双光子荧光概述.
MPE双光子介绍
红外飞秒脉冲激光器
超短脉冲激光 »将高强度激光在压缩在极短的时间（飞秒）内发射
2004 Katashi Ishihara
红外飞秒脉冲激光器
1.2
重复频率F
峰 值 功 率 Ppeak 平均功率Pave
1
0.8
光强 P
0.6
脉宽τ
0.4
0.2
0
时间 T
2004 Katashi Ishihara
专为多光子优化而设计的光学部件
2004 Katashi Ishihara
2004 Katashi Ishihara
高密度光子发生的区域：物镜的焦点处 多光子激发只发生在物镜的焦点上，因 此激光只在空间的焦点汇聚,非焦点区 域由于光子密度不足以激发荧光，因此 不存在非焦面层的激发,所以不需要共 聚焦针孔，因而提高了荧光检测效率。
980nm 红外激光 脉冲
2004 Katashi Ishihara
1 photon
Excitation state
Excitation Light Excitation light
2 photon
Fluorescence
Fluorescence
Ground state
absorb one photon
Dr. S.Sekine, Dr. T.Shimizu
Tokyo Women's Medical University
30 2014/12/8 No data copy / No data transfer permitted
2004 Katashi Ishihara
2004 Katashi Ishihara
多光子专用物镜——为优化多光子激发而设计
双光子显微成像原理及近期应用案例
双光子显微成像原理及近期应用案例双光子显微成像是一种高分辨率的成像技术，它利用两个光子的共同作用实现对生物样本的成像。
该技术在生命科学、医学和材料科学等领域有着广泛的应用。
本文将介绍双光子显微成像的原理，并探讨其在近期的应用案例。
双光子显微成像的原理是基于非线性光学效应。
在传统的荧光显微镜中，利用单光子的激发来激发和探测样品中的荧光信号。
然而，单光子的能量较高，容易导致样品的光化学损伤和细胞的光毒性作用。
而双光子显微成像则采用两个光子的准同步非共线激发，以降低光毒性并增加分辨率。
双光子显微成像的工作原理是通过使用超短脉冲激光来激发样品中的荧光物质。
这种超短脉冲激光具有高能量浓度和高峰值功率，可以实现光穿透较深的样品，如活体组织。
当两个光子同时到达荧光物质并被吸收后，它们的能量叠加，使得荧光物质处于激发态，进而发出荧光信号。
通过检测和记录这些荧光信号，可以获取样品的高分辨率图像。
在生命科学领域，双光子显微成像因其高分辨率和非侵入性的优势而得到广泛应用。
例如，研究者可以利用双光子显微成像技术观察细胞内的亚细胞器、蛋白质分子和细胞结构的变化。
双光子显微成像还可以用于监测神经元活动和细胞信号传导等重要生理过程。
通过对这些生物学过程的观察和研究，我们可以更好地理解生命的本质和疾病的发生机制。
近年来，双光子显微成像在医学诊断和治疗方面也取得了重要进展。
例如，在皮肤科领域，双光子显微成像可以非侵入性地观察皮肤水分含量、胶原蛋白分布和血管结构等，从而帮助医生诊断和治疗各种皮肤病。
另外，双光子显微成像还可以用于术前虚拟操作和手术引导等方面，提高手术的准确性和成功率。
例如，在眼科手术中，医生可以利用双光子显微成像技术精确地观察眼底血管和细胞变化，从而为患者提供更好的治疗方案。
除了生命科学和医学领域，双光子显微成像还在材料科学、纳米技术和能源研究等领域得到广泛应用。
例如，研究者可以利用双光子显微成像技术观察材料中的晶格结构、电子云变化和界面反应等，为新材料的设计和合成提供重要的参考。
双光子荧光探针研究及其应用
双光子吸收是指在强光激发下 ,介质分子同时 吸收两个光子 ,从基态跃迁到两倍光子能量的激发 态的过程 。早在 1931 年 , G ppert2Mayer[1] 就在理论 上预言了双光子吸收的存在 。但是 ,直到上世纪 60 年代初激光器出现后 ,才由 Kaiser 等[2] 首先从实验 上证实了双光子吸收过程 。然而 ,由于一般材料的 双光子吸收截面很小 ,双光子吸收的实际应用受到 限制 ,使双光子吸收研究一直停留在基础研究水平 。 1990 年 ,美国康奈尔大学 Denk 等[3] 提出将双光子激 发现象应用到共焦激光扫描显微镜中 ,开辟了双光 子荧光显微和成像这个崭新的领域 。近年来 ,有机 双光子吸收材料在诸多领域 ,尤其是双光子荧光显 微和成像中的应用得到了广泛的关注[4 —9] 。设计和 合成双光子吸收截面大和上转换荧光强的有机分子 能大大促进双光子荧光显微成像在生物系统中的应 用 ,包括单分子检测[10] 、免疫测定[11] 、DNA 片断测 定[12] 、化学和生物传感器[13] 、生物微芯片[14] 、毛细 管分离检测等[15] 。在大量的实验和理论研究基础 上 ,人们总结出有机双光子吸收材料的一些结构2性 能关系 ,提出了许多行之有效的设计及合成策略 , 大大推动了双光子吸收应用的发展[4 ,6 ,16 —20] 。
常规的双光子共焦显微和成像 ,通常采用传统 的荧光物如荧光素等作为双光子荧光发射体 。这些 荧光物的双光子吸收截面较小 ,在实验中必须采用 高强度激光激发高浓度荧光物的措施来获得足够强 的上转换荧光 ,这样加大了活体生物样品的观测难 度 。因此 ,寻求具有高荧光量子产率和大双光子吸 收截面的材料是这个领域的热点 。例如 ,2001 年 , Ventelon 等[6] 在二氢菲衍生物中获得了荧光量子产 率高达 86 %和双光子吸收截面是荧光素分子1 000 多倍的结果 。这些研究的深入将会对双光子共焦显
双光子荧光
双光子荧光显微成像由于兼具诸如近红外激发、暗场成像、避免荧光漂白和光致毒、定靶激发、高横向分辨率与纵向分辨率、降低生物组织吸光系数及降低组织自发荧光干扰等特点而显著地优于单光子荧光显微成像,为生命科学研究提供了更为锐利的工具.用于研究离子的含量及其对生理的影响、离子参与的生理活动机制、离子与分子的作用、特定分子的分布及其相互作用等方面的双光子荧光探针,是实现成像的关键.双光子荧光探针的研究旨在促进双光子荧光显微镜应用的发展,促进生命科学、医学科学的快速发展,同时也带动双光子荧光探针所隶属的化学这一学科的发展。
一种有机化合物双光子荧光现象的实验研究
一种有机化合物双光子荧光现象的实验研究有机化合物双光子荧光现象是新型的紫外线或可见光激发的发射特性，在生命科学研究和技术应用领域有着重要的意义。
本文以一种有机化合物双光子荧光现象的实验研究为标题，综述了其机理、实验原理、实验方法及获得研究结果。
一、机理介绍双光子荧光(DPEF)是指一种有机化合物在激发源辐照下，由初始发射光子对以及分子能级转换引起的荧光光子发射现象。
与一般的荧光现象不同，它是一种本质上的双光子效应，它的机制是：一个能量足够的激发光子先与分子的激发态相互作用，从而形成一个激发态；这个激发态随后被第二个激发光子反应，并以荧光形式释放出去。
二、实验原理双光子荧光是一个基于量子力学的现象，在实验中，乙烯在吸收一个可见光子时，形成一个电子激发态，随后紫外线反应，第二个激发光子与电子激发态进行精确的能量匹配，从而形成双光子荧光效应，使发射光子的辐射频率与激发源的频率完全对应。
三、实验方法1.室温下，用光积平台搭建实验装置；2.在装置上加入乙烯样品，使其溶解于溶剂；3.在装置上加入吸收光源，可用可见光或紫外线；4.将激发源焦点照射到溶液中，观察溶液荧光及其发射光谱；5.通过读出发射光谱，计算出发射的光子的能量和频率。
四、实验结果本实验的结果表明，乙烯在可见光和紫外线的激发源下，都能产生荧光发射。
而且，在激发源和发射光子能量之间，存在一个微妙的能量差，这说明，双光子荧光现象是一种精确匹配的现象，而不是简单的光子放出现象。
此外，本实验所获得的结果与现有研究结果一致。
五、结论本实验以一种有机化合物双光子荧光现象的实验研究为标题，综述了双光子荧光的机理、实验原理、实验方法及获得的结果。
实验表明，双光子荧光是一种本质上的双光子效应，具有准确的能量匹配特征，而不是单纯的光子发射现象。
本实验的结果与现有的文献结果相符，为双光子荧光的研究奠定了坚实的基础。
新型光学成像技术——双光子荧光显微镜
新型光学成像技术——双光子荧光显微镜光学成像技术一直以来都是生物学研究的重要手段。
传统的荧光显微镜通过荧光标记物的发光来研究生物分子和细胞的功能，但由于深度限制和荧光标记对细胞和生物体的影响，限制了研究深度和准确程度。
然而双光子荧光显微镜的出现改变了这个现状，具备高分辨率、深度成像和非侵入性标记等特点。
一、双光子荧光显微镜的原理双光子荧光显微镜的成像原理是利用非线性荧光效应——双光子激发荧光效应，当两个光子的能量合成能够与荧光分子的跃迁能量匹配时，荧光分子受到激发，发生荧光发射。
与传统的单光子激发荧光不同，双光子激发荧光只在聚焦点产生明显的荧光信号。
这是因为在双光子激发荧光中，荧光产生需要两个光子的同步作用。
这种非线性过程不利于在样品各个层次产生荧光信号。
因此，在使用双光子荧光显微镜进行样品成像时，只在聚焦点周围的小范围内进行信号的检测，从而能够获得更高的分辨率和更深的成像深度。
二、双光子荧光显微镜的特点1. 非侵入性成像传统的荧光显微镜需要生物体或细胞中荧光标记物的标记才能进行成像。
而双光子荧光显微镜不需要使用任何外部标记物，可以直接在生物体中进行成像。
这种非侵入式成像能力使得双光子荧光显微镜在活体成像和组织工程等应用方面有着广阔的应用前景。
2. 高分辨率成像由于双光子荧光显微镜的成像原理，只在聚焦点周围的小范围内进行信号的检测，能够获得更高的分辨率。
深度成像时，同样具备更高的分辨率，在成像深度达到300μm时，其分辨率保持在数百奈米量级。
3. 深度成像双光子荧光显微镜能够获得更深的成像深度。
传统的荧光显微镜在成像深度达到几十微米之后，即使在同样的条件下，荧光信号的强度会急剧减弱，因此限制了深度成像的应用范围。
而双光子荧光显微镜能够在成像深度达到1mm时，仍然能够获得较高的荧光信号强度和分辨率。
三、双光子荧光显微镜的应用1. 细胞成像双光子荧光显微镜能够对单个细胞进行成像，展示细胞内分子的构成和运动过程，以及细胞能量代谢和信号传递的机制等。
次氯酸双光子荧光探针的合成及其在生物成像中的应用
次氯酸双光子荧光探针的合成及其在生物成像中的应用中文摘要双光子吸收技术自问世以来一直受到了广泛的关注。
与单光子吸收材料相比，双光子吸收材料在分辨率、穿透深度具有显著的优势，可以用于显微成像、微纺织技术、三维数据存储、光限幅、上转换发光、光动力学治疗以及药物靶向释放等诸多领域。
特别是双光子显微技术，以近红外的激光为光源对生物样品进行成像，具有穿透性强，空间分辨率高，背景荧光干扰小，以及对生物样品的光损伤较小等优点，在生物医学领域具有广阔的应用前景。
然而，传统的双光子材料常常具有大共轭结构，水溶性差、细胞穿透能力差、生物毒性也较大，并不适用于生物成像。
因此，设计合成具有较高双光子吸收截面的有机小分子用于生物体内细胞、血管、组织成像，具有重要的研究价值。
本文设计合成了两种具有双光子吸收特性的荧光小分子，对其发光性能进行了系统的研究，探索它们在生物成像中的应用。
具体的研究内容包括：1、设计合成了一类以寡聚苯乙烯为骨架的双光子次氯酸荧光探针OPV-HOCl，并将其应用于活细胞及组织内的双光子成像。
在寡聚苯乙烯骨架上引入次氯酸识别基团——氧硫杂环戊烷，通过1H-NMR、13C-NMR、HRMS 对其结构进行了表征，并通过紫外光谱、荧光光谱等进一步研究了该探针对次氯酸的响应性能，测定了其双光子吸收截面。
加入次氯酸以后，探针分子末端的氧硫杂环戊烷基团被氧化，并生成醛基。
由于分子内强烈的电荷转移导致产物的双光子吸收截面提高了近15倍（从78.9GM提高到1131.5GM），因此OPV-HOCl可以作为一个双光子“turn-on”型次氯酸荧光探针。
此外，该探针还具有反应速度快、选择性好、pH适用范围宽等优点。
MTT实验表明该探针具有较小的细胞毒性。
由于该探针优异的次氯酸响应性能和较小的生物毒性，我们成功地将其用于小鼠胶质瘤细胞BV-2中次氯酸的检测，研究表明该探针可以透过细胞膜，并对细胞中外源性次氯酸和脂多糖诱导产生的内源性次氯酸具有高选择性的快速响应。
有机双光子pH荧光探针研究进展
有机双光子pH荧光探针研究进展杨志广鄢李宁宁张旭亮孔辉华郭达刘亚昍（河南省周口师范学院化学化工学院466001)摘要细胞内pH在生命体系许多生理过程中扮演着重要角色，检测细胞内pH变化对研究细胞功能以及生理和病理过程具有 重要意义。
在p H测试方法中，荧光分析法因具有操作简便尧灵敏度高、专一性和实时检测等优点而备受关注。
双光子荧光探针技 术不同于单光子荧光探针技术，具有长波吸收短波发射尧高度的三维空间选择性以及大的穿透深度等特点，在生命科学研究领域 应用前景广阔。
本文介绍了有机双光子吸收的基本原理以及近年有机双光子pH荧光探针的研究进展，同时对有机双光子pH荧 光探针未来的发展趋势进行了展望。
关键词p H双光子吸收荧光探针细胞功能检测细胞内pH在生命体系许多生理过程中扮演着重 要角色，包括细胞的代谢、生长、增殖、凋亡、信号转导 以及离子转运等。
研究发现，pH值的微小变化就有可 能导致细胞功能紊乱，如引起癌症、肾衰竭、肺病、阿尔 茨海默病等疾病。
因此，检测细胞内pH的动态变化对 于研究细胞的生理和病理过程具有十分重要的意义。
荧光探针法因具有操作简便、灵敏度高、选择性好以及 对细胞无损伤等特点，在检测细胞内p H变化中得到 了广泛的应用。
pH荧光探针主要是通过识别基团的 质子化或去质子化来改变探针分子的荧光信号而实现 pH响应的一类物质，大体可分为两类：一类是pH在 6.80~7.40范围内灵敏响应的细胞质探针;另一类是 pH在4.50~6.00范围内灵敏响应的酸性细胞器探针，如溶酶体探针。
与传统的单光子荧光探针相比，双 光子荧光探针具有近红外光激发、光毒性小和光漂白、自发荧光干扰弱以及组织穿透深度大等优点。
特别是 双光子共聚焦成像在细胞中能够延长活细胞和组织的 观察时间[1耀3]，这一独特优势使得双光子荧光探针技 术在生物医药领域具有强大的发展潜力和广阔的应用 前景。
本文介绍了有机双光子吸收的基本原理以及近 年有机双光子pH荧光探针的研究现状，同时对有机 双光子pH荧光探针未来的发展趋势进行了展望。
双光子荧光显微镜的研究
浙江大学』Ⅲ！｛ｊ学位论文第二章双光ｆ成像理论吒。
ｍ＝叫２吨。
篙ｅｘｐｆ（２Ｂ．４）山§２２的分析可以知道，这里口；为一比例系数，与单光子探测系统有关；口，现对单光子荧光强度和双光子荧光强度在径向作一比较，令公式（２．３．３）和（２．３．４）中的ｚ＝Ｏ，可以得到荧光光强的径向分布方程分别为：Ｌ。
，叫ｏｅｘ。
吲旺，ｓ，Ｌ。
胁，叫。
２唧陶㈦，．ｓ，（ａ）（ｂ）图２—３荧光强度径向归一化分布（ａ）甲光子荧光光强径向归～化分布（ｂ）双光予荧光光强径向归～化分布蔫浙江大学顺士学位论文第三章双光于实验系统简介第三章双光子实验系统简介在了解了双光予成像理论的基础上，介绍实验中双光子成像系统的流程以及备个组成部分。
通过前期的实验，分析和总结得到的实验数据，经理论计算后，对取光子系统的性能做了一个测试，为双光子荧光成像实验，以及双光子、ＯＣＴ相结合实现结构功能成像等后期科研的展开打下基础。
本章首先介绍了双光子荧光成像系统的流程，然后对其主要部分：光学成像设计、光电转换、机械扫描做了一个简要的介绍，研制了新型的扫描探头。
§３．１双光子荧光成像实验系统流程双光予实验系统的总体构架如图３一ｌ所示图３，ｌ双光子荧光显微镜实验系统图对于一个完整的双光子荧光成像系统，一般应包括：光学成像、光电转换、机械扫描、计算机控制、数据采集、数据处理和显示等几个部分。
其系统流程如第二章职光予实验系统简介在探测器前面放置了荧光滤光片，来选择适当的荧光范围，过滤背景光，提高系统的信噪比。
图３—３中虚线框内表示的是ＮＩＫＯＮ５０Ｉ显微镜丰体，其详细结构如图３－４所示：图３．４ＮＩＫＯＮ５０Ｉ显微镜光路图箭头的方向表示光束入射的方向。
由图可以知道，Ｎ１ＫＯＮ５０１显微镜本身结构中就包含了落射式和透射式两种激发荧光的方式，可以根据需要来选择。
由第章ｌ｝，的介绍，可以知道，对本次实验来说，为最大程度的探测荧光，用落射式采集荧光的效率高，所以只利用显微镜上半部分的光路。
双光子激光扫描荧光显微镜及其应用
表 1 几种常见荧光分子的单光子 、双光子 和三光子的吸收截面 3 [5 ]
荧光分子
δ1 (λ/ nm) / 10 - 16cm2
ηδ2 (700nm)
/ 10 - 50cm4·s / 光子
ηδ3 (700nm) / 10 - 83cm6·s2/ 光子2
DAPI free
113 (345nm)
Dansy1
TWO PHOTON LASER SCANNING FL UORESCENCE MICROSCOPY AND ITS APPL ICATIONS
CHEN De2Qiang XIA An2Dong WAN G Ke2Yi HUAN G Wen2Hao
( Depart ment of Precision M achi nery and Inst rument ation , U niversity of Science and Technology of Chi na , Hef ei 230026)
图 1 单 、双光子激发过程示意图
图 2 单 、双光子激发所形成的荧光形貌 (样品为罗丹明 B 的水溶液. 上为单光子激发 ,下为双光子激发)
3 材料的吸收截面 δ
吸收截面 δ是双光子激发现象的重要参数 , 它 的大小反映了分子吸收双光子的本领. 对单光子激 发中的吸收截面 δ已有较为准确的文献记载 , 而对 双光子乃至多光子吸收截面 δ,目前尚缺乏全面 、准 确的记载. 因此 ,对常用的荧光分子多光子吸收截面 δ和光谱的进一步研究 , 将有助于多光子激发共焦 激光扫描荧光显微镜的进一步广泛应用.
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2 双光子激发原理简介
在激光照射下 ,基态荧光分子或原子吸收一个 光子后成为激发态 ,随后又弛豫到某一基态 ,同时以 光子形式释放能量而发出荧光. 这一过程就是通常 的单光子激发情况. 1931 年 ,Maria G ppert - Mayer 预言一个分子或原子可以在同一个量子过程中 ,同 时吸收两个光子而成激发态 ,这种情况就是双光子 激发过程[2 ] . 1961 年 , Kaiser 等在 CaF2 ∶Eu2 + 晶体 中首次观察到了这种双光子激发现象[3 ] . 图 1 简单 地描述了这种双光子激发的过程. 比如在单光子激 发情形 ,NADH 酶在 350nm 的光激发下产生 450nm 的荧光 ,而在双光子激发情形 , NADH 酶则需同时 吸收两个 700nm 的光子才能产生 450nm 的荧光. 这 就是说 ,双光子技术可以使我们无需使用紫外光源
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一个虚能态 , 通过两个光子的
能量进行叠加而使处于基态的 电子达到激发态。
Has not been difficult, then does not have attains
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荧光物质在吸收了与其能级结 构匹配的能量后，电子由基态
S0 被激发至激发态 S1 ，经过辐
射跃迁后电子又回到基态 S0 ， 这一过程中发射出荧光。与单 光子荧光不同，双光子吸收过 程中，基态与激发态之间存在
目录
1.研究背景
2.基本原理
3.特点及优点
4.应
用
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1 双光子荧光背景介绍
双光子吸收是指在强光激发下,介质分子同时吸收两 个光子,从基态跃迁到两倍光子能量的激发态的过程。 早在1931年, Gppert Mayer 就在理论上预言了双光
双光子荧光产生原理：荧光分子吸收第一个光子后，跃迁 到虚能级上，该能级仅能存在几飞秒，便自动返回基态， 第二个光子必须在这几飞秒内与虚能级上的分子作用，从 基态跃迁到激发态，能量较大的激发态分子,通过内转换
使自己回到最低电子激发态的最低振动能级。处于此能级
的分子不是通过内转换的方式来消耗能量，回到基态，而 是通过发射出相应的光量子来释放能量，回到基态的各个 不同的振动能级时，就发射荧光。
子吸收的存在。
直到上世纪60年代初激光器出现后,才由Kaiser等首 先从实验上证实了双光子吸收过程。然而,由于一般材料 的双光子吸收截面很小,双光子吸收的实际应用受到限制, 使双光子吸收研究一直停留在基础研究水平。
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3 双光子荧光的特点及优点
3.1 特点：
(1)双光子吸收的辐射光源一般在可见-近红外区 (≥800nm)； (2)双光子吸收的强度与激发光强的平方成正比，是 一种非线性吸收，荧光强度比单光子吸收强；
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2.2 双光子吸收的示 意图
• 图 (a) 为单光子激发过程。在激 光照射下，基态分子或原子吸收 一个光子后成为激发态 ，随后 又弛豫到某一基态，同时以光子 形式释放能量而发出荧光。这一 过程就是单光子激发。 当使用光波长为图 (a) 中激发光 波长两倍的光，对相同物质进行 激发时，由于所使用光波的光子 能量仅为原来的一半，无法通过 单光子过程使基态电子激发到激 发态。只有在光子密度极高的情 况下，基态的电子可以同时吸收 两个光子，使处于基态的电子跃 迁至激发态，这种现象如图 (b) 所示。
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双光子荧光
（Two-photon fluorescence）
组员：樊艳萍
孟 筝 贾晓波 白秋红
2015.10.22
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1990年,美国康奈尔大学Denk等提出将双光子激发现 象应用到共焦激光扫描显微镜中,开辟了双光子荧光显微 和成像这个崭新的领域。
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近年来,有机双光子吸收材料在诸多领域 ,尤其 是双光子荧光显微和成像中的应用得到了广泛的关
3.2 优点
• (2)双光子荧光使用红外激光作为激发光源，能大 大地降低生物组织对激发光的吸收，可获得较强 的样品荧光；
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Hale Waihona Puke 3.2 优点• (3)长波长光源作为双光子荧光的激发光源，可以 避免样品中激发波长较低的自发荧光物质的干扰；
注。设计和合成双光子吸收截面大和上转换荧光强
的有机分子能大大促进双光子荧光显微成像在生物 系统中的应用 ,包括单分子检测、免疫测定、 DNA 片
断测定、化学和生物传感器、生物微芯片、毛细管
分离检测等。 在大量的实验和理论研究基础上,人们总结出有 机双光子吸收材料的一些结构-性能关系,提出了许 多行之有效的设计及合成策略,大大推动了双光子吸 收应用的发展。
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• 与单光子相比，双光子激发过程就是基态荧光分子或原 子同时吸收两个光子激发至激发态，通过弛豫过程，辐 射出频率略小于两倍入射光频率的荧光光子。比如对
NADH酶，在单光子激发情形下，需在350 nm的光激发下
产生450nm 的荧光。而在双光子激发情形下，可采用光 损伤较小的红外或近红外光，如700nm 的激光来激发得 到的450 nm荧光。
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2 双光子荧光基本原理
2.1 单、双光子荧光的介绍
• 在一般的荧光现象中，由于激发光的光子密度低，一个荧 光分子只能同时吸收一个光子，再通过辐射跃迁发射一个 荧光光子 ，就是单光子荧光。
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3.2 优点
(1)由于激发光源波长较长，受光散射影响较小，使 得入射光的损耗较小，在介质中的穿透性较好；
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