出常用的图像格式；
6.4提供至少8个模拟输入和输出皆空用于外周设备控制；
6.5软件可对模拟输出信号进行编程控制，并对模拟输入信号进行测量和记录；
7图像采集和处理工作站
7.1四核高性能处理器；
7.2内存＞32 G内存
7.3配备512 G高速固态硬盘用于数据采集；
7.4配备双128 G高速固态硬盘用于操作系统和数据采集软件安装，两硬盘互为备份；
7.5配备2T硬盘空间用于数据存储；
7.6 Windows 7操作系统；
8双光子与飞秒光纤激光器：
8.1全自动宽带调谐钛宝石飞秒振荡器；
8.2平均输出功率＞3.5瓦；
8.3调谐波长范围：680-1080 nm；
8.4 脉宽＜140 fs；
8.5调谐速度＞40 nm / s；
8.6飞秒光纤激光器输出功率＞2.0瓦，脉宽＜55 fs，波长1070 nm。