分子定向进化技术简介
第八章酶分子的定向进化概要
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三、发展阶段
易错PCR(error-prone PCR)和DNA改组方 法成功开发标志着酶分子定向进化技术的成 熟。 在酶分子的定向进化改造中，易错PCR和 DNA改组技术配合使用通过随机突变和优势 重最早使用的载体系统，在载体本身的设计方面
已经相当成熟。 优点：
插入片段的载容量大，适合于大片段的克隆。 感染效率高、鉴定容易，有较好的质量控制指标。 基因质量高、代表性好，稳定性好，适合长期
▪ 酶分子的定向进化（directed evolution）即属于 蛋白质的非合理设计。
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三、发展方向
酶催化的精确性和有效性往往并不能满足通常的工业 化要求，天然酶通常缺乏有商业价值的催化功能及其 他性质。因此，对天然酶分子水平上的改造，显得十 分重要。
酶分子仍具有巨大的进化潜力，是酶的体外定向进化 的基本先决条件。
关于外显子在蛋白质进化中的作用有两种观点：
“原生内含子”假说：认为当前所有的蛋白质都 经过外显子改组；
“后生内含子”假说：认为外显子改组仅出现在 真核细胞中，以提高这些生物基因的韧性。
两种假说都承认外显子改组是蛋白质进化的重要 机制，因此人为模拟此自然进化过程定向进化酶 分子将是获得新酶的颇具吸引力的途径。
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七、突变库的构建及应用（一）构建理想的基因要考虑的因素1.基因的质量
（1）基因的代表性中包含的DNA分子应能完整地反映来源基因
（2）突变基因片段的序列完整性中重组或突变DNA片段应尽可能完整地反映出天然 基因的结构。
分子定向进化
分子定向进化是指模仿自然进化过程的策略，通过人为操作实现分子的改造。
这种进化方法无需预先了解蛋白质的结构和作用机制，即可获得具有特定功能或全新功能的蛋白质或DNA。
定向进化通常从靶基因或一组相关家族基因或DNA 开始，通过突变或重组等手段创建分子的多样性，然后对多样性文库进行筛选，以获得具有新功能的基因或DNA。
定向进化可以在试管中模拟达尔文进化过程，按需施加选择压力，以筛选出具有期望特征的蛋白质，从而在分子层面上实现模拟进化。
这种方法已被广泛用于改善蛋白质性能，比如改进蛋白质药物的稳定性、半衰期、免疫原性，开发酶的新底物利用以及改进或拓展新的代谢途径等。
定向进化常用的策略包括易错PCR技术，这种方法对于建立任意核苷酸序列文库或在表达及筛选过程引入突变同样有用。
酶分子定向进化技术
酶分子定向进化技术嘿，咱今儿个来聊聊酶分子定向进化技术！这玩意儿可神奇啦！就好像是在酶的世界里玩一场超级大变身的游戏。
想象一下啊，酶就像是一个个有着特殊技能的小工人，它们在我们身体里或者各种化学反应中忙碌地工作着。
但是呢，有时候这些小工人的技能还不够厉害，或者我们想要它们有更特别的本事。
这时候，酶分子定向进化技术就出马啦！它就像是一个神奇的魔法师，能对这些酶小工人进行改造。
通过一些特别的手段，让酶不断地变化、进化，变得越来越符合我们的要求。
这可不是随便搞搞哦，这是一门非常精细的技术呢！比如说，我们可以让酶变得更耐热，这样在一些高温环境下它也能照样好好工作。
或者让它对某些特殊的物质反应更灵敏，就像是给它装上了一双超级敏锐的眼睛。
这就好比是训练运动员一样，我们要让酶经过各种挑战和磨练，才能变得更强更厉害。
而且啊，这个过程可不是一帆风顺的，有时候会遇到各种困难和挫折呢。
可能进化出来的酶并不是我们最想要的那个样子，那就得重新再来，不断尝试。
但正是因为有了这样的技术，我们才能让酶更好地为我们服务呀！它可以应用在很多领域呢，像制药啦、化工啦，甚至在农业上都能发挥大作用。
你想想看，要是没有酶分子定向进化技术，那我们得错过多少好东西呀！那些原本很难实现的化学反应，现在因为有了进化后的酶变得轻而易举。
这不是很神奇吗？酶分子定向进化技术真的是打开了一扇通往新世界的大门，让我们看到了更多的可能性。
它就像是在黑暗中点亮的一盏明灯，指引着我们不断前进。
我们可以创造出更高效、更有用的酶，让它们为我们解决更多的难题。
所以说呀，酶分子定向进化技术可真是个宝贝！它让我们的生活变得更加丰富多彩，也让科学技术不断向前发展。
咱可得好好珍惜这个神奇的技术，让它为我们创造更多的奇迹呀！这难道不是很值得我们去深入研究和探索的吗？你说呢？。
定向进化的方法
定向进化（Directed Evolution）是一种在试管中模拟达尔文进化过程的方法，通过随机突变和重组，人为制造大量的突变，按照特定的需要和目的给予选择压力，筛选出具有期望特征的蛋白质，实现分子水平的模拟进化。
定向进化的基本步骤包括：
1. 随机突变：在DNA或蛋白质序列中引入随机变化，通常通过使用化学诱变剂或逆转录病毒等。
2. 重组：通过将不同突变体进行基因交换或交叉重组，产生新的变异。
3. 选择压力：根据特定需要和目的，对变异体进行选择，通常通过特定环境下的生存测试或特定酶活性的测定等。
4. 筛选：从大量突变体中筛选出具有期望特征的变异体，通常通过克隆筛选或表型筛选等方法。
定向进化可以在短时间内对蛋白质进行大量改造，是一种非常有效的改善蛋白质性能的方法。
它已经在医药、工业和农业等领域得到广泛应用，例如开发新的药物、生物催化剂和农作物品种等。
酶工程_酶分子定向进化.
部分DNA Shuffling技术的研究成果
类 型 示 例 蛋 白 绿色荧光蛋白 重组蛋白RecA 抗 体 人源抗体 特 性 荧光强度 重组率 亲和性
生物的自然进化
进化过程：
突变→自然选择→遗传后代
进化结果：
基因多样性：为完成同一功能所表现出的
多个 基因或同一个基因 (同源性) 代谢途径的多样性：同样产物，多条途径 代谢产物的多样性：同一底物，不同产物
生物多样性：整个生态系统中的生物
酶的定向进化
• 酶分子的合理设计(rational design)
提高耐热性
易于观察的菌落表型（如菌落颜色等）
营养缺陷型的辅助筛选
噬菌体展示、细胞表面展示
根据所需要的胞表面）的表现特征进行筛选，获得提高目的底 物亲和力的突变子。减少筛选工作量突变→大的突变子库→小的突变子库→ 单克隆
Nhomakorabea• 酶分子的定向进化(directed evolution)
酶的合理 设计
体外定向进化的意义
• 理论上，蛋白质分子蕴藏着很大的进化潜力， 很多功能有待于开发，这是酶的体外定向进化 的基本先决条件。 • 所谓酶的体外定向进化，又称实验分子进化， 属于蛋白质的非合理设计，它不需事先了解酶 的空间结构和催化机制，通过人为地创造特殊 的条件，模拟自然进化机制(随机突变、重组 和自然选择)，在体外改造酶基因，并定向选 择出所需性质的突变酶。 • 酶的体外定向进化技术极大地拓展了蛋白质工 程学的研究和应用范围，特别是能够解决合理 设计所不能解决的问题，为酶的结构与功能研 究开辟了崭新的途径，并且正在工业、农业和 医药等领域逐渐显示其生命力。
What happens after DNA shuffling
酶体外定向进化技术及其发展
酶体外定向进化技术及其发展酶的定向进化是20世纪90年代初兴起的一种蛋白质工程的新策略，近年来发展迅速。
酶能催化各种各样的化学反应，可使需要几天几个月甚至几年时间完成的转化在几分钟甚至几秒钟内完成，能催化化学方法难以完成的反应，如构象的改变等。
同时，它无毒无害，对环境没有污染，在环境问题日益严重的今天，酶的应用显得至关重要。
1 概述酶的体外定向进化又称蛋白质分子定向进化，是蛋白质工程的新策略。
简单来说，就是在事先不了解酶的空间结构和催化机制的情况下，在实验室中通过模拟达尔文自然进化过程，让目标酶分子在预先设计好的道路上快速进化，获得有价值的非天然酶。
定向进化是随机突变和选择的结合，随机突变是人为控制某些条件改变而引发的。
后者虽相当于环境，但只作用于突变后的分子群，起选择预期方向的突变、排除其他方向突变的作用，整个进化过程是在人为控制下进行的。
定向突变使在自然选择条件下需几百万年乃至上亿年才能完成的进化过程，缩短到几年、几个月，甚至更短的时间，加速了酶的进化过程。
目前，该方法主要应用于提高酶的稳定性、酶活性、对有机溶剂的耐受性，扩大底物的选择性，改变光学异构体的选择性等方面。
在目前已发现的8 000多种酶中，真正能够进行大规模生产和应用的商品酶并不多，主要原因是天然酶的性质与生产环境，例如高温、高压、有机溶剂、极端pH等的要求相差甚远。
天然酶的底物选择性等性质难以满足对蛋白酶的需求。
酶的定向进化技术是酶工程学研究的有效工具，该技术的发展使酶应用于工业生产成为可能。
2 酶体外定向进化的常用方法2.1 易错（error-prone）PCR易错PCR技术是指采用Taq酶进行PCR扩增目的基因时，通过调整反应条件，比如提高镁离子浓度、加入锰离子等方式改变体系中4种dNTP的浓度等，改变Taq酶的突变频率，从而向目的基因中引入随机突变构建出突变体库，并从中选择或筛选出所需要的突变体。
由于在实验中仅经过一次易错PCR扩增，所以往往很难得到所需的突变，由此而产生了连续易错PCR扩增技术，即一次PCR获得的扩增基因作为下一次的目的基因进行操作，连续多次进行上述PCR过程，直至获得突变显著的结果基因。
蛋白质分子的定向进化
自由能
氨基酸序列与蛋白质空间结构的关系研究源于美 国生物化学家安芬森（C.Anfinsen）。 1961年，他研究了核糖核酸酶的去折叠和重折叠 过程，发现在相同的环境中去折叠的蛋白质都会 恢复到原来的空间结构，认为蛋白质链会以自由 能最低的方式形成三维结构，由此推测蛋白质的 折叠密码隐藏在氨基酸排序中，即所谓的安芬森 原则：蛋白质一级排序决定三维结构。 因为“对控制蛋白质链折叠原理的研究”，安芬 森获得1972年诺贝尔化学奖。
交错延伸PCR
交错延伸(stagger extension process, StEP)PCR是在PCR 反应中把常规的退火 和延伸合并为一步， 缩短其反应时间，从 而只能合成出非常短 的新生链，经变性的 新生链再作为引物与 体系内同时存在的不 同模板退火而继续延 伸。此过程反复进行， 直到产生完整的基因 长度。
E（Glu）G(Gly)
Carlsberg型 S(Ser)
A(Ala)
噬菌体展示技术(Phage Display)
原理：噬菌体展示技术是将多肽或蛋白质的编码基因或目 的基因片段克隆入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置， 在阅读框正确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下， 使外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表达，融合蛋白随子代 噬菌体的重新组装而展示在噬菌体表面。被展示的多肽或 蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，以利于靶 分子的识别和结合。肽库与固相上的靶蛋白分子经过一定 时间孵育后，洗去未结合的游离噬菌体，然后以竞争受体 或酸洗脱下与靶分子结合吸附的噬菌体，洗脱的噬菌体感 染宿主细胞后经繁殖扩增，进行下一轮洗脱，经过3轮～5 轮的“吸附-洗脱-扩增”后，与靶分子特异结合的噬菌体 得到高度富集。所得的噬菌体制剂可用来做进一步富集有 期望结合特性的目标噬菌体。
定向进化的原理和步骤
定向进化的原理和步骤•定向进化的原理是利用人工手段产生基因多样性和选择压力，从而筛选出具有期望特征的蛋白质或核酸。
•定向进化的步骤一般包括以下几个方面：o选择初始目标蛋白或核酸：根据研究目的和需求，选择一个具有潜在功能或改造空间的蛋白或核酸作为进化的起点。
o构建突变体文库：利用不同的方法对目标蛋白或核酸的编码基因进行突变或重组，创造出大量的序列变异，形成一个多样性的文库。
突变或重组的方法可以分为随机进化、半理性进化和理性进化三种策略，根据对目标蛋白或核酸的结构和功能信息的不同程度，选择合适的方法。
o表达和筛选突变体：将突变体文库导入合适的表达系统，使之转化为蛋白或核酸，并通过高效的筛选方法，从文库中挑选出具有改进或新颖特征的突变体。
筛选方法可以根据目标特征的不同，选择不同的指标和条件。
o重复进化过程：将筛选出来的优良突变体作为下一轮进化的模板，重复上述步骤，直到达到预期的目标或无法继续改进为止。
定向进化的应用和前景•定向进化是一种有效的改造和创造生物分子功能的方法，它在生物催化、生物医药、合成生物学等领域有着广泛的应用和前景。
•在生物催化领域，定向进化可以用于改善或创造新型的酶催化剂，提高其活性、稳定性、特异性、耐受性等性能，从而实现高效、环保、经济的生物转化过程。
例如，通过定向进化，人们已经成功地开发了一些具有工业价值的酶催化剂，如抗溶血素B、绿色荧光蛋白、聚合酶等。
•在生物医药领域，定向进化可以用于改善或创造新型的药物分子，提高其效力、选择性、安全性、递送性等性能，从而实现更有效、更个性化、更靶向的治疗方案。
例如，通过定向进化，人们已经成功地开发了一些具有临床价值的药物分子，如抗体、疫苗、基因治疗载体等。
•在合成生物学领域，定向进化可以用于改善或创造新型的生物模块，提高其功能、可靠性、兼容性等性能，从而实现更复杂、更灵活、更智能的人工生命系统。
例如，通过定向进化，人们已经成功地开发了一些具有创新意义的生物模块，如开关、计数器、振荡器等。
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分子定向进化技术
自然进化
分子定向进化
生物在漫长的时 间里经过自发突变 (突变与重组)，通 过自然选择，逐渐 形成了多样性的生 物。
自发、不定向、自然选择、慢
基因在短时间通过 人为引发突变，经 过人工筛选，形成 满足人们需要的新 功能或者优良性能 生物物质(酶蛋白)。
人为、定向、人工选择、快
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分子定向进化技术
一、分子定向进化技术的定义
分子定向进化(molecular directed evolution)是在分子水平研究所需生物的 特定基因或蛋白质，是在体外模拟突变、 重组和选择的自然进化机制，使进化朝 着人们需要的方向发展其实质，是达尔 文进化论在分子水平上的延伸和应用。
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分子定向进化技术
二、分子定向进化技术的过程原理
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分子定向进化技术
质粒载体系统
优点较小，含有 长片段的重组克隆的群体扩增过程中容易 丢失、转化效率普遍较低，不易长期保存。
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分子定向进化技术突变体基因的筛选特点：筛选方法必须灵敏，可借助相关仪器 实现高通量筛选，一般根据目的基因表达的 靶蛋白选择筛选的方法
分子定向进化技术
molecular directed evolution
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分子定向进化技术
主要内容
1 分子定向进化技术的概述及定义 2 分子定向进化技术的原理 3 分子定向进化技术具体过程 4 分子定向技术的应用及展望
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分子定向进化技术
概述
人们试图利用结构生物信息学和定 点突变技术对蛋白质进行合理的改造， 这些方法难度较大且要在了解蛋白质的 三维空间的基础上才能进行。而分子定 向进化技术是在不需了解相关蛋白的三 维空间结构的情况下在体外模拟自然进 化的过程(随机突变、重组和选择)，使 基因发生大量变异，并定向选择出所需 性质或功能的蛋白。
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分子定向进化技术
在TaqDNA聚合酶催化的PCR反应体 系中加入一定量的Mn2+替代天然的辅助 因子Mg2+，由于TaqDNA聚合酶缺乏校 对活性(3’-5’外切酶活性)，其错配率会 大大增加，通常可以达到每千碱基对1 个突变左右。 可以通过调节核苷酸、酶、 镁离子等 的用量，并加入锰离子等来控制错配的 程度。
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分子定向进化技术
1：CPC 2: 7-ACA 无突变的PYG232与 突变的PYG235-50 在相同条件下转化 CPC能力的高效液 相色谱图 CPC标准品 7-ACA标准品
PYG232无突变
PYG235-50突变
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分子定向进化技术
近年来，分子定向进化技术研究和 应用的领域逐渐扩大，涉及基因治疗、 医学诊断、食品和化学工业等各方面。 随着各种新型突变技术和新型检测系统 的出现，分子定向进化技术研究将向纵 深发展。
戊二酰基-7-氨基头孢烷酸 （GL-7-ACA)
头孢C氨基酰化酶
7- 氨基头孢烷酸(7-ACA)
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分子定向进化技术
易错PCR 对CPC 酰化酶进行无性突变
将易错PCR所得到的基因ecs与适宜的载体连接
突变重组子的初筛与复筛
易错突变子的结果分析
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分子定向进化技术
用易错PCR，用不同浓度的Mg2+ 和Mn2+，应 用低保真DNA聚合酶，以一定的频率向氨基酰化酶 基因(ecs)中引入随机突变。由于希望获得错配的ecs 基因序列，因此采用了Mg2+ 浓度7.5 mmol/L、 Mn2+ 浓度0.15 mmol/L的条件，此时仍能获得较完 整的单一PCR 条带。更低的浓度可能没有发生突变； 若Mg2+ 或Mn2+ 浓度更高，PCR 条带不够清晰。
利用PCR过程中出现的碱基错配，
对特定基因进行随机诱变的技术。
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分子定向进化技术
向PCR反应体系中引入突变的方法： ◆向反应体系中掺入核酸类似物(如次 黄嘌呤核苷酸) ◆限制其中一种核苷酸的用量，使聚合 酶优先选择其他三种，从而增加错配 率。 ◆通过引物5’端引入错配碱基，插入或 缺失一个或多个碱基。这种突变方法 是靶向的，突变发生在DNA模板上预先 确定的位置。
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分子定向进化技术
3.酶制剂药物方面的应用
主要是对酶制剂药物进行分子改造，主要提高 其活性和稳定性
4.抗生素生产的相关限速酶活力方面提高
如各种抗生素合成路径中的关键酶活性的提高， 从而增加相应物质产物的产量，这一过程可以单 独使用易错pCR技术也可以结合DNA重组技术进 行分子定向进化。
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分子定向进化技术
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分子定向进化技术
3.噬菌体展示技术： 外源蛋白以融合形式与噬菌体的外壳 蛋白共同表达于噬菌体表面,经过“吸附— 洗脱—扩增”过程，可筛选并富集外源肽， 进而研究其功能。 4.流式细胞计数法： 细胞经荧光染色后，通过高速流动系 统，排成单行，逐个通过流式细胞计数仪 进行测定。
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分子定向进化技术
1. DNaseI产生随机片段；2. 随机片段变性；3. 随机片 段复性；4.延伸(重复2-4步)
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分子定向进化技术
几种不同突变方法产生的突变积累的情况比较
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分子定向进化技术
随机引物体外重组法(RPR) RPR 法是用一套随机序列引物,产生 互补于模板不同位点的短DNA片段库(由于 碱基错配,这些短DNA片段含有少量的点突 变),然后进行类似于板、不 受模板长度限制。
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分子定向进化技术
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分子定向进化技术
DNA改组技术(DNA shuffling)
又称有性PCR，指DNA分子的体外重组， 是基因在分子水平上进行有性重组。通 过改变单个基因(或基因家族)原有的核 苷酸序列，创造新基因，并赋予表达产 物以新功能。
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分子定向进化技术
●从突变体基因库中分离出来
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分子定向进化技术2.突变基因的构建 构建基因首先考虑的因素： 文
分子定向进化技术
突变体基因的载体系统 噬菌体载体系统 优点：插入片段的装载容：可选用的筛选方法较有限
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分子定向进化技术
通常通常一个典型的定向进化技术涉及三步:
1. 通过随机突变和(或)基因体外重组创造基 因多样性，即将目的蛋白的编码基因进行 突 变或是随机重组产生一个含有多个基因 变子。 这个过程可重复循环，直至得到预期性状的酶。
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分子定向进化技术
三、分子定向进化的具体选择策略
1.基因的体外突变 无性进化： ◆易错PCR； ◆物理、化学方法介导的随机诱变； ◆由致突变菌株产生的随机突变。 有性进化： ◆ DNA改组技术； ◆随机引物体外重组法； ◆重叠延伸法。
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分子定向进化技术
易错PCR(Error Prone PCR)
(1)噬菌体展示技术(Phage Display) 突变DNA片段插入噬菌 体或噬菌粒的基因组中，以 融合蛋白的形式与噬菌体的 外壳蛋白共同表达于噬菌表 面，经过“吸附—洗脱—扩 增”能够特异吸附产物的层 析柱,带有活性蛋白的噬菌体 被分离出来。
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分子定向进化技术
细菌细胞表面展示技术(Bacterial CellSurface Display)
的DNA片段用脱氧核糖核酸 酶I随机切割 ●得到的随机片段经过不加引 物的多次PCR循环
●在PCR循环过程中，随机
片段之间互为模板和引物进 行扩增，直到获得全长的基 因，这导致来自不同基因片 段之间的重组。
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分子定向进化技术
基因家族改组技术(family shuffling)
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分子定向进化技术
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分子定向进化技术
连续易错PCR(Sequential error-prone PCR)
将第一次PCR扩增 的有益突变作为 下一次PCR扩增的 模板，这样连续 反复随机诱变， 使得每次获得的 少量突变进行积 累而得到更重要 的有益突变。
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分子定向进化技术
重叠延伸PCR(SOE-PCR)
重叠延伸PCR 技术由于使用了具有 互补末端的引物，使PCR 产物形成 了重叠链，从而在随后的扩增反应 中通过重叠链的延伸，将不同来源 的扩增片段重叠拼接起来。可简单 迅速的将两个DNA 片段连在一起， 用于融合基因的构建。
原理：
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分子定向进化技术
a
3，
A基因
5， ， 3
B基因பைடு நூலகம்c
5，
●
●
5，
5， 3，
b
●
d
● ● ● ● ● ● ●
分子定向进化技术
特点
a.不需要设计酶切识别位点，可将不同来 源的DNA识别位点连接起来构建融合基 因； b.不需要经过接头处理连接酶，利用PCR 拼接基因； c.可进行高保真定点、定位突变，并且突 变和重组可以同时进行； d.容易产生随机突变，需要对PCR反应条 件进行优化。
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分子定向进化技术
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有细菌和噬菌体表面展示技术，结合荧光激 活细胞筛选仪(Fluo．rescence Activated Cell Sorting，FACS)或流式细胞仪(flow cytometry)是 非常有效的高通量筛选方法 。该技术是目前惟一 能够定量检测单细胞水平和大量突变体酶催化活 性的方法。还能够决定突变体库中每个克隆的功 能特性 。
□活体筛选法; □噬菌体展示法； □细胞表面展示法； □核糖体展示技术；
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分子定向进化技术
几种高通量筛选的方法：
1.突变微生物分离法： 琼脂板涂布法在特殊条件下培养突变 菌，通过宿主菌的生长情况、培养基颜色、 特定反应的出现等判断是否具有目的基因。
2.微球细胞固定法与数字成像系统结合法： 将单个细胞附着在单个固体珠上，对 突变体进行分离和筛选。 。
头孢菌素C(CPC) 和7- 氨基头孢烷酸(7ACA)分别是工业半合成生产头孢菌素类 抗生素的重要前体和中间体，由于在顶头 孢霉中中直接生产7-ACA 也存在酶表达和 菌株培养最适条件的矛盾，因此，采用易 错PCR技术对CPC 酰化酶进行定点突变， 从而提高CPC的转化效率。