组胺对皮肤角化上皮屏障功能的作用的研究

２０１５正　第３６卷　８月　第４期　首都医科大学学报　

Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃａｐｉｔａｌ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ａｕｇ．２０１５　

Ｖ０１．３６　Ｎｏ．４　

［ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００６－７７９５．２０１５．０４．０１８］　组胺对皮肤角化上皮屏障功能的作用的研究　・

基础研究・　

段延　，　矫健　，　张罗　，　，。　（１．首都医科大学附属北京同仁医院过敏科，北京１００００５；２．首都医科大学附属北京同仁医院耳鼻咽喉头颈外科，　北京１００００５；３．北京市耳鼻咽喉科研究所鼻病研究北京市重点实验室，北京１００００５）　

【摘要】　目的检测体外培养人皮肤角化上皮细胞在组胺刺激下的跨膜阻力（ｔｒａｎｓ－ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，ＴＥＲ）和细胞间通透性　的变化，研究组胺对角化上皮屏障功能的作用。方法应用气一液细胞培养技术（ａｉｒ－ｌｉｑｕｉｄ　ｉｎｔｅｒｆａｃｅ，ＡＬＩ）培养正常人和特异性皮　炎（ａｔｏｐｉｃ　ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ，ＡＤ）患者皮肤原代角化上皮细胞，以组胺及其受体拮抗剂等连续刺激上皮细胞９６　ｈ，监测ＴＥＲ及细胞间荧　光素通过强度，评价皮肤角化上皮屏障功能的改变。结果组胺刺激可以降低皮肤角化上皮细胞的ＴＥＲ，增加上皮细胞间荧光　素ＦＩＴＣ一葡聚糖（ＦＩＴＣ—Ｄｅｘｔｒａｎ）的通透性，作用曲线呈时间和剂量依赖性，组胺刺激与对照组相比差异具有统计学意义；组胺受体　１（ｈｉｓｔａｍｉｎｅ　１　ｒｅｃｅｐｔｏｒ，Ｈ１Ｒ）拮抗剂可以抑制组胺对ＴＥＲ的降低作用，而ｃａ　载体离子霉素可以诱导类似组胺对ＴＥＲ的降低作　用，差异具有统计学意义。结论本实验提示组胺可以降低人皮肤原代角化上皮细胞的屏障功能，有可能与ＡＤ等慢性皮肤炎　性疾病的发病机制有关，并有可能为临床治疗提供选择依据。　【关键词】组胺；皮肤角化上皮；屏障功能　【中图分类号】Ｒ　７５１　

Ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｈｉｓｔａｍｉｎｅ　ｉｎ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂａｒｒｉｅｒ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ　Ｄｕａｎ　Ｓｕ　，Ｊｉａｏ　Ｊｉａｎ　，Ｚｈａｎｇ　Ｌｕｏ　，　，　（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ａｌｌｅｒｇｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　Ｔｏｎｇｒｅｎ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｃａｐｉｔａｌ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１００００５，Ｃｈｉｎａ；２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌｏｇｙ　Ｈｅａｄ　ａｎｄ　Ｎｅｃｋ　Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ｂｅｉｎｇ　Ｔｏｎｇｒｅｎ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｃａｐｉｔａｌ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１００００５，Ｃｈｉｎａ；３．Ｂｅｉｊｉｎｇ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆＮａｓａｌ　ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｂｅｌｔｉｎｇ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌｏｇｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１００００５，Ｃｈｉｎａ）　

【Ａｂｓｔｒａｃｔ】　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｗｅ　ｔｒｙ　ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｈｉｓｔａｍｉｎｅ　ｉｎ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂａｒｒｉｅｒ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ　ｂｙ　ｔｅｓｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｏｆ　ｔｒａｎｓ—ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ（ＴＥＲ）ａｎｄ　ｐａｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｆｌｕｘ　ｏｆ　ｐｒｉｍａｒｙ　ｈｕｍａｎ　ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ　ｂｙ　ｈｉｓｔａｍｉｎｅ．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｗｅ　ｃｕｈｕｒｅｄ　ｐｒｉｍａｒｙ　ｈｕｍａｎ　ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ　ｆｒｏｍ　ｈｅａｌｔｈｙ　ａｎｄ　ａｔｏｐｉｃ　ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ（ＡＤ）ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｒｅｓｅｎｃｅ　ａｎｄ　ａｂｓｅｎｃｅ　ｏｆ　ｈｉｓｔａｍｉｎｅ，ｈｉｓｔａｍｉｎｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｂｌｏｃｋｅｒ　ｆｏｒ　９６　ｈｏｕｒｓ　ｉｎ　ａｉｒ—ｌｉｑｕｉｄ　ｉｎｔｅｒｆａｃｅ（Ａｕ）ｃｕｌｔｕｒｅ　ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｔｈｅ　ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｂａｒｒｉｅｒ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｅｖａｌｕａｔｅｄ　ｂｙ　ｍｅａｓｕｒｉｎｇ　ＴＥＲ　ａｎｄ　ＦＩＴＣ—Ｄｅｘｔｒａｎ　ｐａｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｆｌｕｘ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｈｉｓｔａｍｉｎｅ　ｄｅｃｒｅａｓｅｄ　ｔｈｅ　ｂａｒｒｉｅｒ　ｉｎｔｅ　ｔｖ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ　ｉｎ　ＡＬＩ　ｃｕｌｔｕｒｅｓ　ｂｙ　ｉｍｐａｉｒｉｎｇ　ＴＥＲ　ｉｎｃｒｅａｓｅ　ａｎｄ　ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ｐａｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｆｌｕｘ　ｔｏ　Ｆｉｔｃ－・Ｄｅｘｔｒａｎ　ｉｎ　ａ　ｄｏｓｅ－・ａｎｄ　ｔｉｍｅ・－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｍａｎｎｅｒ．Ｔｈｅｒｅ　ｗａｓ　ａ　ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｈｉｓｔａｍｉｎｅ　ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ　ｇｒｏｕｐ　ａｎｄ　ａｎ—ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ　ｇｒｏｕｐ．Ｈｉｓｔａｍｉｎｅ　１　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　（Ｈ１Ｒ）ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ　ｃｏｕｌｄ　ｂｌｏｃｋ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｈｉｓｔａｍｉｎｅ　ｔｏ　ＴＥＲ　ａｎｄ　Ｃａ　ｉｏｎｏｐｈｏｒｅ　ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ　ｃｏｕｌｄ　ｉｎｄｕｃｅ　ｔｈｅ　ｓｉｍｉｌａｒ　ｅｆｆｅｃｔ　ｔＯ　ＴＥＲ　ｗｉｔｈ　ｈｉｓｔａｍｉｎｅ　ｗｉｔｈ　ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｏｕｒ　ｆｉｎｄｉｎｇｓ　ｔｈａｔ　ｈｉｓｔａｍｉｎｅ　ｉｍｐａｉｒｓ　ｈｕｍａｎ　ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ　ｂａｒｒｉｅｒ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｍｉｇｈｔ　ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｏｆ　ｃｈｒｏｎｉｃ　ｓｋｉｎ　ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ　ｄｉｓｅａｓｅｓ　ｓｕｃｈ　ａｓ　ＡＤ　ａｎｄ　ｍｉｇｈｔ　ｉｎｄｉｃａｔｅ　ａ　ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｙ　ｆｏｒ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　

ｓｔｒａｔｅｇｙ．　【Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ】ｈｉｓｔａｍｉｎｅ；ｓｋｉｎ　ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ；ｂａｒｒｉｅｒ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　

特异性皮炎（ａｔｏｐｉｃ　ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ，ＡＤ）是一种以皮肤　干燥、瘙痒和炎性反应为主要特征的慢性、复发性皮　肤炎性疾病。其发病机制尚不明确，与环境、遗传和　免疫等多因素有关。尽管特异性（ａｔｏｐｙ）是ＡＤ的重　要诱发因素之一，但局部组织的易感性对ＡＤ的发病　也起着关键的作用。在ＡＤ的发病机制中，作为机体　

基金项目：科技部“十二五”国家科技支撑计划课题（２０１４ＢＡ１０７Ｂ０４），教育部创新团队发展计划（ＩＲＴ１３０８２），北京市自然科学基金（７１３１００６），北　京市医管局重点医学专业发展计划（ＺＹＬＸ２０１３１０）。Ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ　ｗａｓ　ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ　ｂｙ　Ｔｈｅ　１２ｔｈ　Ｆｉｖｅ－ｙｅａｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｓｕｐｐｏｒｔ　Ｐｒｏｊｅｃｔ　（２０１４ＢＡ１０７Ｂ０４），ｔｈｅ　Ｐｒｏｇｒａｍ　ｆｏｒ　Ｃｈａｎｇｊｉａｎｇ　Ｓｃｈｏｌａ￣ａｎｄ　Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｔｅａｍ（ＩＲＴ１３０８２），Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｂｅｉｊｉｎｇ　（７１３１００６），Ｂｅｉｊｉｎｇ　Ｍｕｎｉｃｉｐａｌ　Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｈｏｓｐｉｔａｌｓ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｓｐｅｃｉａｌ　Ｆｕｎｄｉｎｇ　Ｓｕｐｐｏｒｔ（ＺＹＬＸ２０１３１０）．　Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ａｕｔｈｏｒ，Ｅ—ｍａｉｌ：ｄｒ．１ｕｏｚｈａｎｇ＠１３９．ｃｏｍ　网络出版时间：２０１５—０７—１６　２２：５０网络出版地址：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／１１．３６６２．ｒ．２０１５０７１６．２２５０．０２０．ｈｔｍｌ　第４期　段鞋等：组胺对皮肤角化上皮屏障功能的作用的研究　６０５　与外界环境相互作用的第一天然要素，皮肤屏障发挥　重要的调节作用。皮肤屏障的损害可能是ＡＤ发生　的首要机制。　在皮肤屏障中，角化细胞在抵御外界刺激、微生　物病原及过敏原的侵人中起着关键作用…。皮肤角　化细胞的病理性损害与诸如ＡＤ、湿疹和荨麻疹等皮　肤炎性疾病有关　。近来有研究＿４刮表明，一些促炎　因子，如肿瘤坏死因子一仅，白细胞介素－３、３１等，能调　节角化细胞功能和分化相关蛋白，进而破坏其屏障功　能。ＡＤ患者受损和非受损皮肤中可以检测到较高浓　度的组胺，而组胺在其中的作用仍不十分清楚。　组胺是一种非常常见的炎性反应介质，既能介导　急性过敏性反应，在慢性炎性反应和调节免疫方面也　起着重要的作用　ｊ。在慢性炎性反应中，组胺通过与　其四型受体Ｈ１Ｒ（ｈｉｓｔａｍｉｎｅ　１　ｒｅｃｅｐｔｏｒ），Ｈ２Ｒ，Ｈ３Ｒ，　Ｈ４Ｒ结合，选择性地趋化炎性反应效应细胞向局部组　织聚集，并影响其成熟、活化、极化等，进而诱导和调　节炎性反应　Ｊ。肥大细胞和嗜碱性粒细胞是组胺的　主要来源，肥大细胞和嗜碱性粒细胞（尤其是肥大细　胞）又是慢性皮肤炎性疾病发病过程中的重要效应细　胞　Ｊ。有研究¨。。表明，内源性组胺对角化细胞的成　熟有调节作用。　为了研究慢性皮肤炎性疾病的发病机制之一是　否有可能是组胺作用于皮肤角化上皮细胞、破坏其屏　障功能，本实验应用体外气．液细胞培养技术（ａｉｒ－１ｉｑ．　ｕｉｄ　ｉｎｔｅｒｆａｃｅ，ＡＬＩ），培养正常人和ＡＤ患者原代角化　上皮细胞，应用组胺及其受体拮抗剂等为刺激因素，　检测角化上皮细胞跨膜阻力（ｔｒａｎｓ．ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｒｅｓｉｓｔ．　ａｎｃｅ，ＴＥＲ）、细胞问通透性，研究组胺对皮肤角化上皮　细胞屏障功能的影响。　１研究对象和方法　１．１研究对象　健康人和ＡＤ患者皮肤原代角化上皮细胞均购　自ＬＯＮＺＡ公司（瑞士）。　１．２细胞培养　采用Ａｕ细胞培养技术。人皮肤角化上皮细胞　在Ｔ型培养瓶培养，３７　ｏＣ，９５％相对湿度，５％ＣＯ　培　养箱孵育；待上皮细胞扩增到瓶底面积的８０％一９０％　时，接种入双层细胞培养皿（ｔｒａｎｓ．ｗｅｌｌ　ｃｅｌｌ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｐｌａｔｅ，美国Ｃｏｍｉｎｇ公司）开始ＡＵ细胞培养，当细胞　生长铺满上层膜时，吸出上层培养液，继续培养；监测　ＴＥＲ，当ＴＥＲ值＞１　０００　Ｑ，可行后续实验。　１．３　ＴＥＲ检测　应用ＴＥＲ检测仪（Ｍｉｌｌｌｉｃｅｌｌ—ＥＲＳ，美国Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　公司）测量。加ＡＬＩ细胞培养液于培养皿上层内，　３７℃培养箱孵育５　ｍｉｎ；将长、短臂电极分别置入培　养皿下层和上层，读取稳定ＴＥＲ数值；测量结束后，　吸出上层培养液，继续在ＣＯ　培养箱中培养。　１．４荧光标记物细胞间通过强度检测　加荧光标记物ＦＩＴＣ．Ｄｅｘｔｒａｎ（相对分子质量４　０００）于培养皿上层内，培养箱孵育２４　ｈ；取下层培养　液，酶标仪（ＥＬＩＳＡ　ｒｅａｄｅｒ　Ｍｉｔｈｒａｓ　ＬＢ９４０，德国Ｂｅｒｔｈｏｌｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ公司）检测ＦＩＴＣ．Ｄｅｘｔｒａｎ的荧光强度　（４８０　ｒｉｍ）。　１．５统计学方法　实验数据用Ｐｒｉｓｍ　Ｖｅｒｓｉｏｎ　５软件进行分析，以均　数±标准误（露±阳）表示，数据分析应用Ｔｗｏ．ｗａｙ　ＡＮＯ—　ＶＡ检验及Ｗｉｌｃｏｘｏｎ秩和检验，以Ｐ＜Ｏ．０５为差异有　统计学意义。