综合性实验1酵母蔗糖酶的分离纯化

综合性实验1酵母蔗糖酶的分离纯化

（一）实验目的

学习酵母蔗糖酶的提取和纯化方法，掌握各步骤的实验原理，并为后续实验提供一定量的蔗糖酶。

（二）实验原理

酶是生物体内具有催化活性的物质，在人类生产生活和生命过程中起着非常重要的作用。

因此，酶学相关研究始终是生物学的重大课题。酶的分离提纯是为了提高纯度（或比活力）及收率可据酶蛋白的结构和性质来选择分离提纯方法进行分离，同时用测定酶活力的方法了解酶的去向、衡量酶提纯的程度和得率。

蔗糖酶（Sucrase,EC3.2.1.26）又称转化酶，属于水解酶类，催化蔗糖分解成D-葡萄糖和D-果糖，是一种广泛存在于自然界中的糖苷酶[1]。目前蔗糖酶已在农产品加工业[2]、食品工业[3-4]、医药行业[5-6]中发挥重要作用。工业上一般从酵母中提取蔗糖酶[7]。

蔗糖酶在酵母细胞中存在着两种形式：存在于细胞壁中的高度糖基化的外蔗糖酶和细胞质中的低糖基化的内蔗糖酶。外蔗糖酶活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50%（质量分数）糖成分的糖蛋白，该酶是蔗糖酶的主要形式。本实验提取纯化的主要是外蔗糖酶。

酵母细胞的破壁方法主要有研磨法、酶解法、反复冻融法、超声波破碎法等[8]。

酶解法耗时长、费用高，机械研磨法操作复杂、损耗大等[9]。

超声波破碎法具有空化效应，产生机械剪切压力使细胞破碎，耗时短、费用低，损耗小。本实验采用超声波破碎法破碎酵母细胞。

（三）实验仪器、材料及试剂

1.仪器

（1）美国SONICSVCX 750型超声波细胞破碎仪、Eppendorf多功能台式离心机5804R、恒温水浴箱、-20℃冰箱、电子天平、制冰机

（2）离心管（2ml、1.5ml、50ml）、移液器、滴管、50ml量筒、50ml烧杯、玻璃棒

2.材料及试剂

（1）活性酵母粉（市售安琪酵母粉）

（2）0.2mol/L乙酸钠-乙酸缓冲溶液（pH5.0）

（3）95%乙醇（预冷-20℃）

（四）操作步骤

1.超声波法破碎酵母细胞

（1）称取10g干酵母粉，放入冰预冷的50ml烧杯中，再加入30ml冰预冷的

0.2mol/L乙酸钠-乙酸缓冲溶液，用玻璃棒搅拌均匀成糊状液体。

（2）酿酒酵母超声破碎条件为:额定功率750W、振幅设置为20%，总工作时间10min、工作时间/间歇时间15s/25s（总耗时约27min）。

（3）将细胞破碎液平均分到2个50ml离心管中，配平后，4℃，

9000rpm，离心10min。

（4）将上清液倒入50ml的量筒，量出总体积V。

（5）每组取1ml上清液至2ml离心管中，体积VⅠ（标记为粗酶液Ⅰ，

VⅠ=2ml）。

（6）每组另取20μl粗酶液Ⅰ放入1.5ml离心管中（标记为粗酶液Ⅰ），置冰上保存，用于测定酶活力及蛋白含量。

2.热处理

（7）将1ml粗酶液Ⅰ迅速地放入50℃恒温水浴中，温育20min，期间每隔约4min温和混匀一次。

（8）取出离心管，迅速置冰浴冷却5min，4℃，10000rpm，离心10min。

（9）将上清液转入新的2ml离心管中，用移液器量出体积VⅡ，标记为粗酶液Ⅱ。

（10）取出20μl放入1.5ml离心管中（标记为粗酶液Ⅱ），置冰上保存，用于测定酶活力及蛋白含量。

3.乙醇沉淀

（11）向剩余（VⅡ-20μl）粗酶液Ⅱ中，逐滴缓慢加入等体积（VⅡ-

200μl），-20℃预冷的95%乙醇，整个过程约10min。

（12）配平后，4℃，10000 rpm离心10min，吸弃上清。

（13）用1ml冰预冷的0.2mol/L乙酸钠-乙酸缓冲溶液充分溶解离心管中的沉淀5min，标记为粗酶液Ⅲ（VⅢ=1ml），置冰上保存用于测定酶活力及蛋白含量。

（五）实验结果

记录实验各组分体积：V=待测VⅠ=1ml VⅡ=待测VⅢ= 1ml 若有异常现象出现，可进行分析讨论。（六）注意事项

1.超声波破碎过程产生大量热，整个过程要冰浴进行。

2.乙醇沉淀时，边搅拌边逐滴滴加乙醇。

3.乙醇沉淀时，可将沉淀放入冰箱中-20℃下保存备用。