蛋白质分子定向进化其他方法
蛋白质分子定向进化其他方法
自然界在长期的进化过程中．产生了许多具有重要功能的符合人们需要的理想蛋白质，然而，当它们处于复杂的化学反应体系时，则往往不能满足人们的需要。为此，必须不断推出新的方法来改造现有的蛋白质，以满足工业的需要。自然进化是有机体在长期的进化过程中自发出现的非常缓慢的过程。
自然选择往往是朝着有利于机体的方向进行的。大量定点基因突变实验表明，蛋白质功能和性质的改变来自于许多小的内部修饰的积累，这些小的修饰或突变分布于较大的序列空间内，人们试图利用已有的结构生物学信息对蛋白质进行合理设计（rational design），但蛋白质结构的复杂性极大地增加了合理设计的难度，更何况，对于大多数要改造的蛋白质来说，我们并不清楚其三维结构信息，不能进行合理设计，而近年来发展的分子定向进化（molecular directed evolution）策略属于蛋白质的非合理设计范畴，它不需要事先了解蛋白质的三维结构信息和作用机制，而是在体外模拟自然进化的过程（随机突变、重组和选择），使基因发生大量变异，并定向选择出所需性质或功能，从而在几天或几周内实现自然界需数百万年才能完成的事情。
定向进化第一步是由一个靶基因或一群相关的家族基因起始创建分子
多样性（突变和／或重组）；然后对该多样性文库的基因产物进行筛选，那些编码改进功能产物的基因被利用来继续下一轮进化；重复这个过程直到达到目标。该进化策略有以下三个显著特征：a.进化的每一关键步骤都受到严密控制；b.除修饰改善蛋白质已有特性和功能外，还可引入一个全新的功能，来执行从不被生物体所要求的反应；甚至为生物体策划一个新的代谢途径；
c.能从进化结果中探索蛋白质结构和功能的基本特征。
蛋白质定向进化通常分三步进行：基因随机诱变、体外重组和筛选。每一步都可以有多种方法。
常见的定向进化方法有：①易错PCR技术②DNA改组技术③外显子改组④交错延伸重组⑤随机引物体外重组法（RPR）。当然还有其他的方法，下面就来给大家一一介绍。
一、随机诱变
㈠化学诱变剂介导的随机诱变
体外随机诱变也可在65℃下直接用羟胺处理带有目的基因片段的质粒，然后用限制性内切酶切下突变了的基因片段，再克隆到表达载体中进行功能的筛选。
㈡由致突变菌株(mutator strain)产生随机突变
美国stratagene公司构建了一株DNA修复途径缺陷的大肠杆菌突变株XLl-Red，它体内的DNA突变率比野生型高五千倍。将带有要突变基因的质粒转化到XLl-Red菌株内复制过夜，在此过程中会产生随机突变。每两千个碱基中通常约有一个碱基置换。将带有突变过的基因的质粒转化到表达系统中进行筛选。
连续几代的随机突变和筛选的方法是从每一代中挑选出一个最佳的突变体作为下一代的亲本。通过积累氨基酸的正突变，可加快进化的进程。
㈢定点突变和定点饱和突变技术
定点突变技术(Site—directed mutagenesis)一般用于对DNA分子特定位点的突变，所以需要预先知道野生型基因序列。早在1978年Michael Smith 就运用寡核苷酸进行定点突变。定点突变的基本原理是首先合成一段含有突变碱基的DNA引物，然后这段合成的引物可以杂交到包含有目的基因的单链
DNA上，用DNA聚合酶将剩余片段进行延伸，得到的双链分子转入到宿主细胞并被克隆，最后用特定的筛选方法将突变子筛选出来。定点突变技术有盒式诱变和多种基于PCR的突变方法，最常见的有重叠PCR等方法。当靶位点氨基酸分别可被其它19种氨基酸代替而得到突变子的方法，称为定点饱和突变技术，此方法是要着重寻求靶位点的最适氨基酸。定点突变和定点饱和突变技术的运用，能极大地丰富突变体库的多样性。
㈣组合活性中心饱和突变试验
组合活性中心饱和试验(combinatorial active．site saturation test，CAST)的基本原理是：在酶的活性中心部位寻找一系列在空间位置上相互接近的氨基酸对作为突变位点，选择的氨基酸对必须是在侧链基团取向上具有潜在的协同作用。因此，突变后才可能获得更具有潜力的突变体。这是单点突变不能做到的。如果选择的氨基酸对应的位置是n，则第2个氨基酸的选择遵循以下的原则：如果第n个氨基酸在环上，则另一个氨基酸选择第n+1位；若在β折叠上则选择第n+2位，若在310螺旋上，则选择第n+3位；若在α螺旋上，则选择第n+4位。对于CAST突变体库容量的计算：每突变一对氨基酸要进行饱和随机突变，即这一对氨基酸要突变成20种氨基酸的任何一种。以NNK(N代表任何一种核苷酸，K代表是G或T)作为突变的碱基形式，则有322=1 024种不同的组合，而氨基酸则可突变成202=400种不同的组合。因此，要将每个库的所有突变的覆盖率达到95％，则每个库至少要挑3000个克隆子。
此外，近年来还发展出了更多的、新颖的无性突变技术。例如，三核苷酸突变(TriNex)，随机插入-删除突变(RID)，序列饱和突变(SeSaM)以及它的改进方法SeSaM—Tv+。这些方法都是为了能最大程度的增强突变体库的多样性，丰富并延伸无性突变的方法手段。
二、基因体外重组
㈠限制性酶切-再连接介导的基因重组(recombining the genes by restriction and religation)
利用限制性内切酶对欲重组的两个以上DNA序列进行酶切，然后在连接酶的作用下随机重新连接起来，可实现DNA分子问的重组。实验证明，简单的酶切-再连接可进一步提高对硝基苯酯酶的活性。但如果两个正突变处于同一段限制性酶切片段上，则无法将它们重组于同一序列中。
㈡基因家族改组
在基因改组的基础上，1998年由Crameri等提出了基因家族改组技术(DNA family shuffling)，至此才是真正的有性重组的开始。基因家族改组与单基因改组最大的区别在于出发序列的同源性。利用基因家族同源序列进行DNA改组，实现同源重组。由于同源序列是经过自然选择保留下来的相对有益或无害的片段，所以基因家族改组的突变机率和改组效率明显提高，体现了基因的多样性。
㈢过渡模板随机嵌合生长
过渡模板随机嵌合生长（random chimeragenesis on transient templates，RACHITT）技术是与DNA shuffling概念上明显不同的、改进的基因家族重组技术。它不包括热循环、链转移或交错延伸反应，而是将随机切割的基因片段杂交到一个临时DNA模板上进行排序、修剪、空隙填补和连接（图2）。其中的悬垂切割步骤使短片段（比DNase消化片段还短）得以重组，明显提高了重组频率；如果在片段重组前后采用错误倾向PCR还可引入额外点突变。CoCo等首次报道此法改造二苯并噻吩单加氧酶，产生的嵌合文库平均每个基因含14个交叉，重组水平比DNA shuffling类方法（1~4个交叉）高出
几倍；并且可在短至5bp的序列同一区内产生交叉。这种高频率、高密度的交叉水平是DNA shuffling所难以达到的。
㈣酵母增强组合文库
酵母增强组合文库（combinatorial libraries enhanced by recombination in yeast，CLERY）是一个真核基因家族shuffling策略。其原理是将体外DNA shuffling程序与接下来的酵母体内重组缔合起来，构建高丰度低亲本水平的重组文库：直接以含目的基因的质粒作为体外shuffling的模板；shuffling后基因产物与线性化的酵母表达载体共转化酵母细胞启动体内重组事件，同时表达功能性重组子直接用于筛选。Truan等用该法重组人细胞色素P450 1A1和1A2，所得文库含86%的嵌合基因，大大提高了文库丰度；另外，用单链DNA做shuffling的模板可进一步降低文库中的亲本比率。该法为蛋白质结构／功能研究、多组分真核复合酶活力的调控提供了一个新的有力工具。
㈤渐增切割法产生杂和酶
尽管DNA shuffling介导的重组已成为定向进化创建高质量序列多样性的重要工具，但它们通常不能用于重组同源性低于70%~80%的序列。而自然界大多数同源序列具有比这个数目低得多的相似性。为了解决这个问题，Benkovic研究组建立了渐增切割法产生杂和酶（incremental truncation for the creation of hybrid enzymes，ITCHY）及Thio-ITCHY（α-硫代磷酸核苷酸介导的ITCHY）方法来产生不依赖于DNA序列同源性的重组文库。ITCHY的基本原理是：控制核酸外切酶#的切割速度不大于10碱基／min，然后间隔很短时间连续取样终止反应，以获得一组依次有一个碱基缺失的片段库；然后将基因A的一组随机长度的5’端片段与基因B的一组随机长度的3’端片段随机融合产生杂合基因文库。但由于该方案冗长繁琐，Lutz等又提出了
Thio-ITCHY方法：首先将待PCR反应或单链模板引伸反应将α-硫代磷酸核苷酸随机引入产物中，由于其抗核酸外切酶Ⅲ的切割，接下来的切割反应会在此处随机终止，连接切割产物即产生随机交叉文库.该法操作便利，同时也可引入随机点突变。此外，ITCHY/Thio-ITCHY不依赖DNA序列同源性，可在非序列同一区内产生活性融合子。迭代ITCHY或对其文库进行shuffling还可以创造多个交叉。
㈥不依赖序列同源性的蛋白质重组
尽管上述ITCHY可以进行不依赖于序列同源性的重组，但它是一个随机长度片段与另一个随机长度片段相融合，结果文库中基因长度不再保守，子代中功能杂合子的比率很低。要想提高功能杂合子所占比例，须使交叉发生在具有相似结构环境的位置，但由于缺乏足够的序列相似性，同源重组不能发挥作用，因此Sieber等提出了不依赖序列同源性的蛋白质重组（sequence
homology-independent protein recombination，SHIPREC）方法：通过琼脂糖凝胶电泳回收单基因长度随机片段，保证了子代嵌合体长度的保守性，使交叉保持了适当的序列匹配，主要发生在结构上相关的位点，交叉点处的两个氨基酸仍处于它们在亲本蛋白质结构中的位置，从而提高了文库中阳性克隆的比例。该法可以在低序列同一性甚至无序列同一性的同源蛋白质间创造具有单交叉的杂合蛋白质组合文库。迭代SHIPREC可以产生多个交叉。
随着酶分子定向进化的发展，在常规的定向进化方法的基础上，又相继开发出另一些新方法，如设计的寡核苷酸装配(assembly of designed oligonucleotides，ADO)、诱变和单向重组(mutagenic and unidirectional reassembly，MURA)、随机插入-删除链交换突变(random insertional deletional strand exchange mutagenesis，RAISE)、基于Y连接的构件改组(Y-ligation-based block shuffling，YLBS)、合成改组(synthetic shuffling)等新方法都有改造蛋白的成功案例，也为更好的进行定向进化提供了强有力的工具和指导思想。
三、文库筛选策略
一旦多样性文库构建好后，定向进化实验成败与否的关键则在于“要有针对目的改造特征的高效筛选方案”。近几年，与创建多样性重组文库的发展相适应，在高流通量和超高流通量筛选技术方面也取得另人瞩目的成就。其中核糖体展示技术与mRNA展示技术，由于在体外无细胞翻译体系中进行，不受细胞转化效率的限制，大大提高了文库容量和筛选通量（1012~1014）。它们的原理是通过筛选靶蛋白-核糖体-mRNA三元复合物或靶蛋白-mRNA二元复合物，将基因型与表型直接偶联起来，并利用mRNA的可复制性，使靶基因（蛋白）得到有效富集。利用此法进化单链抗体可变区scFv片段，获得
亲和力提高40倍的变异株。
其他高通量筛选方法，如细胞表面展示技术和噬菌体表面展示技术；将靶活力与转录信号相偶联的三杂交体系；以发光信号为指示的反射增进系统；利用荧光信号的荧光共振能量转换仪（FRET），结合荧光激活细胞筛选仪（FACS），每小时可筛选60000个细胞。最近Chadessy等还报道了一种隔室化自复制技术，通过一个只复制其自身基因的聚合酶组成的简单反馈环将体外进化与筛选有机结合起来，使阳性克隆得到快速、高效的富集，获得热稳定性提高11倍，肝素抗性提高130多倍的Taq DNA聚合酶突变株。
在硬件设备方面，1536和3456孔板以及多通道多波长检测仪的出现、每秒钟分配几千滴皮升级样品的非接触式压电配样仪的问世等都大大提高了样品处理速度。
定向进化的意义
定向进化不仅在工业、医疗方面对蛋白质的改造具有重要的意义，而且，它也非常适合于基础理论的研究。对蛋白质分子进化得到的突变体进行分析，为研究蛋白质的结构和功能的关系提供了新的工具。天然蛋白质序列中往往有很多是随机遗传漂移，而不是功能性的适应。例如，从适应不同环境的物种中提取出的蛋白质经常有几十个氨基酸的不同，其中只有一小部分是与特定功能差异有关的。大量的中性突变只能干扰科学家辨别分子的规律。在实验室的进化实验中，种系很清楚，而且突变主要是适应性的。Amold 等人使用高保真DNA改组成功地区分出基因中的功能性和非功能性突变。通过定向进化来研究蛋白质的结构和功能的关系，可为蛋白质的理性设计提供理论依据。
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酶的定向进化
酶的定向进化 蒋本国范圣第刘宝全 (大连民族学院生物工程系大连 116600) 摘要酶的定向进化是发展迅速的重要生物工程技术之一耐酸碱性 底物特异性使酶更适于工业应用的重要途径 本文综述了酶的定向进化的意义 并综述了在最近几年内 关键词酶定向进化性质改进 Some Progresses of the Directed Enzyme Evolution Jiang Benguo, Fan Shengdi, Liu Baoquan (Dalian Nationalities University, Dalian 116600) Abstract The directed enzyme evolution is one of the important bioengineering technologies that was developed rapidly, it is also the necessary way through which the traits of enzymes ????′??ˉó?óú1¤òμéú2ú ±?è??áòy·￠ò?3?D?μ?±???[1]酶的定向进化是为满足这种需求而改变酶的结构和性质的有效途径 近年发展起来的酶定向进化技术使人们可能开发出天然酶蛋白分子不具备的选择特殊环境极地碱湖及盐湖来源的酶 可以逐步接近和满足将酶催化用于工业生产的需要[4] 1 酶定向进化的策略与途径 蒋本国男副教授 2003-03-04收稿
1.1 对酶实行定向进化的重要意义 天然的生物催化剂存在着无法适应工业化生产中非自然条件的限制 经常不能很好地适应环境的转变不稳定性以及苛刻的酶促反应条件 酶在活细胞的复杂条件下 相反 在非水溶液中是活性的(这一点可能在绝大多数生物环境中是不需要的)以及酶能够接受不同的底物(在自然界中不存在的底物)??·t?aD?2?×? μ?ó?×?è????ˉ?à±è é??áê?êy?ü[7] ò22?′??úò?????±ê??·?×ó?¨?ò???ˉêμ?éóDì??¨μ? ??±ê,要求通过简捷的途径重组等手段得到比较理想的酶功能[8] ????±?μ??ùòò??????è??êá￡ ??????μ?????±í′??ú??í¨á?é????D??±eó?ì??? ?¨μ?í?±?×?1980年起用于产生具有增进性质的酶[9]?¤2aoí??è?ì?êaμ?°±?ù?áμ÷????μ?èy???á11 最适温度底物专一性 导致具有理想特性的酶的表达 大大强化了基因调控的能力 再经筛选获得所需的突变株改变反应体系中的Mg2+和dNTPs浓度便可有效的控制所引入的点突变率 然后多重这样的小步幅取代变异(每次1??μ?àí??μ???1|?ü[11]ò?ê??àμ±?yèyê?é? ?°μ??ùòò????ì??ì(少于800碱基对) 另一种途径是在基因的相对小的区域中定向高水平的随机变异[12] ?¨?òμ?±?òì?é?ü2úéúD?μ?°±?ù?áè?′ú??×éo? òò?aD?2?·ùè?′ú?D?3D??D??2ú???é?ü2￠2?ê?óDà?μ? [13] ?ò?ò×????? ???ˉμ???òì?ùòò×é ?úDòáD????é?±í??3?oü′óμ????? DNA随机重组称作有性PCR[10] 但是与体外方法得到的结果相比 其它几种方法如随机前体重组(RPR)[17] 随机插入与删除(RID)[19]增长剪截(ITCHY)和DNA
蛋白质分子定向进化其他方法
蛋白质分子定向进化其他方法 自然界在长期的进化过程中．产生了许多具有重要功能的符合人们需要的理想蛋白质，然而，当它们处于复杂的化学反应体系时，则往往不能满足人们的需要。为此，必须不断推出新的方法来改造现有的蛋白质，以满足工业的需要。自然进化是有机体在长期的进化过程中自发出现的非常缓慢的过程。 自然选择往往是朝着有利于机体的方向进行的。大量定点基因突变实验表明，蛋白质功能和性质的改变来自于许多小的内部修饰的积累，这些小的修饰或突变分布于较大的序列空间内，人们试图利用已有的结构生物学信息对蛋白质进行合理设计（rational design），但蛋白质结构的复杂性极大地增加了合理设计的难度，更何况，对于大多数要改造的蛋白质来说，我们并不清楚其三维结构信息，不能进行合理设计，而近年来发展的分子定向进化（molecular directed evolution）策略属于蛋白质的非合理设计范畴，它不需要事先了解蛋白质的三维结构信息和作用机制，而是在体外模拟自然进化的过程（随机突变、重组和选择），使基因发生大量变异，并定向选择出所需性质或功能，从而在几天或几周内实现自然界需数百万年才能完成的事情。 定向进化第一步是由一个靶基因或一群相关的家族基因起始创建分子 多样性（突变和／或重组）；然后对该多样性文库的基因产物进行筛选，那些编码改进功能产物的基因被利用来继续下一轮进化；重复这个过程直到达到目标。该进化策略有以下三个显著特征：a.进化的每一关键步骤都受到严密控制；b.除修饰改善蛋白质已有特性和功能外，还可引入一个全新的功能，来执行从不被生物体所要求的反应；甚至为生物体策划一个新的代谢途径； c.能从进化结果中探索蛋白质结构和功能的基本特征。
蛋白质定向进化的高通量筛选方法
山东农业大学学报(自然科学版),2008,39(4):653-656Journal of Shandong Agricultural University (Natural Science ) 蛋白质定向进化的高通量筛选方法 黄春晓,段学军 (中原工学院能源与环境学院,河南郑州 451191) 摘要:定向进化是改造蛋白质分子的有效新策略。创建突变库的方法已经有很多而且比较通用,而建立有效的高通量的筛选方法是蛋白质定向进化成功的关键。本文综述了近几年发展起来的用于定向进化的高通量的文库筛选方法,介绍了各种展示技术及流式细胞分选技术的原理及其在文库筛选中的应用,分析了存在的问题及发展趋势。 关键词:定向进化;高通量筛选方法;展示技术;流式细胞分选技术 中图分类号:Q 93 文献标识码:A 文章编号:1000-2324(2008)04-0653-04 收稿日期:2006-07-27 基金项目:河南省教育厅自然科学基金 作者简介:黃春晓(1968-),女,汉族,河南叶县人,副教授,硕士,主要从事环境生物技术的研究。 HI GH -THR OUGHPUT SCREENI NG M ETH ODS I N THE D I RECTE D EV OLUTI O N OF PR OTEI NS HUANG Chun -xiao,DUAN Xue -jun (College of Energy &Envir onment of Zhongyuan University of Technol ogy ,Zhengzhou 450007,China ) Abstract:D irected evoluti on is a ne w po werful strategy f or engineering p r oteins .Many feasible methods f or gen 2erating gene libraries are devel oped .Therefore devel op ing the high -thr oughput screening methods f or desired mutants is the key t o the success in directed evoluti on .I n this article,we summarize the high -thr oughput screening methods devel oped resent years such as F ACS (Fluorescence -activated cell s orting )and the dis p lay technol ogy including phage dis p lay,cell -surface dis p lay,ribos o me dis p lay and mRNA -pep tide fusi on .Their p rinci p les and app licati on in screening for desired mutants fr om mutant libraries are intr oduced .W e discuss the unres olved questi ons and p r om ising p r os pect in the screening methods . Key words:D irected evoluti on;high -thr oughput screening;method;dis p lay technol ogy;F ACS 定向进化技术可以将自然界漫长的蛋白质改造过程缩短到数年、数月、甚至数天。蛋白质体外定向进化技术已成功地应用于酶活力的提高、药物蛋白特性的改进、新代谢途径的获取等众多领域,对工农业生产、医药卫生、环境工程等行业有重要的意义。蛋白质定向进化的关键步骤包括(1)建立目的蛋白质基因的突变体文库;(2)通过合适的筛选系统,快速地从突变体文库中筛选出符合目标的蛋白质。随着定向进 化的不断发展和广泛应用,创建基因突变库的方法已有很多[1][2],已不再是阻碍定向进化速度的关键。目 前定向进化的最大瓶颈是缺乏高通量的筛选方法,很多研究者致力于寻找灵敏度高、快速、简便的筛选方法。 1传统筛选方法及其局限性 当突变体酶可赋予宿主细胞生长或存活的优势时,很容易搜寻含有106以上个蛋白质突变体的文库。 然而,这类情况并不多见[3]。 目前,对于酶活的筛选传统方法大多是利用琼脂平板克隆筛选或检测粗酶裂解液的酶活。琼脂平板克隆筛选主要是针对表达蛋白特殊化学性质的筛选方法,包括利用固体平板上底物产生的颜色变化或菌落周围产生的水解圈进行筛选等。如用含有淀粉和锥虫蓝的LBSP 的固体平板可以对产淀粉酶的克隆进
进化与生态思考题
进化与生态思考题综合 第一讲： 一、进化论与创造论，各有什么道理？ 创造的模式认为从原始到高级的各种生物都是由大能的神各按其类造出来的；生命只能源於生命，各种生命皆来自永生的神。但进化模式却认为生命是在漫长的进化过程中，由无机物变成有机物，由有机物演化出氨基酸、蛋白质，最後演化为最简单的单细胞生物，产生了生命。【米勒实验、寒武纪大爆炸】 二、生物学中哪些实例支持生命的共同祖先假说？ 都遵循中心法则，复制都遵从碱基互补配对，都是三联体密码子。等等。。。 1.生物分类学的证据 为了直观显示各生物在分类上的关系，分类学家一直在尝试画出关系图表。关系图画得越多、越细，分支也就越多，最后就成为一棵树。我们看到一棵树，就知道它是由树根长出，不断生长、分支的；我们看到一株分类树，很自然就应该想到生物都是从同一祖先传下来，不断地进化，形成各个物种的。 2.比较解剖学的证据 贝伦发现人和鸟尽管在外形上极不相同，但骨骼组成却非常相似。这说明人和鸟是亲戚，都是一个祖先的后代。此外，脊椎动物的前肢，比如人的手、马蹄、鲸鱼的鳍等，它们的外形相差很大，功能也不相同，但它们的骨架却是如此的相似。对此最好的解释就是：他们来自同一祖先，由于适应环境的需要，改变了外形和功能，但实际的骨架却没有改变。 3.比较胚胎学的证据 如果把鱼、青蛙、鸡、猪、兔和人的各个时期的胚胎放在一起，我们就会发现它们存在不同程度的相似性。而且关系越密切，相似的程度越高。这说明这些生物来自共同的祖先，它们祖先的特征在胚胎发育过程中重演了。 4.比较免疫学的证据 每种动物的血清中都有一系类独特的蛋白质，若两种动物的亲缘关系越接近，则抗原——抗体反应就越强，反之则越弱。利用这种方法与古生物化石或形态比较绘出的亲缘关系树符合得很好，这也更加证明了生物来自共同的祖先。 5.分子生物学的证据 ①所有的生物都是由细胞组成的（病毒除外）；②组成生物的大分子有核酸、蛋白质、多糖、和脂类四种，这些生物大分子的成分在所有生物中都是一致的：核酸都是由嘌呤和嘧啶组成，蛋白质都是由氨基酸组成，多糖都由单糖组成，脂类则是由甘油和脂肪酸组成；③所有的生物都只用20种氨基酸，几乎所有的生物都共享一套遗传密码。 三、中性进化理论与达尔文进化论矛盾吗？ 否。因为达尔文注意到了变异的有害性和有利性，而中性突变进化学说注意到的是既无利也无害的所谓中性突变，应该说是从不同角度，不同层次看问题的结果，使达尔文学说得到了补充和发展。且中性说是始终以分子水平的结构来提问题的，而达尔文学说是从表型水平来说的，二者并不相矛盾。 四、谈谈你对进化生物学新发展方向的见解。 1、分子古生物学 答：化石DNA可直接了解其进化历程，为DNA重复序列、基因结构的起源进化，生物大分子的突变重排及遗传信息在发展过程中的传递提供线索。使了解承重作
福师《进化生物学》在线作业一答案
福师《进化生物学》在线作业一-0001 试卷总分:100 得分:100 一、单选题(共24 道试题,共48 分) 1.下列哪一条不属于真核基因组结构特点 A.大量的重复序列 B.mRNA为单顺反子 C.mRNA为多顺反子 D.基因是不连续存在的 E.人的基因组大小为3×109碱基对 答案:C 2.能出现在蛋白质分子中的下列氨基酸、哪一种没有遗传密码？（） A.色氨酸 B.蛋氨酸 C.谷氨酰胺 D.脯氨酸 E.羟脯氨酸 答案:E 3.在一个基因库中，显性基因和隐性基因的比例相等，如果每一代隐性基因型的个体都不能产生后代，经过长期的自然选择（） A.对基因性的比例影响很小 B.会降低隐性基因的比例 C.会使隐性基因灭绝 D.会提高杂合子的比例 答案:B 4.在豚鼠中，黑毛对白毛是显性，如果基因库中90％是显性基因B，10％是隐性基因b，则种群中基因型BB、Bb、bb的频率分别是（） A.81％、18％、l％ B.45％、40％、15％ C.18％、81％、1％ D.45％、45％、10％ 答案:A 5.五界说在生物发展史方面显示了生物进化的三大阶段。这三个阶段依次是：（） A.单细胞→群体→多细胞； B.原核细胞阶段→真核细胞阶段→多细胞阶段； C.原核细胞阶段→真核细胞阶段→真核多细胞阶段； D.原核细胞阶段→真核单细胞阶段→真核多细胞阶段。 答案:D 6.隐性基因a可表现为人的一种疾病,基因型aa的儿童10岁前全部死亡,基因型AA和Aa的个体都表现为健康.在一个隔离的群体的一代(Ⅰ)中,该等位基因a在成人中的频率为0.01,如
果没有新的突变发生,在下一代(Ⅱ)的成人中等位基因a频率,以及在下一代(Ⅱ)的新生儿中杂合子Aa的频率变化趋势是( ) A.下降,上升 B.上升,下降 C.下降下降 D.上升,上升 答案:C 7.与人类亲缘关系最近的动物是( ) A.黑猩猩 B.长臂猿 C.猕猴 D.大猩猩 答案:A 8.远缘杂交常会出现不育的难题，下列生物技术中可以克服远缘杂交不育的是 A.转基因技术 B.细胞融合 C.组织培养 D.细胞核移植 答案:B 9.运用达尔文自然选择学说，下列叙述正确的是（） A.野兔的保护色和鹰锐利的视力是它们相互选择的结果 B.长颈鹿经常努力去伸长颈和前肢去吃高处的树叶，因此颈和前肢都很长 C.尺蠖工业黑化现象是因为受煤烟熏黑的结果 D.北极熊为适应冰天雪地的环境，毛色产生定向的白色变异 答案:A 10.在一个有性生殖的自然种群中，除了具有种群大、没有突变发生、没有新基因加入以及个体间的交配是随机的以外，还需具备下列哪一条件，种群的基因库是稳定的（） A.捕食者数量减少 B.没有自然选择 C.环境条件变化缓和 D.改变个体的摄食方式 答案:B 11.下列有关遗传密码的叙述、正确的是（） A.遗传密码只代表氨基酸 B.一种氨基酸只有一个密码子 C.一个密码子可代表多种氨基酸 D.每个tRNA上的反密码子只能识别一个密码子 E.从病毒到人、丝氨酸的密码子都是AGU 答案:E
蛋白质与酶工程名词解释
蛋白质与酶工程名词解释 一、名词解释 1.蛋白质工程（Protein Engineering）：以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能 的关系为基础，通过有控制的修饰和合成，对现有蛋白质加以定向改造，设计、构建并最终生产出性能比自然界存在的蛋白质更加优良、更加符合人类社会需要的新型蛋白质。 2.蛋白质分子设计（Protein Molecule Design）:从分子、电子水平上，通过 数据库等大量实验数据，结合现代量子化学方法，通过计算机图形学技术等设计新的分子。 3.亲和标记/亲和标记试剂（Affinity Labeling /reagent）：试剂对蛋白质分子中被修 饰部位的专一性修饰，为亲和标记或专一性的不可抑制作用。(亲和标记试剂，不仅具有对被作用基团的专一性，而且具有对被作用部位的专一性，即试剂作用于被作用部位的某一基团，而不与被作用部位以外的同类基团发生作用。 这类修饰试剂也被称为位点专一性抑制剂) 4.定向进化（Directed Evolution）：在较短时间内完成漫长的自然进化过程（突 变、重组和筛选），有效地改造蛋白质，使之适合于人类的需要，这种策略只针对特定的蛋白质的特定性质，因而被称为定向进化。 5.DNA改组技术（DNA Shuffling）：是指DNA分子的体外重组，是基因在分子 水平上进行有性重组，通过改变单个基因原有的核苷酸序列，创造新基因，并赋予表达产物以新功能。 DNA家族改组技术（DNA Family Shuffling）：是以来自不同种属的同源基因作为重排对象进行DNA改组操作的技术。该技术打破不同种、属间的遗传界限，利用同源基因之间的同源序列进行DNA改组 6.超滤（Ultrafiltration）：利用压力或离心力使溶液中的小分子物质通过超滤膜， 而大分子则被截留，一次实验就可以将蛋白质混合物分为分子大小不同的两部分的分离方法。 7.亲和层析（Affinity Chromatography）：是利用蛋白质与配体专一性识别并结合 的特性而分离蛋白质的一种层析方法。将与目标蛋白质专一性结合的配体固定于支持物上，当混合样品流过此支持物时，只有目标蛋白能与配体专一性结合，而其他杂蛋白不能结合。 8.蛋白质免疫印迹法（Western Blotting）：印迹法是将样品转移到固相载体上， 而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。对单向电泳后的蛋白质分子的印记分析称为蛋白质免疫印迹法。 9.酶联免疫吸附技术（ELISA）:是采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接， 然后通过酶与底物产生颜色反应，根据颜色反应深浅进行定性或定量分析的一种技术。 10.蛋白质芯片（Prion Chip）：又称蛋白质微阵列，是将大量蛋白质有规则的固 定在某种介质载体上，利用蛋白质与蛋白质、酶与底物、蛋白质与其他小分子之间相互作用检测分析蛋白质的一种芯片。 11.酶工程（Enzyme Engineering）：将酶所具有的生物催化作用，借助工程学的手 段，应用于生产、生活、医疗诊断和环境保护等方面的一门科学技术。概括的说，酶工程是由酶制剂的生产和应用两方面组成的。酶工程的应用主要集中于食品工业、轻工业以及医药工业中。
酶的定向进化方法
摘要酶的体外定向进化是蛋白质工程的新策略. 不需事先了解酶的空间结构和催化机制, 而是通过模拟自然进化机制，以改进的诱变技术结合确定进化方向的选择方法，在体外改造酶基因，定向选择有价值的非天然酶. 短期内可以在试管中完成自然界需要几百万年的进化过程，因此可能是发现新型酶和新的生理生化反应的重要途径. 关键词蛋白质工程模拟定向进化 ------------------------------------------------------------- 理论上，蛋白质分子蕴藏着很大的进化潜力，很多功能有待于开发，这是酶的体外定向进化的基本先决条件. 所谓酶的体外定向进化（directed evolution of enzyme in vitro）, 又称实验分子进化（experimentally molecular evolution）, 属于蛋白质的非合理设计（irrational design），它不需事先了解酶的空间结构和催化机制〔1〕，通过人为地创造特殊的条件，模拟自然进化机制（随机突变、重组和自然选择），在体外改造酶基因, 并定向选择出所需性质的突变酶. 酶的体外定向进化技术极大地拓展了蛋白质工程学的研究和应用范围，特别是能够解决合理设计所不能解决的问题，为酶的结构与功能研究开辟了崭新的途径，并且正在工业、农业和医药等领域逐渐显示其生命力. ------------------------------------------------------------- 1 定向进化的原理 在待进化酶基因的PCR扩增反应中, 利用Taq DNA多聚酶不具有3′→5′校对功能的性质, 配合适当条件, 以很低的比率向目的基因中随机引入突变, 构建突变库, 凭借定向的选择方法, 选出所需性质的优化酶（或蛋白质）, 从而排除其他突变体. 定向进化的基本规则是,“获取你所筛选的突变体”〔2〕. 简言之, 定向进化=随机突变+选择. 与自然进化不同, 前者是人为引发的, 后者虽相当于环境, 但只作用于突变后的分子群, 起着选择某一方向的进化而排除其他方向突变的作用，整个进化过程完全是在人为控制下进行的. ------------------------------------------------------------- 2 随机突变的策略 2.1 易错PCR 易错PCR（error-prone PCR）〔3，4〕是指在扩增目的基因的同时引入
进化生物学教学大纲
《进化生物学专题》课程教学大纲 Evolutionary Biology 一、课程的性质和目的 课程性质：《进化生物学专题》是野生动植物保护专业硕士研究生学位课。 课程目的：进化论是生命科学中最大的统一理论，是在生命科学的基础上进行生物种类、种群及生物类群的演化及进化研究的一门学科，对于生命科学各个分支学科和各个水平层次的学习和研究均具有指导意义。通过对生物进化的历史过程、进化原因、进化机制、进化速率、进化趋向、物种的形成和绝灭、系统发生以及适应的起源机制等内容的学习，使学生认识生命进化的基本历程，进化的动力机制，同时融会贯通各分支学科知识，在已有的各学科领域知识的基础上学会对生物的进化现象进行正确的理论分析，从而培养学生的创新意识和创新思维。 二、预修课程 进化理论是生物学中最大的统一理论。因此，植物学、动物学、动植物生理学、遗传学、细胞生物学、分子生物学等课程是进化生物学的预修课程。 三、课程内容及学时分配 专题一概论（4学时） 1、进化、生物进化、生物进化论与进化生物学等基本概念； 2、进化思想与进化学说的产生与发展； 3、当代进化生物学的研究领域和研究方法。 专题讨论：生活中的生物进化现象。 专题二生物发展史――多细胞生物的进化历史（4学时） 1、地球上生命的起源 2、地质年代和生物化石 3、生物界的系统进化历史及其规律 专题讨论：澄江动物群和寒武纪生命大爆发 专题三小进化――生物的微观进化（4学时） 1、微观进化的概念及对象——无性繁殖系和种群 2、种群的遗传结构及改变基因频率的因素 （1）突变对基因频率的影响； （2）在选择作用下基因频率的变化； （3）迁移（基因流动）对基因频率的影响； （4）遗传漂变引起基因频率的变化。 3、自然选择的作用 （1）自然选择的概念及类型； （2）自然选择的意义。 4、自然选择下的适应进化。
2011进化生物学(开卷)试题及答案
重庆师范大学研究生考试（开卷）试题 研究生姓名：专业：动物学、生化分子生物学、水生生物学 年级：2011级考试科目：进化生物学时间：150分钟 一、名词解释：(20分) 1、海底“黒烟囱” 2、幼态持续 3、分子进化 4、镶嵌进化 5、盖亚假说 二、论述红皇后假说的原理。(10分) 三、简述遗传漂变的概念及其在进化中的意义。 (20分) 四、试叙述基因组学与非线性分子进化的关系。(20分) 五、谈谈进化生物学理论与你所研究领域的关系。(30分，不少于1000字) （试题之间不必留答题空白）
一、名词解释：(20分) 1、海底“黒烟囱” 由海底硫化物堆积形成的直立的冒着黑色、白色或黄色烟雾的柱状圆丘，称为硫化物烟囱或海底“黑烟囱”。在这些烟囱中，约350℃的含矿热液从中喷出，与周围海水混合后，很快产生沉淀变为“黑烟”，沉淀物主要由磁黄铁矿、黄铁矿、闪锌矿和铜－铁硫化物组成。海底“黑烟囱”的形成主要与海水及相关金属元素在大洋地壳内热循环有关。 2、幼态持续 所谓幼态持续（Neoteny），是指个体发育中保留某些幼年时期的特征并使之延长到成年时期的现象，是大脑进化的有效机制。 3、分子进化 分子进化（molecular evolution）有两层含义，一是原始生命出现之前的进化，即生命起源的化学演化；二是原始生命产生之后生物在进化发展过程中，生物大分子结构和功能的变化以及这些变化与生物进化的关系。4、镶嵌进化 镶嵌进化（mosaic evolution）是指生物体的不同部分进化速度不均的现象。其中包括同一生物的不同性状，甚至生活史的不同阶段（如昆虫）。同时，镶嵌进化也指基因型的不同范围的独立进化。 5、盖亚假说 盖亚一词源于希腊文，是大地女神的意思，古希腊人用它来表示大地和大地上所有生命及人类所组成的“大家庭”。 盖亚假说是由英国大气学家拉伍洛克（James E.lovelock）在20世纪60年代末提出的。该假说认为地表温度、地表沉积物、海水含盐量及大气组成等是由生物生命活动所控制并保持动态平衡，从而使得地球环境维持在适合于生物生存的状态。包含5个层次的含义：一是认为地球上的各种生物有效
蛋白质的体外合成和纯化作业
蛋白质的体外合成和纯化 一、蛋白质体外合成方法概述 无细胞蛋白质合成系统（The cell-free protein synthesis system）是一种以外源mRNA或DNA为模板，在细胞抽提物的酶系中补充底物和能量来合成蛋白质的体外系统。与传统的体内重组表达系统相比，体外无细胞合成系统具有多种优点，如可表达对细胞有毒害作用或含有非天然氨基酸（如D-氨基酸）的特殊蛋白质，能够直接以PCR产物作为模板同时平行合成多种蛋白质，开展高通量药物筛选和蛋白质组学的研究。 基因克隆是70年代发展起来的一项具有革命性的研究技术，可概括为：分、切、连、转、选。其中，“分”是指分离制备合格的待进一步操作的DNA，包括作为运载体的DNA和欲克隆的目的DNA；“切”是指用序列特异的限制性内切酶切开载体DNA，或者切出的目的基因；“连”是指用DNA连接酶，将目的DNA 同载体DNA连接起来，形成重组的DNA分子；“转”是指通过特殊的方法将重组的DNA分子送入宿主细胞中进行复制和扩增；“选”则是从宿主群体中挑选出携带有重组DNA分子的个体。最终目的在于通过相应技术手段，将目的基因导入寄主细胞，在宿主细胞内的目的基因被大量的复制。 基因克隆技术包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组DNA，然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。 二、基因克隆方法操作步骤 1、目的基因的获得 目的基因是指所要研究或应用的基因，也就是将要克隆或表达的基因。获得目的基因是分子克隆过程中最重要的一步，基因工程流程的第一步就是获得目的DNA片段。所需目的基因的来源，不外乎是分离自然存在的基因或人工合成基因。常用的方法有PCR法、化学合成法、cDNA法及建立基因文库的方法来筛选。
进化生物学论文
课程名称：进化生物学主讲教师：吴华、赵勉 学号 2009211774 姓名赵晓乐成绩： 对进化生物学的一点看法 摘要:从研究生命的起源的现如今拥有高智商的人已有很长的历史了，很多学者认为到了当代人类已经不再进化了而最近的一些科学研究已然否定了这一结论。人类仍然在发展进化并且速度比以往任何一个时期都要迅速。随着可以的发展分子生物学的研究成为进化生物学学发展的新方向。 关键词：进化生命起源分子生物学 一、人类仍然在进化 进化生物学这门课的学习已然结束，但是人类对于生命的探索从未停滞。最近看了几篇有关进化的文章对我固有的知识有了很大的冲击。 几十年来，无论是公众还是世界最杰出的生物学家，几乎都已形成一个共识：人类的进化已经结束，自然选择已经与人类没有什么关系了，我觉得这也是不争的事实。有科学家指出，自从 5 万年前现代智人出现以来，就一直再没有发生生物学上的变化了。这一理论根深蒂固，事实上已被奉为金科玉律。 然而，一项新的研究成果却大胆地向传统理论发起了挑战。该研究认为，人类基因组内最新的适应性突变极其丰富，尤其令人吃惊的是，这些突变的产生就像雪崩一样越来越快。有关数据显示，在过去 1 万年里，人类进化的速度比人类历史上任何其他时期都要快逾百倍。科学家已发现的新的适应性基因突变有约2000 个，这些基因并不限于皮肤和眼睛的颜色等公认的种族差异的表面性状，而涉及到大脑、消化系统、寿命、免疫能力、精子生成和骨骼等，可以说关系到人体机能的每一个方面。历史学家普遍认为，将今天的人类区别开来的生活态度和风俗习惯等主要是源于文化差异，而现在一些科学家认为，几乎我们所能看到的一切特性，无不受到遗传基因的强烈影响[1]。 那究竟是什么原因使得现在人类进化的速度加快呢?1 万年前，地球上有1000 万人口；到罗马帝国时期，全球人口激增到 2000 万人；公元 1500 年之后，全球人口一直呈几何级数上升，到今天已经超过 67 亿。这为基因突变提供
酶分子的定向进化
第七章酶分子定向进化 酶的蛋白质工程 蛋白质工程是以创造性能更适用的蛋白质分子为目的，以结构生物学与生物信息学为基础，以基因重组技术为主要手段，对天然蛋白质分子进行设计和改造。 蛋白质的功能基础 蛋白质的功能在很大程度上取决于其空间结构。 酶的蛋白质工程 现在对天然酶性质的改造主要包括以下几个方面： 1）改变酶的动力学性质以改变其催化效率； 2）取代活性部位的氨基酸残基，研究其对整个酶分子功能及稳定性的影响； 3）提高酶在非水溶剂中的稳定性和活性，目前主要是针对极性有机溶剂； 4）增强酶的专一性，减少副反应； 5）改变酶的最适温度和最适pH值； 6）增强酶抗氧化和抗水解能力，延长体内半衰期； 酶的蛋白质工程 原则上任何有功能的酶都可用蛋白质工程加以改造，但实际上选择目标时需考虑几个因素：1）有没有测定空间结构或者有没有已知结构的同源蛋白质； 2）结构功能关系是否明确； 3）所选对象有何经济效益和社会效益； 4）是否易于进行分子设计和最后的基因工程生产。 蛋白质结构的测定 运用X-射线衍射测定蛋白质晶体结构 核磁共振测定溶液中蛋白质三维结构 同时运用几种结构测定方法获取蛋白质结构的数据 建立数据库 蛋白质结构测定 一级结构测定： 直接法 间接法 三级结构测定： X-射线晶体衍射 核磁共振(NMR)光谱 X-射线衍射技术： 蛋白质工程的主要手段 蛋白质的分子设计 蛋白质的分子设计就是为将要改造的蛋白质提供设计方案。 对蛋白质的分子设计分为三类： （1）小改——少数残基的替换； （2）中改——分子剪裁； （3）大改——全新设计。 酶的蛋白质工程 定点突变 酶的定向进化 酶的定向进化
酶的定向进化
酶的定向进化 关键词：酶氨基酸蛋白质试剂标准物质北京标准物质网 一、概念及一般步骤 定点诱变方法在蛋白质工程中起到了至关重要的作用。然而，定点诱变只能对天然蛋白质序列中的部分单独氨基酸进行替换或修改，因而对其生物活性提高的作用有限。同时，该方法仅适用于三维结构明确、结构与功能的相互关系也清楚的蛋白质，应用空间相对有限。这些定向诱变技术本身的局限性制约了其更为快速的发展和更广泛的应用。 酶的定向进化技术，则是在不了解酶的空间结构和作用机制的情况下，通过人为创造特殊条件模拟自然进化过程，在体外使其基因发生大量变异，并定向筛选获得具有特定性质或功能的突变酶分子。相对于传统的定点诱变蛋白质理性设计方法，定向进化被称为蛋白质的非理性设计方法。 酶的定向进化技术一般步骤为：选择已经存在的酶分子作为进化起点，确立目标酶的性质或功能；通过随机突变和基因体外重组创建基因突变文库；确定目标酶分子的筛选方法；选择结果相对最好的突变株。通常，酶的定向进化是一个循环递进的过程，以一次循环所得的最佳突变株作为下一个突变循环起点，逐渐累积正突变直至获得期望的目标酶分子。 酶的定向进化技术是一种更接近自然进化方式的蛋白质工程新策略，使原本在自然界中需要数千万年的进化过程缩短至几个月内完成，并能定向得到符合需要的新型酶分子，大大加速了蛋白质工程的发展。目前，蛋白质的合理设计策略与酶分子的定向进化方法互相补充，为研究蛋白质的结构和功能开辟了新的道路，拓宽了蛋白质工程的研究范围和应用前景。 二、定向进化的研究方法 定向进化一般包括随机诱变、体外重组、筛选鉴定三部分，每一部分都有多种研究技术。 1.随机诱变易错PCR技术是通过改变传统PCR方法的反应条件，使碱基在一定程度上随机错配而引入多点突变，进而构建突变基因库。该方法多用于较小的基因片段，其遗传变化只发生在单一分子内部，属无性进化范畴。由于在突变过程中有益突变的概率很低，因此该方法较为费力耗时。一般易错PCR过程均需要连续反复进行使得每一次的正向突变累积直至产生重要的有益突变。
进化生物学考试整理
生物进化：指某种有趋势的变化，这种变化包括了复杂性和有序性增长的趋势，适应生存环境的趋势，与无方向的循环往复的变化不同。 进化生物学：是研究生物进化的科学，不仅研究进化的过程，更重要的是研究进化的原因、机制、速率和方向，也就是说进化生物学是回答“为什么”的科学，是追究事物或过程因果关系的科学。 中性突变：指不影响蛋白质功能的突变，也即既无利也无害的突变，如同工突变（由于DNA 分子上非转录顺序或重复序列或蛋白质非功能部分相关的结构基因的改变产生）和同义突变（与密码子的简并性和tRNA反密码子的摇摆性有关） 现代综合进化论的主要内容： 1，自然选择决定进化的方向，使生物朝着适应环境的方向发展。主张两步适应（间接适应），即变异经过选择的考验才能适应。认为生物进化发展的动力是生物内在的遗传和变异矛盾运动的结果； 2，种群是生物进化的基本单位，进化机制研究属于群体遗传学范畴，进化的实质就在于种群内基因型频率和基因频率的改变，并由此引起生物类型的演变； 3，认为突变、选择、隔离是物种进化和生物进化的机制。认为结构基因中的点突变为生物进化提供了原始素材，是生物变异的源泉。自然选择淘汰不利变异，保留对个体生存和繁衍有利的变异，导致群体基因库中基因频率的改变。然后通过空间隔离（地理和生态隔离）使已出现的差异扩大，达到阻断基因交流的程度，即生殖隔离的程度，最终导致新物种形成。 4，分子水平理论：通过分子方面的技术和原理对进化选择机制等问题的研究。 中性突变理论是否是对达尔文学说的否定：中性突变理论认为生物进化的动力在于中性突变和突变的漂移固定。认为突变多为中性突变，无利无害，只有通过突变的漂移固定导致生物形态和生理上出现差异后，自然选择才会发生作用最终导致表型变化。达尔文注意到了变异的有害性和有利性，中性突变从不同角度不同层次看待问题，使达尔文学说得到补充和发展。 进化生物学发展新方向：进化生物学已经进入实验验证，不仅定性且定量研究的新阶段。1，分子古生物学将成为热门课题 化石DNA是直接了解DNA进化过程的一条重要途径，它将为DNA重复序列的起源和进化、基因结构的起源和进化、生物大分子的突变和重排及生物遗传信息在系统发展过程中的水平转移和垂直转移，以及基因组的进化等，提供直接的证据和线索；将为成种作用时期提供遗传信息，使我们更详尽地了解成种作用的分子机制；它沟通了古生物学的形态特征与DNA 分子特异性之间的关系，使建立一套新的以DNA为主要依据的分类学体系成为可能。 2，分子进化工程将成为热点之一 分子进化工程，又称实验室进化，是继蛋白质工程之后的第三代基因工程。它通过在试管里对以核酸为主的多分子体系施以选择压力，模拟生物进化历程的定向进化技术，借以达到创造新的基因蛋白质甚至新的物种的目的。分子进化工程包含了三个连续往复的化学过程，扩增、突变、选择。三个过程紧密相连，使被选择的分子不断扩增，并不断引进变异，进而进行新的选择。 3，从进化生物学入手研究发育的机制是另一个热点 发育与进化密切结合，从进化生物学入手研究不同进化阶段的物种中的这类基因，对发育的调控以及功能和结构基因组之间的异同将有助于揭示发育的内在调控机制，进而为人类创造生命提供可能。 类蛋白质微球体：把多种氨基酸干热聚合形成的酸性类蛋白质放入稀薄的盐溶液中冷却，或将其溶入水使温度降低到0℃，在显微镜观察下会看到大量直径0.5~3纳米的均一球状小体，
第八章 酶分子定向进化(提纲)2013
第八章酶分子定向进化 一、酶分子定向进化的目的 为什么要研究酶的定向进化? 天然酶的局限性 在机体外复杂体系中，酶催化的精确性较低 存在产物抑制 稳定性差，活性低，催化效率低 有些缺乏有商业价值的催化功能及其它性质 现代生物工程的要求 能具备长期稳定性和活性 能适用于水及非水相环境 能接受不同的底物甚至是自然界不存在的合成底物 能够在特殊环境中合成和拆分制作新药物或药物的原材料 利用基因工程、蛋白质工程的原理和计算机技术对天然酶进行改造或构建新的非天然酶具有重要研究意义和应用前景。 二、酶分子的改造 酶分子的理性设计：在研究天然酶及其突变株时，通常先获得酶分子特征、空间结构以及结构与功能的关系等方面信息，这些用各种生物化学、晶体 学光谱学等方法来解决，然后根据这些信息进行酶分子的改造，这就是酶 分子的理性设计。 酶分子的非理性设计：不需准确知道酶蛋白结构与功能等信息，直接通过 随机突变、基因重组、定向选择或筛选等方法进行酶分子的改造，称为酶 分子的非理性设计。 问题：定向进化是不是定点突变？ 澄清一个事实：定向进化不是定点突变 定向进化：突变筛选 突变位点是随机的，不确定的； 突变位点的数目也是不确定的； 突变的效应更是不可预知的； 理论上讲，凡是能够引起突变的因素（物理的、化学的、生物的）都可以应 用于定向进化中突变体的产生。 定点突变： 突变位点是确定的，突变的个数也是预知的； 突变的效应可能是已知的，也可能是未知的； 定点突变的方法一般是以PCR 技术为基础的。 什么是酶的定向进化? 从一个或多个已经存在的亲本酶（天然的或人为获得的）出发，经过基因的
突变和重组，构建一个人工突变酶库，通过筛选最终获得预先期望的具有某些特 性的进化酶。 酶分子定向进化研究的历史 萌芽阶段：20 世纪60 年代Sol Spiegelman 利用RNA 噬菌体Q 巧妙地在体外模拟了自然进化的过程 奠基阶段：20 世纪80 年代建立了一种在基因水平上、用非合理设计方法改造酶 分子的新思想 发展阶段：20 世纪末期易错PCR 和DNA 改组方法被成功开发，标志着酶分子定向进化技术的成熟 如何使酶分子定向进化? 定向进化=随机突变+正向重组+选择或筛选 三、酶分子定向进化的基本策略和方法 定向进化的基本策略 一般而言，定向的分子进化有三种方法： （1）连续随机突变继之筛选出最佳改进的单一突变体，使每个循环含1-2 有益 突变的积累。 （2）随机突变继之筛选两个或更多的改进的突变体重组，使有益突变组合并消 除有害突变。 （3）同源基因顺序重组(族改组) 产生功能嵌合蛋白质，并且允许一步完成许多 有益突变的组合，包括非累加突变。 定向进化的两个重要环节 多样性基因文库的构建 文库中所期望的进化酶的挑选 定向进化的基本过程 酶定向进化通常分3步进行： 通过随机突变和(或)基因体外重组创造基因多样性 导入适当载体后构建突变文库 通过灵敏的筛选方法，选择阳性突变子。这个过程可重复循环，直至得到 预期性状的酶 定向进化的基本方法 无性进化 易错PCR、定点饱和突变、化学诱变剂介导的突变、致突变株产生随机突变 和随机寡核苷酸突变等 有性进化 DNA 改组（DNA shuffling）、外显子改组（exon shuffling）、随机引物体外重组法（RPR）、交错延伸法（StEP）等。 易错PCR(error-prone PCR)技术为代表的无性进化
现代生物技术重点整理--最终版本
现代生物技术的组成： 生物技术、基因工程、细胞工程、发酵工程、蛋白质工程、分子进化工程、酶的定向进化、生物工程下游技术 生物技术：是利用生物体系，应用先进的生物学和工程学技术，加工或不加工底物原料，以提供所需的各种产品，或达到某种目的的一门新型跨学科技术 基因工程：用人工的方法把不同生物的遗传物质分离出来，在体外进行剪切、拼接、重组，通过载体将目标基因导入到宿主细胞或个体，从而改变宿主遗传特性或获得基因表达产物的技术 细胞工程：是指以细胞为基本单位，在体外条件下进行培养，繁殖，或按人们的需求设计改变细胞的某些生物学特征，从而获得某些有用的物质，或改良生物品种和创造新品的技术 发酵工程：利用生物细胞的某种特性，通过现代化工程技术手段进行工业规模化生产人类所需产品的技术 蛋白质工程：是以蛋白质结构，功能研究为基础，运用生物化学，分子生物学，遗传工程的方法，借助计算机信息处理技术的支持，从改变或合成编码蛋白质的基因入手，定向的改造天然蛋白质或设计全新的人工蛋白质分子，使之具有特定的结构性质和功能，能更好的为人类服务的一种生物技术 分子进化工程：是在试管或实验室中模拟生物分子的进化，使长期的自然进化在实验中短期能实现 酶的定向进化：是在试管中模拟自然进化过程的人工进化策略，利用酶基因的突变或同类酶基因片段的重组，构建某个酶的随机基因突变库，通过基因操作的方法使这些基因在微生物在表达，人工控制条件筛选出人们所需的酶生物工程下游技术：指从基因工程中获得的动，植物和微生物的有机体或器官上，从细胞工程，发酵工程和酶工程产物中把目标化合物分离纯化出来，使之达到商业应用的目的的过程 酶工程:是利用酶，细胞器或细胞所具有的特异催化功能，或通过对酶的分子结构修饰或改造以改善酶的特性，借助于生物反应器和工艺优化，有效的发挥酶的催化特性生产人类所需产品的技术 ①获得目的基因②将目的基因与载体连接形成重组DNA ③将重组DNA导入受体细胞④筛选出能表达目的基因的受体细胞 基因工程的工具酶： 基因工程操作中，作为工具对基因进行切割和拼接等操作的酶，到目前为止，常用工具酶共300多种工具酶的分类：限制性内切酶、连接酶、聚合酶、碱性磷酸酶、逆转录酶 限制性内切酶：内切核酸酶中能够识别ＤＮＡ分子上某些特定的核苷酸序列并且将其切开的酶，称为限制性内切酶有三种：Ⅰ型限制性内切酶Ⅱ型限制性内切酶Ⅲ型限制性内切酶 I型限制性内切酶：是多聚体蛋白，具有切割DNA的功能，作用时需要ATP、Mg2+和S-腺苷蛋氨酸的存在 II型限制性内切酶：是一类分子量较小的单体蛋白，作用时仅需要Mg2+存在即可维持活性，它可在特殊位点切割DNA，产生具有黏性末端或其他形式的DNA分子片段。EcoRI是最早发现的II型限制性内切酶III型限制性内切酶：识别一定的位点，但切割位点通常在识别位点一侧24bp-26bp处 I型限制性内切酶和III型限制性内切酶的切点不固定，不能产生可利用的DNA片段。II型限制性内切酶具有控制和预测的位点特异性切割的性质，并且产生固定的DNA片段。基因工程所用的限制性内切酶都是II型限制性内切酶II型限制性内切酶的识别特点和切割特性：①II型限制性内切酶识别序列的长度，一般为4-8个碱基，最常见的为6个碱基；②其识别位点一般都是回文结构；③产生不同的末端：黏性末端、平齐末端 黏性末端：限制性内切酶错位切割DNA双链而形成的互补的单链末端（双链DNA中没有配对的碱基末端） 平齐末端：有些限制性内切酶在同一位点平齐切割DNA两条链，而形成两端平整的DNA分子 同裂酶：是指来自不同有机体但识别和切割相同DNA序列的酶 同尾酶：来源不同，识别序列不同，但切割DNA分子后产生的黏性末端相同 杂种位点：由一对同尾酶分别产生的黏性末端共价结合形成的位点。一般不能被原来的任何一种同尾酶识别 限制性内切酶的主要用途： ①在特异性位点上切割DNA，产生特意新限制性内切酶切割的DNA片段②建立DNA分子的限制性内切酶物理图谱 ③用限制性内切酶切出相同的黏性末端，以便重组DNA ④构建基因图库 DNA聚合酶：以DNA为模板，将DNA由5’端点开始复制到3’端的酶。 常用：大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（Klenow片段）、耐热DNA聚合酶、逆转录酶（依赖于RNA的DNA聚合酶）、T4噬菌体DNA聚合酶、 T7噬菌体DNA聚合酶及其改造的测序酶 Klenow片段作用：①补平限制性内切酶切割DNA所产生的3’凹端②以（32P）标记的dNTP补平3’凹端，可对DNA分子进行末端标记③对DNA分子的3’突出尾进行末端标记④在cDNA克隆中，用于 合成cDNA第二链⑤应用双脱氧链末端终止法进行DNA测序 耐热DNA聚合酶的作用：①DNA测序②通过聚合酶链式反应对DNA分子的特定序列进行体外扩增