DNA改组
DNA重组和转座
第一节 DNA重组（recombination）一）、DNA重组1、概念：是指由于不同DNA链的断裂和连接而产生的DNA片段的交换和重新组合，形成新的DNA分子的过程。
2、意义：重组是遗传学的灵魂，没有重组就没有生物的进化；没有重组也就没有现代的分子克隆技术二）、DNA重组的类型1、同源重组（Homologous Recombination）2、位点特异性重组（Site-specific Recombination）3、DNA的转座（transposition）同源重组一、概述1、定义：两个DNA分子同源序列之间进行的重组2、条件：（1）两个DNA分子有同源序列（相关的酶可以用任何一对同源序列为底物）（2）两个DNA分子必须紧密接触3、发生：真核生物: 非姐妹染色单体交换相对应的区域。
原核生物: 依赖recA蛋白，并形成 Holliday 结构Holiday模型（1964年）二、大肠杆菌同源重组的分子基础（一）RecA1、作用：可促进单链同化或单链吸收RecA具有使DNA单链置换双链中同源链的能力2、单链同化发生的三个条件（1）其中一个DNA必须存在单链区（2）其中一个DNA必须有一个自由3’末端（3）此单链区和3’末端必须位于两分子之间互补的区域内（二）RecBCD复合体1、酶的活性：（1）核酸酶（2）解旋酶（3）ATPase2、作用：在CHi位点处产生含3`游离末端单链。
（三）CHi位点——RecBCD识别的靶位点5`GCTGGTGG3`3`CGACCACC5`是重组频率较高的部位E.coli每隔约5~10kb有一个拷贝，Holliday 结构的形成：1. 同源序列排列在一起；2. 酶切。
通过核酸酶和RecBCD蛋白复合体的作用在一对同源DNA上产生切口；3.入侵。
含有3’端切口的ssDNA被recA蛋白包裹形成recA蛋白-ssDNA细丝；RecA-ssDNA细丝寻找相对的DNA双螺旋上的相应序列。
重组DNA技术的发展与应用
重组DNA技术的发展与应用DNA是生命的基础物质，是组成细胞和基因的重要成分。
DNA重组技术，即重组DNA技术，是一种利用人工手段操作和改变生物DNA序列的技术。
它在现代生物科技中很重要，可以用于生物制药、基因工程、遗传工程、育种改良等方面。
本文将从重组DNA技术的起源和发展入手，探讨其目前已有的应用和未来的发展趋势。
一、起源与发展重组DNA技术的发展起源于20世纪60年代，当时研究人员通过技术手段将细菌DNA序列进行了改变。
50年来，这项技术得到了极大的发展。
最早的技术是将外源DNA片段与细胞质体融合，产生了质粒；接着，科学家又发现了限制性内切酶、DNA连接酶等，这些工具让重组DNA技术更加完善；再之后，PCR技术的发明，更让重组DNA技术的上限大大扩大。
以上种种，皆为了更精准多样的重组DNA，进而具有更多应用价值。
二、重组DNA技术的应用1、生物制药生物制药即以重组DNA技术为基础，通过改变人类基因序列，来创造新型药物。
这些以基因重组为基础的药物早在20世纪90年代就已经投入市场了。
例如，利用重组DNA技术，人类可以利用大肠杆菌细胞表达重组蛋白，来生产人类生长激素、抗体等药物，用于治疗糖尿病、失明、免疫系统疾病等多种疾病。
这些以基因重组为基础的药物，不仅疗效更加明显，而且相对更加安全。
2、基因工程基因工程常用于为目标生物植入外源DNA片段，进而改变其形态、特性、乃至其运作方式。
常见的应用包括：将人类荧光基因植入白地鼠的基因中，从而使其身体部位（例如耳朵、尾巴）发出绿色荧光；将水稻植入Bt基因，让其长成可以自我保护的Bt水稻。
3、遗传工程遗传工程是通过重组DNA技术改变生物个体遗传信息，达到对目标个体进行改进或优化的一种工程技术。
常见的应用包括：将鱼的基因植入番茄中，从而让其耐旱、耐盐、耐寒，更加适应恶劣环境；将鸡（或其他鸟类）的生长因子基因注入到其他家禽中，从而让其生长速度加快。
4、育种改良重组DNA技术还广泛应用于动植物育种改良方面，重组DNA技术能够提高育种效率，降低育种成本。
简述重组 dna 技术的原理、操作方法及应用。
简述重组 dna 技术的原理、操作方法及应用。
重组DNA技术是一种基因工程技术，通过改变DNA序列来创建新的DNA序列或改变现有DNA序列。
它可以用于插入外源基因、删除或替换特定基因、改变基因的表达水平等。
重组DNA技术的基本原理是利用酶切和连接作用来剪切和连接DNA分子。
首先，通过特定的限制性内切酶将DNA分子切割成特定的片段。
然后，通过DNA连接酶将所需的DNA 片段连接起来，形成重组DNA。
最后，将重组DNA导入宿主细胞中，使其在宿主细胞中复制和表达。
操作方法包括以下几个步骤：1. 提取目标DNA：从源细胞或组织中提取目标DNA，可通过酸性条件、酶处理和离心等方法获得。
2. DNA片段的切割：使用限制性内切酶选择性地切割目标DNA和外源DNA，生成互补的黏性末端或平滑末端。
3. DNA片段的连接：通过DNA连接酶将切割的DNA片段连接起来，形成重组DNA。
4. 重组DNA的导入：将重组DNA导入宿主细胞，常用的方法有转化、病毒转染等。
5. 重组DNA的复制和表达：在宿主细胞中，重组DNA可以经过复制和转录/翻译过程，产生相应的蛋白质。
重组DNA技术的应用十分广泛，包括：1. 生产重组蛋白质：通过插入外源基因，改变宿主细胞的代谢途径，使其表达目标蛋白质，用于药物生产、工业生产等。
2. 基因治疗：将健康的基因插入患者的细胞中，用于治疗遗传性疾病等。
3. 基因敲除和敲入：通过重组DNA技术，在宿主细胞中删除或替换特定基因，研究基因功能和相关疾病的发生机制。
4. 基因工程作物：通过插入外源基因，改变植物的性状，使其具有抗虫、抗病、抗逆境等特性。
5. DNA检测和诊断：包括PCR扩增、基因测序、基因突变检测等，用于疾病诊断、亲子鉴定、犯罪学等领域。
总之，重组DNA技术的原理是通过酶切和连接作用来改变DNA序列，操作方法包括提取DNA、切割DNA片段、连接DNA片段、导入宿主细胞并实现复制和表达。
其应用领域广泛，包括蛋白质生产、基因治疗、基因工程作物等。
重组dna技术名词解释
重组dna技术名词解释重组DNA技术是一种基因工程技术，也称为基因重组技术或基因工程技术。
它是通过将不同来源的DNA片段进行拆解、重组和重新组装，从而实现对基因组的改造和修饰。
这项技术的出现和发展，为人类研究基因功能、疾病治疗、生物制药、作物改良等领域带来了巨大的变革和突破。
重组DNA技术包括以下几个重要步骤和相关名词：1. DNA提取：从生物体组织或细胞中获得DNA的过程。
可以利用化学方法或机械方法来提取DNA。
2. DNA片段：在重组DNA技术中，DNA通常被切割成较小的片段，以便进行进一步的操作。
这些片段通常由限制性内切酶所切割，生成具有特定序列的片段。
3. PCR：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction），是一种在体外扩增DNA序列的方法。
通过选择性提取DNA片段并在合适的条件下进行一系列循环的核酸扩增过程，可以快速地扩增DNA片段。
4. 限制性内切酶：一类能够识别特定DNA序列并在酶切位点上切割DNA的酶。
它们广泛应用于重组DNA技术中，用于切割DNA分子，生成具有限制性内切酶切位点的片段。
5. DNA连接酶：是一类酶，能够通过酶的相关活性将两个DNA分子连接起来，形成一个新的DNA分子。
在重组DNA技术中，DNA连接酶通常与DNA片段一起使用，实现DNA 的重组和重新组装。
6. 基因库：基因库是指以DNA分子形式保留的大量基因信息的储存体系。
它可以是基于细菌或质粒的载体系统，也可以是基于大规模的DNA文库系统。
利用基因库，可以对基因进行检索、扩增和分析。
7. 遗传工程：利用重组DNA技术对生物体进行基因操作，使其获得新的特性或表达更多的有益蛋白质。
遗传工程可以用于农业、医学和工业等领域，以实现对生物体的有目的的改造和利用。
8. 基因敲除：一种通过重组DNA技术将目标基因删除或失活的方法。
通过敲除特定的基因，可以研究和验证其功能，进而深入理解这些基因在生物体中的作用。
DNA重组(DNA recombination)技术：DNA重组与鉴定-1
DNA重组（DNA recombination）技术：DNA重组与鉴定-1重组DNA是在体外用限制性内切酶，将不同来源的DNA分子进行特异地切割，获得的目的基因或DNA片段与载体重新连接，从而组成一个新的DNA杂合分子。
重组的DNA分子能够通过一定的方式进入相应的宿主细胞，在宿主细胞中进行无性增殖，获得大量的目的基因或DNA片段，此过程称基因克隆。
重组的DNA分子也能够在宿主细胞中进行表达，获得相应的蛋白质的表达。
一、DNA重组重组DNA分子的构建所需的目的基因或DNA片段可来自基因组DNA、cDNA以及人工合成的DNA片段；载体最常用的是质粒、噬菌体及逆转录病毒等；它们在限制性内切酶的作用下，可形成粘性末端或平齐末端，在DNA连接酶的作用下可连接成一个DNA 重组体。
（一）目的DNA片段与载体的连接主要目的是获得某一基因或DNA片段的大量拷贝，有了这些与亲本分子完全相同的分子克隆，就可以深入分析基因的结构与功能，并可达到人为改造细胞及物种个体遗传性状的目的。
DNA克隆的一项关键技术就是DNA重组技术，所谓DNA重组，就是指把外源目的基因“装进”载体过程，即DNA的重新组合。
这种重新组合的DNA叫做重组体，因为是由两种不同来源的DNA组合而成，所以又称异源嵌合DNA。
载体在DNA克隆中是不可缺少的，目的基因片段与之共价连接形成重组体后，才能进入合适的宿主细胞内进行复制和扩增。
作为载体DNA分子，必须具有能够在某些宿主细胞中独立地自我复制和表达能力，这样，外源目的基因装入该载体后，才能在载体的带动下一起复制，达到无性繁殖的目的；载体分子不宜过大，以便于DNA体外操作，同时载体DNA与宿主核酸应容易分开，便于提纯；载体上应具有两个以上的容易检测的遗传标记，以区分阳性重组分子和阴性重组分子。
选择性标记包括抗药性基因、酶基因、营养缺陷型及形成嗜菌斑的能力等；载体应该具有多个限制性内切酶的单一切点，以便从中选出一种酶，使它在目的基因上没有切点，保持目的基因的完整性。
dna重组技术名词解释
dna重组技术名词解释
DNA重组技术是指通过将不同来源的DNA分子进行拼接、融合或交换,创造出新的基因或基因组的过程。
以下是与该标题相关的一些名词解释:
1. 重组DNA:指从不同来源的DNA分子中获取的DNA片段,这些DNA片段可以来自于同一物种的不同细胞、不同组织或不同来源。
2. 基因重组:指在基因组中发生的基因组合或序列替换,导致新的基因产生或改变生物的性状。
3. 基因编辑:指使用CRISPR等技术手段,对基因进行精确地剪切、删除、替换等操作,以调节或改变生物的性状。
4. 基因组重组:指不同物种之间的基因组重组,可能导致新物种的产生。
5. 非同源重组:指重组DNA中不同的DNA片段之间的非同源性结合,这种结合可能会导致新的基因产生或改变生物的性状。
6. 同源重组:指两个DNA分子中的相同序列之间的结合,这种结合通常不会导致新的基因产生或改变生物的性状。
7. 基因表达:指DNA信息被转化为蛋白质信息的过程,是生物学中非常重要的一个过程。
8. 基因敲除:指通过基因工程技术,去除目标基因的表达,以达到特定目的的过程。
9. 基因修饰:指对目标基因进行修饰,以改变其表达水平、稳定性或活性等特性。
10. 基因转移:指将从父或母物种中获得的DNA片段转移至另一个物种中的过程,通常用于改良植物、动物或微生物的遗传特性。
DNA重组技术在生物学、医学、工程学等领域都有广泛的应用,例如基因编辑、基因敲除、基因修饰、基因转移等。
这些技术的应用可以帮助人们更好地理解生命的基本原理,探究生命的奥秘,推动人类健康和社会进步。
DNA的重组
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大肠杆菌重组的分子基础
• 在分子水平上，重组事件发生的先后顺序是相似
• 同源性重组最主要特征是相关的酶可以利用任 何一对同源序列为底物。
9
• 真核生物减数分裂时的染色体之间的交换， 某些低等真核生物及细菌的转化、转导、 接合，噬菌体的整合等都属于同源性重组 这一类型。 • 在整个基因组中，同源重组的频率并不恒 定，并且跟染色体的结构有关。例如在异 染色体附近遗传物质的交换要受到抑制。
单链的断裂，从而引发重组。
• 两个断裂单链的游离端彼此交换，形成两个异源
双链，然后末端连接形成Holliday连接体
（Holliday Junction）。
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• 一旦Holliday连接体形成后，它能进行重排从 而改变链的彼此关系。这种重排称为异构化， 因为在此过程中没有键的割裂。 • 一旦形成Holliday连接体后，就能被拆分。是
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DNA重组能迅速增加群体的遗传多样 性，通过优化组合积累有利突变，推动生 物进化。此外，DNA重组还参与DNA损伤
修复，某些基因表达的调控等重要的生物
学过程。
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根据不同的机制，可将重组分成4类：
• 同源性重组（homologous recombination）
• 位点特异性重组（site-specific recombination） • 异常重组（illegitimate recombination) • 转座重组（transposition recombination）
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• D环在DNA聚合酶的作用下修补而扩展，直至D
DNA重组及重组DNA技术解读
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
GCCTAG+
GATCC G
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22
目录
➢ 分类：酶的组成、所需因子及裂解DNA的方 式 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技术中常用Ⅱ型）
➢ 作用：
与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰 系统，限制外源DNA，保护自身DNA。
限制酶切目的基因与载体
接
拼接重组体
转
转入受体细胞
筛
筛选重组体
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35
目录
（一）目的基因的获取
1. 化学合成法 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产 物的 聚合酶链反应(polymerase chain reaction,
第二十一章
DNA重组和重组DNA技术
DNA Recombination and Recombinant DNA technology
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1
目录
广义上， 任何造成基因型变化的基因交流过程
DNA重组（DNA recombination）是指不 同DNA分子断裂和连接而产生DNA片段 的交换并重新组合形成新DNA分子的过程。
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目录
➢DNA克隆
应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗 传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、 天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具 有 自 我 复 制 能 力 的 DNA 分 子 —— 复 制 子 (replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛 选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增 提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或 重组DNA (recombinant DNA) 。
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DNA改组及其研究进展周思(生工1101班201124340105)摘要：自1994年首次提出至今，DNA改组已经成为定向进化最为有效的方法之一。
无论DNA、蛋白质还是生物体的进化，DNA改组都有十分突出的表现。
ＤＮＡ改组技术已在新药物等领域取得了广泛的应用，极大地推动了现代生物科学和生物技术的发展。
该技术同计算机强大的数据分析系统相结合，将会为后基因组学的发展提供强有力的技术平台。
通过对十余年来DNA改组的发展作以简要综述，为日后相关研究的开展提供理论基础。
关键词：DNA改组，定向进化，基因家族DNA shuffling and its research progressZHOU Si(Bioengineering Class 201101, 201124340105)Abstract: DNA shuffling has been one of the most effective directed evolution methods since reported in 1994. DNA shuffling performed well in the evolution of DNA, protein and organism.DNA shuffling procure broad application in many aspects, especially in pharmaceutical production, and drive the development of biological sciences and biotechnology. Moreover,taking advantage of tremendous data analysis power,DNA shuffling as a post genomics technology platform is being increasingly recognized. Development of DNA shuffling in recent 10 years was summarized for research.Keywords: DNA shuffling, directed evolution, DNA family1 前沿DNA改组是由美国的Sr emmer于1994年首先提出，经后人的不断创新和改进，现已发展成为比较完善的技术体系［1-2］。
作为一种高通量的突变和筛选技术，不仅可以实现基因序列的点突变，还可以实现其它突变技术不能实现的基因片段插入、缺失、倒转和整合等，而且可以反复改组，实现突变的优势积累效应［3］。
现阶段该技术以无以伦比的优越性已发展成为比较普遍的研究核酸和蛋白质体外定向分子进化的一种强有的技术［4-5］。
并以强大的生命力，已在基础理论研究、医药研究和工业酶改造等方面取得了令人瞩目的成就。
2 DNA改组技术的基础研究2.1 DNA 改组的基本原理DNA 改组可分为如下4步：1、以单个基因或一组同源基因为模板, 用化学方法[如脱氧核糖核酸酶I酶切或物理方法(如超声破碎法)将基因切割成一定大小的片段；2、由于这些小片段间具有一定同源性，可互为引物，故而可在不加引物的情况下通过PCR法将小片段组装成大片段，完成基因的重聚。
当产物序列接近目的基因长度时，再加入合适的引物将大片段相连，得到一个重组基因文库，将此文库导入合适质粒，构建工程菌文库；3、选择合适的筛选方法(如平板筛选法、噬菌体表面展示技术等)，从工程菌文库中筛选出最佳的重组子；4、将得到的重组子基因，与初始的同源基因些小片段间具有一定同源性，混合在一起，作为第二轮DNA 改组的模板，重复上述步骤，直至得到所需的突变基因［6］。
2.2 DNA 改组的特点2.2.1 DNA 改组技术可在短时间内实现蛋白质分子的定向进化蛋白质分子的自然进化需经历一段漫长岁月，往往长达几千年甚至几百万年。
DNA改组技术的诞生使这个过程大大缩短，研究人员并不需要了解蛋白质进化过程的细节，只需在体外对基因进行随机诱变，然后从大量突变体中定向筛选出所需性质的突变体，工作效率更高。
2.2.2 DNA 改组技术提高了分子进化的成功率在DNA 改组技术诞生前，随机诱变和定向诱变为常用的变异手段。
随机诱变是通过易错PCR法对目的基因上的碱基进行随机替换，具有很大盲目性；而定向诱变需先了解目的基因及其所表达蛋白产物的三级结构、蛋白质功能、关键氨基酸所在位置等具体信息，若对此了解甚少，则很难采用该法。
DNA改组技术是在易错PCR法基础上发展而来，得到的突变基因可和原型母本基因回交，通过多个循环使有益突变迅速积累，故能显著提高有益突变的产生频率［7］。
2.2.3 DNA改组对筛选技术的要求较高DNA 改组后所构建的突变体库十分庞杂，若要迅速从中获得有益突变体，必须采用合适的、高灵敏度及高通量的筛选方法。
例如，对酶的最适pH和最适温度进行改良时，需通过测定酶促反应速度的方式(如荧光法和比色法)进行筛选。
3 DNA 改组技术在现代生物工程中的应用[8-11]3.1 蛋白质工程如DNA改组技术在蛋白质药物上的应用[12]蛋白质药物可分为多肽和基因工程药物、单克隆抗体和基因工程抗体、重组疫苗等。
通常，蛋白质药物的分子量较大。
与以往的小分子药物相比，蛋白质药物具有活性高、特异性强、毒性低、生物功能明确、有利于临床应用等特点。
目前，DNA改组技术在国内得到的关注还不多，相关研究报道也较少。
丙型肝炎病毒(HCV )基因组中的C区基因可编码核心蛋白，后者为宿主免疫反应攻击的主要靶抗原，有效的核心蛋白特异性免疫反应对于预防和清除HCV具有重要意义。
赵甫涛等[13]对HCV基因组C区基因进行了DNA改组。
3.2 酶定向进化[14]运用DNA 改组技术对酶进行定向改造，可改变酶的一系列性质如催化活性、稳定性及底物专一性。
DNA改组技术在酶工程、代谢工程以及医药等领域都得到了广泛的应用，显示出巨大的应用价值。
DNA改组技术对分子酶工程的发展具有重大的影响，已应用到提高酶活性、稳定性以及改变底物专一性等方面。
3.2.1 提高酶的活性熊爱生等[15]选择大肠杆菌的GUS基因作为模板，通过DNA 改组技术构建了突变GUS基因的原核表达质粒库, 经高活性筛选, 获得了活性提高3倍的GUS基因。
3.2.2 改变酶对底物的专一性利用DNA改组技术进行底物专一性改造的酶有β-内酰胺酶、核酶、细胞色素C过氧化酶(CCP)、磷酸酯酶等。
3.2.3 提高酶的稳定性酶的稳定性易受温度、pH值和溶液浓度的影响，因此在工业应用中也受到一定的限制。
应用DNA改组技术可以得到性能更为稳定的各种特定功能的酶, 满足工业生产的特殊需要。
Kim YM等[16]对栖热菌IM6501菌株中具有热稳定性的麦芽糖淀粉酶进行了DNA改组，经过4轮改组和筛选，得到了具有高耐热性的麦芽糖淀粉酶。
3.3 细胞因子定向进化细胞因子是一类能在细胞间传递信息、具有免疫调节和效应功能的蛋白质或小分子多肽。
机体中许多细胞，尤其是免疫细胞，可合成和分泌多种细胞因子，以维持机体的生理平衡，抵抗病原微生物的侵袭及预防肿瘤发生；而在病理状态下，某些重要的细胞因子产生和分泌不足，会阻遏机体对细胞生长的正常调节，进而加剧病变过程。
3.4 代谢工程1991年, Bailey[ 17]提出了代谢工程的概念，即利用DNA重组技术对细胞中涉及生化反应、物质运输及调控功能的关键性酶及蛋白进行改造，进而改善产物的性质、产量或细胞的性能。
DNA改组技术及基因家族改组技术的诞生和日趋成熟，显著加快了代谢工程的发展速度。
4 DNA改组的前景[18]DNA改组自1994年提出以来就受到多方关注。
1997年，Stemmer依托五项美国专利成立了Maxygen公司，吸引了包括世界最大农业公司Du—Pont公司、抗生素巨头DSM公司和工业酶巨头Novo—Nordisk公司，还有美国国防高级研究计划局(DARPA)和国家科学技术协会(NIST)提供5项共计2100万美元的资助。
随着深入应用，越来越多实验室加入DNA改组的相关研究中。
综上所述，无论是基因的表达水平，还是产物的生物活性都可以应用DNA改组加以改进。
但是，这需要我们在初级文库的建立、随即片段的产生和重组以及重组子的筛选等问题上作深入研究。
DNA改组在生物丁程的各个领域中将创造出让世人瞩目的奇迹!5 结语近年来，DNA改组技术已广泛应用于基因的定向进化，一系列改良的蛋白、酶、单克隆抗体及细胞因子由此被开发出来，并在农业、生物工程和基因治疗领域中发挥了巨大作用。
对于那些三维结构不明确的蛋白，不需弄清其结构与功能间的确切关系就可实现高效进化，是DNA改组技术相比于以往的诱变技术所具有的不可比拟的优势；此外，随着DNA改组技术的不断发展，其研究对象也逐渐由单个基因的改组过渡到整个基因组的改组，因而大大提高了分子体外定向进化的效率。
可以相信，生物方法取代传统的化学合成法将是大势所趋。
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