近红外光谱分析技术用于血浆中万古霉素浓度检测的可行性研究

药物生物技术　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２０１６，２３（６）：５０３～５０７　５０３　

近红外光谱分析技术用于血浆中万古霉素浓度检测的可行性研究　赵　洁　，臧恒昌　，姜笃银　（１．山东大学第二医院急诊科，山东济南２５００３３；２．山东大学药学院，山东济南２５００１２）　摘要为了探讨近红外光谱分析技术作为快速分析技术应用于检测万古霉素血药浓度的可行性，配制浓　度梯度在２—９８　Ｉｘ＃ｍＬ的万古霉素绵羊血浆样品，采用透射模式采集样品在１０　０００～４　０００　ｃｍ　的透射光谱。利　用Ｋ．Ｓ方法将样品集划分为校正集和验证集，通过预处理方法的优化选择最优的光谱预处理方法，建立万古霉素　血药浓度分析模型并对模型进行评价。利用一阶导数Ｎｏｒｒｉｓ平滑对光谱进行预处理后建立的ＰＬＳ模型，模型的　ＲＭＳＥＰ＝３．１８２　ｓ／ｍＬ，Ｒ　＝０．９９３　９，ＲＰＤ＝８．６，可用于血浆中万古霉素的定量分析。近红外光谱分析技术用于　血浆中万古霉素浓度具有很高的准确性，可用于体外血浆样品中万古霉素浓度的检测。　关键词近红外光谱；万古霉素；血药浓度；定量分析；无创检测；偏最小二乘法　中图分类号０６５７．３３　文献标志码Ａ　文章编号１００５—８９１５（２０１６）０６—０５０３—０５　

万古霉素属于糖肽类抗生素，临床主要用于革兰阳性　菌特别是敏感肠球菌和耐甲氧西林的葡萄球菌属（Ｍｅｔｈｉ—　ｃｉｌｌｉｎ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ，ＭＲＳＡ）所致的严重感　染。其不良反应主要有耳、肾毒性、静脉滴注相关性不良反　应以及血液系统毒性…。鉴于万古霉素治疗指数窄、个体　差异大、影响因素多，监测其血药浓度以结合临床实施个体　化给药显得极其重要。目前国内外相关用药指南已对万古　霉素的临床应用进行了具体推荐　，其中血浆药物浓度监　测具有重要的临床治疗意义。　目前，常用的血浆药物溶度监测方法主要有高效液相　色谱法（Ｈｉｇｈ　ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＨＰＬＣ）和液　相色谱法－质谱联用法（Ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ—ｍａｓｓ　ｓｐｅｃ—　ｔｒｏｍｅｔｒｙ，ＬＣ　Ｍｓ）　Ｊ。用于测定万古霉素血药浓度的方法　主要有免疫酶标记法和高效液相色谱法　。　。其中，免疫　酶标记法主要包括酶放大免疫测定法（Ｅｎｚｙｍｅ　Ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ＥＭＩＴ）、荧光偏振免疫分析法（Ｆｌｕｏ—　ｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ＦＰＩＡ）和放射免疫分析　（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ＲＩＡ），因其检测的简便快捷，在临床上　广泛用于万古霉素血药浓度监测，但这几种方法各有其应　用的局限性，例如因血液成分比较复杂，个体差异对结果　的准确性影响较大，另ＥＭＩＴ法在万古霉素血药浓度大于　３０　Ｉｘｇ，＂ｍＬ时检测准确性较低，ＲＩＡ法则需要使用放射性　试剂，危害健康…　。ＨＰＬＣ法检测的准确性较高，但样品　处理方法繁琐且检测时间相对较长。因此，寻找一种快捷　准确的万古霉素血药浓度测定方法具有十分重要的临床　意义。　近红外光谱分析技术（Ｎｅａｒ　Ｉｎｆｒａｒｅｄ　Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）是一　种无损、便携、可以实现实时分析的快速分析技术。近红外　光是指７８０—２　５２６　ｎｍ之间的电磁波，近红外光谱主要反映　的是Ｃ—Ｈ、Ｎ—Ｈ、０一Ｈ等含氢基团的倍频和合频吸收。近红　外光谱分析技术作为一种快速分析技术近年来开始广泛应　用于医药领域的分析。在医学领域中利用近红外光谱分析　技术对体脂含量进行预测”　，对人体的血糖含量进行监测　以及人的脑血氧监测中　１３－１４］。在药物领域中可以利用近红　外光谱实现对中药的产地和种属鉴别　，对药物含量的快　速检测　，以及对药品生产过程中的快速监测　１７－１ｓ］。但是　通过利用近红外光谱分析技术实现万古霉素血药浓度快速　检测的研究尚未有报道。因此，本研究以绵羊血浆为研究　对象，对近红外光谱应用于人血浆万古霉素浓度检测的可　行性进行研究，以期为万古霉素的临床监测提供快速分析　方法。　

１材料与方法　１．１材料　１．１．１　实验材料绵羊血浆（东营爱博生物制品有限公　司，批号：２０１２１００９），万古霉素（中国药品生物制品检定所，　批号：１３０３６０—２００３０１）。　１．１．２主要仪器设备Ａｎｔａｒｉｓ　Ｉ１傅里叶变换近红外光谱　仪（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ公司），附件配置：透射模块，捆镓砷　（ＩｎＧａＡｓ）检测器，分析天平（Ｍｅｔｔｌｅｒ　Ｔｏｌｅｄｏ公司），移液器　（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司）。ＲＥＳＵＬＴ近红外光谱采集软件，ＴＱ　Ａｎａｌｙｓｔ光谱分析软件；Ｍａｔｌａｂ分析软件（Ｍａｔｌａｂ　２０１５ｂ，　

收稿日期：２０１６—０７－０１　修回１３期：２０１６－１０－２８　作者简介：赵洁（１９８７一），女，山东潍坊人，外科学博士研究生，主要从事烧伤整形研究。Ｅ—ｍａｉｌ：ｚｊ－０１４＠ｑｑ．ｃｏｍ。　通讯作者：姜笃银（１９６３一），男，博士后，主任医师，博士研究生导师，主要从事烧伤整形、创面修复等研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｊｄｙｂｓ２＠ｖｉｐ．１６３．ｃｏｒｎ。　５０４　药物生物技术　第２３卷第６期　Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ公司）电脑（美国苹果公司）。６　ｍｍ的采样小管　（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ公司）。　１．２实验方法　１．２．１　绵羊血浆样品的制备　以２　ｍＬ为梯度配制浓　度为２—９８　Ｉｘｇ／ｍＬ的万古霉素绵羊血浆样品共４７份。　１．２．２近红外光谱的采集利用６　ｍｍ的样品管装载样品，　采集样品的透射光谱，光谱扫描范围１０　０００～４　０００　ｃｍ～，扫　描次数为３２次，分辨率为４　ａｍ～，扫描的背景为空气，每　３０　ｍｉｎ校正一次背景，环境温度为（２０　４－３）ｏＣ，相对湿度为　（４５　４－５）％。测量时间小于１　ｍｉｎ。　１．２．３校正集和样品的划分利用Ｋ　Ｓ方法　ｔ４］将样品集　

划分为校正集和验证集，均匀的选择３Ｏ个样品作为校正　集，１７个样品作为验证集。其中Ｋ—Ｓ的选择方法如下：　ａ）计算所有光谱之问的欧氏距离，计算公式如下：　ｄ　（Ｐ，ｑ）＝√∑　：。【　（　）一　（　）】　Ｐ，ｑ∈［１，Ｎ］　（１）　式中ｄ　（Ｐ，ｑ）为样品Ｐ与ｑ之间的欧式距离，　。（　）为　样品Ｐ在　波数下的吸光度值，　（　）为样品ｑ在　波数下的　吸光度值，Ⅳ为样品数，＿，为样品光谱的波数。　ｂ）根据公式（１），选出距离最大的一对样品（Ｐ．，ｑ　）。　Ｃ）计算剩余样品与ｂ）中选择的样品之间的距离，选择　剩余各个样品的最小距离组成矩阵，然后选择矩阵中最大　距离样品作为第三个样品。　ｄ）重复步骤Ｃ），直到选择出相应的校正集样品。　１．２．４预处理方法的选择由于本研究针对的样品为血　药样品，其含水量比较高，因此在进行预处理方法的选择之　前，舍弃吸光度在１．５以上的波段，以消除水等高吸光度的　影响。同时光谱会存在基线漂移、噪音等问题，因此需要对　光谱进行校正。因此本研究在此基础上考察一阶导数、二　阶导数、Ｓ－Ｇ平滑和Ｎｏｒｒｉｓ平滑等预处理方法的组合对建模　效果的影响，从中选择最优的预处理方法组合。　１．２．５模型的建立与评价采用偏最ｚｂ￣－乘（Ｐａｒｔｉａｌｌｅａｓｔ　ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ，ＰＬＳ）的方法建立ＰＬＳ模型，并对模型的性能进行　评价。模型评价的主要参数有相关系数Ｒ，相关系数包括　校正集相关系数Ｒ　，验证集相关系数　以及交叉验证相关　系数Ｒ　校正集均方根误差（Ｒｏｏｔ—ｍｅａｎ—ｓｑｕａｒｅｓ　ｅｒｒｏｒ　ｏｆ　ｃａｌｉｄａｔｉｏｎ，ＲＭＳＥＣ），ＲＭＳＥＣ用来评价建立的模型本身的预　测能力。交互验证均方根误差（Ｒｏｏｔ．ｍｅａｎ—ｓｑｕａｒｅｓ　ｅｒｒｏｒ　ｏｆ　ｃｒｏｓｓ—ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ，ＲＭＳＥＣＶ），ＲＭＳＥＣＶ用来选择最佳的主成　分数，本研究中选择ＲＭＳＥＣＶ值最低时对应的主成分数建　立ＰＬＳ模型。预测均方根误差（Ｒｏｏｔ．ｍｅａｎ—ｓｑｕａｒｅｓ　ｅｒｒｏｒ　ｏｆ　ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ，ＲＭＳＥＰ），ＲＭＳＥＰ主要用来评价建立的ＰＬＳ模型　的预测能力。各参数的计算方法如下：　

一　Ｙｉ　∑（　一　）　

Ｒ岘ｃｖ：√　㈩　Ｒ舰Ｐ：√　㈩　ＲＰＤ：　（５）　，／ｚ（　一　）２／ｐ　一　

公式（２）、（３）、（４）、（５）中：　一传统分析技术得到的参考值；　一　的均值；　一　利用近红外分析得到的预测值；ｎ～建模样品数；ｍ一主成　分数；ｐ一验证集样品数；　．一交叉验证得到的预测值；ｙ＿一　验证集样品的参考值平均值；　一验证集得到的预测值。　

２结果　２．１　参考值样品的分布及近红外光谱解释　采用溶血法测定４７个样品的Ｉｃ…采用Ｋ—ｓ方法将样　品分为校正集和验证集。校正集和验证集的样品的统计结　果如表１所示。由表１可知校正集的浓度范围覆盖了验证　集的浓度范围。样品的校正集和验证集的平均值和标准偏　差也比较接近，也证明了样品的分布合理。万古霉素血浆　样品的原始近红外光谱图如图１所示。由图１可知，在　７　０００～６　５００　ｃｍ　以及５　４００—４　０００　ｅｍ　波数附近的波段　的吸光度都已经大于２，当样品的吸光度大于１．５时，光谱　的线性关系并不明显。因此本研究选择将吸光度大于１．５　的波段去掉，然后再建立分析模型。原始光谱主要反映的　是样品ｃ—Ｈ、Ｏ—Ｈ等含氢基团的倍频和合频吸收，表现在光　谱上为宽的谱带，分辨率不高。因此，需要对光谱进行预　处理。　

Ｔａｂ】　Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ　ｓｅｔ　ａｎｄ　ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ　ｓｅｔ　ｏｆ　ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ　ｓａｍｐｌｅｓ　

ｎ：Ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ　ｓａｍｐｌｅｓ：ＳＤ：Ｓｔａｎｄａｒｄ　ｄｅｖｉａｔｉｏｎ　

（２）　Ｆｉｇ　１　０ｒｉｇｉｎａｌ　ｎｅａｒ　ｉｎｆｌｒａｒｅｄ　ｓｐｅｃｔｒａ　ｏｆ　４７　ｓａｍｐ１ｅｓ