光动力学疗法影响变形链球菌生长和形态的体外研究
临床微生物学检验：链球菌属
肺炎链球菌脐窝状菌落（培养48h后）
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肺炎链球菌粘液样菌落 28
3.生化反应
• 分解葡萄糖，产酸不产气。 • 一般不分解菊糖，不被胆汁溶解（鉴别
甲型溶血性链球菌与肺炎链球菌）。 • 触酶（-），与葡萄球菌不同。
•肺炎链球菌： 分解葡萄糖、乳糖和菊糖，胆汁可溶菌， Optochin敏感，触酶（-）
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小结
• 链球菌属细菌种类多，其中某些菌种为毒力强的 致病菌。分类较为复杂，临床分离株仍以传统的 血平板上溶血现象、菌落特点和Lancefield抗原 血清分型，结合生化反应进行鉴定。
• 肺炎链球菌：革兰阳性双球菌，有荚膜，脐窝样 菌落、OP（+）、胆汁溶菌（+）
• A群链球菌：镜下特点、菌落特点、杆菌肽、血清 试验
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链球菌微生物检验程序
涂片染色 G+球菌，触酶（-）
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五、药敏试验药物选择
β溶血链球菌 肺炎链球菌 草绿色链球菌
药敏时药物选择不同
首选青霉素和氨苄西林
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预防分娩妇女B群链球菌感染：
①推荐使用青霉素和氨苄西林。 ②低危险性青霉素过敏者，推荐头孢唑林。 ③高危险性青霉素过敏者推荐克林霉素或红霉素
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血清学检查
抗O试验（ASO test）： 链球菌侵入体内产生SLO，刺激机体产生
相应抗体ASO(血清），加入SLO乳胶试剂，SLO 抗体(ASO)与乳胶试剂(吸附有SLO)反应，产生 凝集，为阳性；无凝集，为阴性。
–原理：中和试验，用SLO检测血清中的ASO –方法：间接凝集 –结果：效价大于400单位 –意义：活动性风湿热及肾小球肾炎辅助诊断
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急性肾小球肾炎的临床表现：水肿、 血尿、蛋白尿等。
变异链球菌防治药物的研究现状
变异链球菌防治药物的研究现状刘开云;孙红武;张卫军【摘要】变异链球菌是人类丰要的致龋微生物,其在口腔中的定植与龋病的发生密切相关.国内外学者多年来一直致力于寻找和研究抑制或杀灭变异链球菌的药物,曾运用抗生素、消毒剂、氟化物和免疫制剂等抗变异链球菌感染.本文就抗变异链球菌化学合成药物和抗变异链球菌植物提取物等研究进展作一综述.%Streptococcus mutans colonization in the oral cavity is closely related to the incidence of dental caries. It is the main cariogenic micro-organisms to human. Domestic and foreign scholars, who engaged in finding and research to inhibit or kill Streptococcus mutans drugs, used the agents of antibiotics, disinfectants, fluoride and immune products to anti -Streptococcus mutans infection. Chemistry of synthetic and plant extract drugs anti -Streptococcus mutans drugs reviewed in the paper.【期刊名称】《国际口腔医学杂志》【年(卷),期】2012(039)005【总页数】3页(P683-685)【关键词】变异链球菌;龋病;药物;预防;治疗【作者】刘开云;孙红武;张卫军【作者单位】国家免疫生物制品技术工程研究中心暨第三军医大学药学院微生物与生物化学药学教研室,重庆,400038;国家免疫生物制品技术工程研究中心暨第三军医大学药学院微生物与生物化学药学教研室,重庆,400038;国家免疫生物制品技术工程研究中心暨第三军医大学药学院微生物与生物化学药学教研室,重庆,400038【正文语种】中文【中图分类】R781.1变异链球菌是口腔中的主要常驻菌之一，是龋病的主要致病菌。
肺炎链球菌的鉴定方法
肺炎链球菌的鉴定方法来源：检验医学网细菌学检验不仅对疾病的病原学诊断有重要价值，同时对临床治疗的药物选择也具有十分重要意义。
一、生物学性状肺炎链球菌革兰染色呈阳性。
球形或矛头状，成双排列，少呈链状。
在组织中可形成荚膜（人工培养荚膜逐渐消失），无鞭毛及芽孢。
2. 培养特点（1）培养基肺炎链球菌对营养要求较高，需采用质量好的哥伦比亚琼脂基础和新鲜血液（ 5％马血或羊血）。
琼脂浓度可适当下降至1％～1.2％，有利于肺炎链球菌的生长。
1）标本处理及时将采集标本接种到适当的培养基上是提高分离率的前提。
因为，肺炎链球菌对干燥、对寒冷的抵抗力均较弱，在标本离开机体暴露于外界复杂的环境中，其存活率十分低，不及时接种适当培养基是导致分离率低的主要原因。
2）选择性分离培养基培养基中添加5μg/ml庆大霉素有利于肺炎链球菌的分离。
3)培养环境5～10％CO2、35℃培养24～48h。
（3）肺炎链球菌的菌落形态在营养丰富的培养基上，肺炎链球菌形成扁平、中间有凹陷的典型菌落，少数菌可呈粘液型菌落。
3.抗原结构（1）种属特异性抗原：为菌体多糖抗原，存在于肺炎链球菌的细胞壁。
（2）型特异性抗原：是存在于肺炎链球菌荚膜中的一种多糖多聚体，可溶于水，据此抗原可将肺炎链球菌分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ……等个型，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型致病性最强。
（3）菌体核蛋白抗原：存在于菌体深部，为蛋白质，无特异性。
二、肺炎链球菌鉴定肺炎链球菌的鉴定，主要应与甲型溶血性链球菌鉴别。
其中以胆汁溶菌试验、菊糖发酵和optochin试验最为常用。
必要时可作小鼠毒力试验加以鉴别。
在上述试验中，肺炎链球菌均应阳性，而甲型溶血性链球菌为阴性。
必要时可用特异性单克隆乳胶或自动化仪器等相应鉴定卡作鉴定。
1. 溶血性检查肺炎链球菌在厌氧或二氧化碳环境中溶血能力大大加强，草绿色溶血环很大，可与其他草绿色链球菌相区别。
2. Optochin(OP)敏感试验optochin即乙基氢化叩卟啉，因结构似于奎宁，故又称为乙基氢化羟基奎宁。
光动力三阶段治疗尖锐湿疣的临床疗效
光动力三阶段治疗尖锐湿疣的临床疗效发布时间：2021-08-30T06:04:48.359Z 来源：《医师在线》2021年21期作者：李运生[导读] 目的本文旨在观察在尖锐湿疣治疗中，采用光动力三阶段治疗方式的临床疗效李运生贺州市人民医院皮肤科广西贺州 542800摘要：目的本文旨在观察在尖锐湿疣治疗中，采用光动力三阶段治疗方式的临床疗效。
方法随机入选我院收治于2019年8月10日/2020年12月30日的70例尖锐湿疣患者为研究观察对象，将患者依据随机数字表法分两组，对照U组（采用CO2 激光治疗）、三阶段N组（采用CO2 激光治疗+光动力疗法+局部免疫调节剂三阶段治疗），观察两组患者治疗3个月后复发率情况、免疫因子情况。
结果治疗3个月后三阶段N组复发率、IL-4和 IL-10水平明显低于对照U组（=6.248，t=7.068、28.968），三阶段N组IL-12水平高于对照U组（t=24.544），具可比性（P＜0.05）。
结论将光动力三阶段治疗应用在尖锐湿疣治疗中，可以有效降低患者再复发率，改善患者免疫因子水平。
关键词：尖锐湿疣；CO2 激光治疗；光动力疗法；免疫调节剂；IL-10尖锐湿疣是临床上常见的性传播疾病，病发原因为人乳头瘤病毒（HPV）感染所致，病发群体以18岁～50岁性活跃群体为主[1]。
尖锐湿疣具有一定传染性，会对患者生殖器产生影响，严重影响患者生命安全，故及时选择科学手段进行治疗，具有积极意义。
本文研究以70例尖锐湿疣患者为研究观察对象，意在分析光动力三阶段治疗尖锐湿疣的临床疗效，以为尖锐湿疣治疗效果增强提供支持。
1一般资料与方法1.1一般资料2019年8月10日～2020年12月30日尖锐湿疣患者70例为研究观察对象，依据随机数字表法分对照U组（35例采用CO2 激光治疗）、三阶段N组（35例采用CO2 激光治疗+光动力疗法+局部免疫调节剂三阶段治疗）。
对照U组男18例、女17例，年龄20岁～47岁，平均年龄（31.36±1.78）岁，病程5个月～21个月，平均（10.36±1.93）个月；三阶段N组男16例，女19例，年龄19岁～45岁，平均（31.43±1.83）岁，病程6个月～20个月，平均（10.29±1.88）个月；两组患者一般资料具同质性（P＞0.05）。
亚甲基蓝对白色念珠菌的光动力杀伤作用
亚甲基蓝对白色念珠菌的光动力杀伤作用李峥;甄秀梅;黄力毅;杨倩;赵玥;覃金梅;齐琪;滕春玲【摘要】目的:探讨亚甲基蓝(MB)介导的光动力疗法(PDT)对白色念珠菌的作用,并初步研究其作用机制.方法:采用分光光度计检测MB溶液的最大吸收峰位确定MB 的最适波长;通过不同浓度的MB对白色念珠菌杀伤作用确定最适MB浓度;通过予以不同的光能量光的照射,确定适宜的光能量范围,并使用荧光分子探针SOSG和HPF检测MB在不同光能量下产生的荧光量.结果:在波长660nm的光照射下,MB 抗白色念珠菌作用的最适浓度为100μmol/L;0～320J/cm2的光能量范围内,光能量越高MB-PDT杀菌作用越强(P<0.05),光能量为0J/cm2的PDT组与空白对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05);在相同光能量下,荧光分子探针SOSG所测得的MB荧光量均高于HPF的荧光测得量(均P<0.01).结论:在160～320J/cm2光能量范围内,MB介导的PDT对白色念珠菌具有较好的杀伤作用,MB杀灭白色念珠菌可能主要为PDT灭菌机制中的Ⅱ型机制.%Objective:To evaluate the effect and mechanism of methylene blue(MB) mediated photodynamic therapy(PDT) on Candida albicans.Methods:The maximum absorption peak of MB solution is detected by spectrophotometer to determine the optimal wavelength of MB.The optimal MB concentration was determined by the effect of different concentrations of MB on the killing effect of Candida albicans.The appropriate range of light energy was determined by irradiating different light energy light,and fluorescence of MB under different light energy was detected by using SOSG and HPF.Results:The optimum concentration of MB against Candida albicans was 100μmol/L at the wavelength of 660nm.The MB mediated photodynamic sterilization ofCandida albicans was enhanced with the increase of the light energy from 0-320 J/ cm2(P<0.05).There was no significant difference between PDT group with light energy of 0 J/cm2 and the blank controlgroup(P>0.05).The fluorescence amount of MB measured by SOSG was higher than that by HPF at the same lightenergy(P<0.01).Conclusion:Within the light energy range from 160to 320J/cm2, MB mediated PDT had a good killing effect on Candida albicans.MB killed Candida albicans mostly via the typeⅡ mechanism in the PDT sterilization mechanism.【期刊名称】《广西医科大学学报》【年(卷),期】2019(036)004【总页数】4页(P555-558)【关键词】光动力疗法;亚甲基蓝;白色念珠菌;荧光分子探针【作者】李峥;甄秀梅;黄力毅;杨倩;赵玥;覃金梅;齐琪;滕春玲【作者单位】广西医科大学第一附属医院感染性疾病科广西艾滋病防治研究重点实验室,南宁 530021;广西医科大学第一附属医院感染性疾病科广西艾滋病防治研究重点实验室,南宁 530021;广西医科大学第一附属医院感染性疾病科广西艾滋病防治研究重点实验室,南宁 530021;广西医科大学第一附属医院感染性疾病科广西艾滋病防治研究重点实验室,南宁 530021;广西医科大学第一附属医院感染性疾病科广西艾滋病防治研究重点实验室,南宁 530021;广西医科大学第一附属医院感染性疾病科广西艾滋病防治研究重点实验室,南宁 530021;广西医科大学第一附属医院感染性疾病科广西艾滋病防治研究重点实验室,南宁 530021;广西医科大学第一附属医院感染性疾病科广西艾滋病防治研究重点实验室,南宁 530021【正文语种】中文【中图分类】R454.2由于广谱抗生素和抗真菌药物的广泛使用，抗菌药物数量的有限及微生物耐药性的增加[1]，真菌感染发病率不断的提升，导致病死率也在不断的升高。
金丝桃素对铜绿假单胞菌的体外光动力杀菌研究
金丝桃素对铜绿假单胞菌的体外光动力杀菌研究肖冬梅;周倩;黄春妮;廖凤华;利嘉林;韦君杰;张子莹;刘海波【摘要】以具有多重耐药性的铜绿假单胞菌为研究对象,研究金丝桃素介导的光动力疗法对铜绿假单胞菌的杀灭作用.采用CEL-TCX250-氙灯作为冷光源,通过96孔培养板和细菌涂板法研究了孵化时间、光照时间、光功率和光斑大小对铜绿假单胞菌的光动力杀菌效果,本研究分为光动力治疗组( PDT组)、光敏剂不光照组、只有氙灯照射组和空白对照组.结果表明:孵化时间为60 min、光照时间为30 min、光功率为250 W且光斑直径为2 cm时,光动力杀菌效果最好,其中光动力治疗组细菌全部被杀死,光敏剂不光照组、只有氙灯照射组和空白对照组均有大量细菌生长.由于金丝桃素的水溶性较差,这在一定程度上限制了它的应用,本研究通过β-CDP、CTAB、SDS和Tween 80对金丝桃素分子进行包合,形成包和物,从而增加了金丝桃素的水溶性.结果表明包合物的浓度越高,包裹的金丝桃素分子数就越多,金丝桃素在包合物水溶液中的荧光强度也就越强.%The study was designed to investigate the photodynamic therapy effect( PDT) of hypericin on Pseudomonas aeruginosa in vitro. To evaluate the antimicrobial property of hypericin with xenon light, the study was divided into four groups including PDT、 only hypericin、 only xenon light and blank group. The 96-wells and spread plate methods were used to count the bacteria strains with different incubation and illumination times、 optical power and sizes of light spot. The optimum conditions for photodynamic therapy were 60 min for incubation, 30 min for illumination; optical power was fixed at 250 W; and spot diameter was fixed D=2 cm. Since the water-solubility of hypericin was poor, its applications in clinical was restrained. In this work,water solubility enhancements of hypericin was carried out in the presence of β-CDP and surfactants such as CTAB、SDS and Tween 80 through aggregate clathrates. The higher the concentrations of CTAB、SDS、Tween -80 and β-CDP, the greater the amounts of hypericin, and the stronger the fluorescence intensity of hypericin in those solutions.【期刊名称】《广西大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2018(043)003【总页数】10页(P1267-1276)【关键词】铜绿假单胞菌;光动力疗法;金丝桃素;包合物【作者】肖冬梅;周倩;黄春妮;廖凤华;利嘉林;韦君杰;张子莹;刘海波【作者单位】广西大学化学化工学院,广西南宁 530004;广西大学化学化工学院,广西南宁 530004;广西大学化学化工学院,广西南宁 530004;广西大学化学化工学院,广西南宁 530004;广西大学化学化工学院,广西南宁 530004;广西大学化学化工学院,广西南宁 530004;广西大学化学化工学院,广西南宁 530004;广西大学化学化工学院,广西南宁 530004【正文语种】中文【中图分类】TQ460 引言铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa.PA)又称绿脓杆菌，是临床上常见的革兰氏阴性条件致病杆菌，能够诱发机体各部位感染，在患者的烧伤感染、手术刀口和伤口中尤为显著，且该致病菌对多种抗菌药物天然不敏感，国外有报道铜绿假单胞菌感染病死亡率高达5.1%[1]，而且随着抗生素类药物在临床上的广泛应用甚至是滥用，导致了大量耐药菌株的产生，这对临床治疗是一个极大的挑战，因此寻找一种新的治疗方法迫在眉睫[2]。
肺炎链球菌鉴定流程
肺炎链球菌鉴定流程肺炎链球菌是一种革兰阳性菌，可引起肺炎、脑膜炎和败血症等严重感染。
其识别需要准确可靠的实验室检测。
以下是肺炎链球菌鉴定的综合流程：显微镜检查：将疑似标本制成涂片，革兰染色。
在显微镜下观察革兰阳性球菌，通常呈卵圆形或兰氏链球菌排列。
培养和形态学特征：疑似标本接种于适当的培养基上，如血琼脂平板。
培养 24-48 小时，观察菌落形态、溶血性（α、β、γ）。
α溶血菌落周围出现绿色透明晕环。
生化反应：进行生化反应，如 katalase 试验、optochin 敏感性试验。
Katalase 阳性菌产生气泡，optochin 敏感菌在含 optochin 的培养基上生长受抑制。
抗原检测：利用免疫学方法检测肺炎链球菌荚膜多糖 (CPS) 抗原。
常见的技术包括乳胶凝集试验和酶联免疫吸附测定 (ELISA)。
不同血清型荚膜多糖抗原可用于区分不同的肺炎链球菌株。
分子检测：利用聚合酶链反应 (PCR) 等分子技术检测肺炎链球菌特异性基因。
PCR 可快速灵敏地检测出肺炎链球菌，即使在标本量少或菌载量低的情况下。
血清分型：根据肺炎链球菌荚膜多糖抗原的不同，将其分为 90 多种血清型。
血清分型对于流行病学调查和疫苗接种策略至关重要。
耐药性检测：检测肺炎链球菌对常用抗生素的耐药性。
常见的抗生素包括青霉素、头孢菌素和宏观内酯类。
耐药性检测结果指导临床治疗方案的选择。
综合解读：结合上述检测结果，综合解读以确定疑似标本中是否含有肺炎链球菌。
准确的鉴定有助于指导患者的管理和控制肺炎链球菌感染的传播。
优势和局限性：肺炎链球菌的鉴定流程提供了准确可靠的结果。
综合方法提高了检测的灵敏性和特异性。
分子检测技术在标本量少或难以培养的情况下尤为有用。
培养时间和抗生素耐药性检测结果的等待时间可能是局限性。
抗菌光敏剂的分类及研究进展
抗菌光敏剂的分类及研究进展周盼;谢小燕;熊力;张东山;文宇【摘要】目前控制细菌和病毒感染性疾病的方法很多,但由于微生物菌株种类越来越多,且耐药微生物菌株不断涌现,已有的治疗手段无法取得良好疗效,因此探索新的抗微生物治疗方法迫在眉睫.光动力抗菌化学疗法是基于光动力疗法的原理,利用光敏剂在异常组织选择性聚集,在分子氧的参与下,由特定波长的光激发产生活性氧,引发一系列的光化学反应,对微生物进行选择性杀伤的一种新方法.光动力抗菌化学疗法对细菌、真菌和病毒引起的感染,特别是耐药菌感染均显示很好的疗效.本文将对光动力抗菌化学疗法中常使用的光敏剂进行分类,并对其研究进展进行综述.%As the variety of microorganisms and more and more antibiotics-resistant bacteria are identified,the treatment of bacterial and viral infections have become less effective in recent years,and exploring a new antimicrobial therapy is imperative.Photodynamic antimicrobial chemotherapy (PACT) is a new anti-infection method with the similar principle of photodynamic therapy that utilizes light of an appropriate wavelength to excite the nontoxic photosensitizers which selectively target tissue cells,in the presence of oxygen,generates reactive oxygen species and leads to a series of photochemical reactions which are responsible for the killing of microbial cells nearby.PACT is an effective method for treating the infections caused by bacteria,fungi,or viruses,especially for the antibiotics-resistant infections.In this paper,we will give an overview of current knowledge regarding the classification of photosensitizer.【期刊名称】《激光生物学报》【年(卷),期】2017(026)003【总页数】5页(P193-197)【关键词】光动力抗菌化学疗法;光敏剂;微生物【作者】周盼;谢小燕;熊力;张东山;文宇【作者单位】中南大学湘雅二医院普通外科,湖南长沙 410011;中南大学湘雅二医院口腔科,湖南长沙 410011;中南大学湘雅二医院普通外科,湖南长沙 410011;中南大学湘雅二医院肾内科,湖南长沙 410011;中南大学湘雅二医院急诊科,湖南长沙 410011;中南大学湘雅二医院普通外科,湖南长沙 410011【正文语种】中文【中图分类】R454.2光动力疗法(photodynamic therapy, PDT)是利用光敏剂(photosensitizer，PS)在异常组织选择性聚集，在分子氧的参与下，由特定波长的光激发产生活性氧(reactive oxygen species，ROS)，并发生一系列光化学反应，对异常组织进行选择性杀伤的一种疾病诊疗新技术。
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光动力学疗法影响变形链球菌生长和形态的体外研究许小辉1，蒋琳1，林居红1，刘明方2（401147重庆，重庆医科大学附属口腔医院儿童牙病中心与口腔预防科1；400016重庆，重庆医科大学实验教学中心2）[摘要] 目的研究甲苯胺蓝为光敏剂介导的光动力学疗法对变形链球菌体外生长及表面形态的影响，探讨光动力学疗法影响致龋菌生长代谢的作用机制。
方法在不同光剂量和不同光敏剂浓度下，通过体外活菌菌落计数法测定光动力学疗法对变形链球菌的生长抑制作用，扫描电镜观察光动力学疗法处理前后菌体表面形态的改变，实验分空白对照组、光敏剂对照组、光对照组和实验组，各组间活菌菌落取对数值后采用析因设计方差分析。
结果光动力学疗法能显著抑制变形链球菌的体外生长，随着光照时间和光敏剂浓度的增加，其灭菌效果逐渐增强。
当光敏剂浓度为100 μg/ml，光照时间为5、15、25 min时，细菌菌落对数值分别为7.40±0.13、6.86±0.14、6.44±0.28，与空白对照组（8.30±0.04）相比差异有显著性（P<0.01），5 min与15 min两实验组之间差异有显著性（P<0.01）。
光敏剂浓度和光剂量二因素之间存在交互作用（F=19.47, P<0.01）。
扫描电镜观察结果显示实验组变形链球菌与对照组相比菌体表面粗糙不平，有水泡状凸起。
结论甲苯胺蓝为光敏剂介导的光动力学疗法能显著抑制变形链球菌体外生长并改变其表面形态。
[关键词] 光动力学疗法；变形链球菌；龋病[中图法分类号]R780.1 [文献标志码] AIn vitro study of Photodynamic Therapy on the Viability and Morphology of Streptococcus mutansXu Xiaohui1, Lin Juhong1, Liu Mingfang2, Jiang Lin(1Children’s dental center, the Affiliated Stomatology Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing,401147; 2Teaching center of Chongqing Medical University, Chongqing,400015, China) [Abstract] Objective To evaluate the impact of photodynamic therapy on the viability and morphology of Streptococcus mutans in a planktonic culture. Methods Inhibitory action of toluidine blue O-mediated photodynamic therapy on Streptococcus mutans were analyzed by colony-counting method under different light intensity in vitro conditions;Cell morphologic changes of streptococcus mutans was observed under scanning electron microscope. Samples were prepared and divided into control group , photosensitizer control group, light control group and PDT group. Results Significant reductions in the bacterial count were observed for PDT when the photosensitizer concentration was 100μg/ml , with the following values observed for 5、15min and 25 min of irradiation time for total streptococcus mutans : 7.40±0.13、6.86±0.14、6.44±0.28 respectively, which were significant statistics difference s(P<0.05) comparied with control group:8.30±0.04.Photosensitizer concentration and the light dosage existenced correlation actions（F=19.47, P<0.01）; The bacterial cell surfaces of PDT group became rough , with blister shaped bulge. Conclusion It was demonstrated that PDT was efficient at killing microorganisms and changing bacteria’s morphology.[Key words] Photodynamic therapy; Streptococcus mutans; Dental cariesSupported by the project of Chongqing Bureau of Public Health（2008-2-243). Corresponding author:Lin Juhong, Tel:（023）89035821-8301, E-mail : juhonglin@【基金项目】重庆市卫生局科研课题基金资助（2008-2-243)【作者简介】林居红，电话：（023）88860090，E-mail : juhonglin@光动力学疗法(photodynamic therapy，PDT)是一种联合利用光、光敏剂和氧分子产生光化学效应选择性杀伤病原微生物的新方法[1]，当感染部位局限时，其治疗效果更具优势。
近年来，PDT逐渐应用于口腔医学。
作为继癌症、心血管疾病之后的第三大慢性非传染性疾病，龋病形成和发展的主要因素是细菌及其代谢产物。
目前国外已有学者研究不同光敏剂介导的PDT对主要致龋菌的影响，以探索其应用于控制菌斑和预防龋病的可能性[2]；国内关于PDT在龋病防治领域的研究报道甚少。
变形链球菌是公认的主要致龋菌之一，其在口腔中存在的数量及比例，可以作为龋患风险评估的一个重要指标。
本实验通过体外实验研究在不同光剂量和不同光敏剂浓度下PDT对变形链球菌的生长抑制作用，并用扫描电镜观察处理前后变形链球菌菌体形态的改变，初步探讨PDT影响致龋细菌生长代谢的机制，为其作为一种预防龋病的新方法应用于临床提供初步理论依据。
1材料与方法1.1 实验菌株与培养基变形链球菌Streptococcus mutans A TCC25175。
实验菌株由四川大学口腔生物医学工程教育部重点实验室提供。
培养基：BHI培养基，由友康基业生物科技（北京）有限公司提供。
1.2光敏剂和光源光敏剂：甲苯胺蓝（toluidine blue O,TBO）粉剂（Sigma, St. Louis, MO,USA），用生理盐水分别配制成浓度为50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml的溶液，0.22μm微孔滤器过滤除菌，4℃下避光保存，备用。
光源：欧美娜窄谱红光光动力治疗仪(Photo Therapeutics Ltd，UK)，由重庆医科大学第一附属医院提供。
具体参数如下：波长（633±3）nm，输出功率（40±5）W,功率密度为100mW/cm2，光源类型为LED二极管非相干光。
1.3 实验方法1.3.1 实验菌液的制备将变形链球菌ATCC25175冻干菌种复苏，接种于BHI血琼脂培养基，37℃下厌氧（80% N2，10%H2，10% CO2）培养48 h，经生化鉴定及形态学检查为纯培养物后，接种于BHI液体培养基增菌18 h，麦氏比浊法调整菌液浓度为1.0McFarland（3.0×108 CFU/ml），稀释100倍后备用。
1.3.2 PDT的处理过程和实验分组取标准96孔板(Coming Incorporated)1个，每孔分别滴加100 μl甲苯胺蓝溶液和100 μl菌液，使甲苯胺蓝最终浓度为25、50、100 μg/ml，菌液浓度为1.5×106 CFU/ml。
空白对照组分别滴加100 μl BHI培养基和100 μl菌液。
在涡旋振荡器上混匀后，黑暗中放置5 min，然后按产品说明书用LED光源在距离96板3 cm 处照射，照射时间分别为5、15、25 min，相应的照射剂量为31.5、94.5、157.5 J/cm2。
为了避免光照时间的相互干扰，在处理组照射时，其他各组均用锡箔纸遮盖以隔绝光源。
1.3.3 菌落计数 PDT处理后，将96孔板置于涡旋振荡器上震荡1 min以充分混匀菌液，取100 μl菌液稀释于900 μl 0.01 mol/L无菌PBS缓冲液（pH=7.0）中，吹打均匀后再取100 μl菌液稀释于900 μl PBS缓冲液中，如此反复做10倍递增连续稀释，使各管中的菌液稀释度分别为102～105 CFU/ml，取103 ～105 CFU/ml稀释液各20 μl滴注于BHI琼脂平板培养基上，37℃下厌氧（80% N2、10%H2、10% CO2）培养24～48 h，选择最合适的浓度段进行菌落计数。
取每组3个平行样，取均值，实验重复3次。
1.3.4 扫描电镜观察在无菌试管中放入大小为0.8 cm×0.8 cm无菌盖玻片，加入5 ml BHI液体培养基，接种菌液100 μl,37℃兼性厌氧条件下（80% N2，10%H2，10% CO2）培养24 h后，涂片检查以确保样本无污染。
小心弃去菌液，取出盖玻片，无菌PBS缓冲液轻柔漂洗2遍以去除疏松附着的游离菌，实验组盖玻片表面滴加25 μl浓度为100 μg/ml的甲苯胺蓝，黑暗中放置5 min后光照15 min，相应的能量密度为94.5 J/cm2。
对照组盖玻片不做处理，仅用无菌PBS缓冲液轻柔漂洗2遍，将实验组和对照组盖玻片立即放入2.5%戊二醛溶液中，4℃下过夜，然后依次用30%、50%、70%、90%、100%乙醇梯度脱水，干燥、喷金，扫描电镜下观察细菌形态。