一种新的 DNA 分子克隆方法

中国科学: 生命科学

2011年 第41卷 第9期: 722 ~ 729 SCIENTIA SINICA Vitae

英文引用格式: Huang Y, Tao Y, Zhang W L, et al. A new method for DNA molecular cloning. SCIENTIA SINICA Vitae, 2011, 41: 722–729, doi: 10.1360/052011-309

《中国科学》杂志社

SCIENCE CHINA PRESS

论 文

一种新的DNA 分子克隆方法

黄媛, 陶颖, 张文露, 黄爱龙, 胡接力*

重庆医科大学, 感染性疾病分子生物学教育部重点实验室, 重庆 400016 * 联系人, E-mail: hujieli1977@

收稿日期: 2011-05-13; 接受日期: 2011-08-25 国家自然科学基金(批准号: 81000732)资助项目 doi: 10.1360/052011-309

摘要 DNA 分子克隆是基本的分子生物学实验技术, 传统的分子克隆方法大多需经过酶切链接过程, 但在某些情况下, 没有合适的酶切位点往往会成为阻碍克隆进行的障碍. 本文描述了一种新的分子克隆方法, 称为不依赖酶切和链接的分子克隆(RLIC). 利用RLIC, 将3种不同大小的DNA 片段克隆到3种不同载体, 证明了这种方法的有效性和可靠性. 由于该方法不受限制性酶切序列限制, 省去了酶切连接步骤, 因此具有很大的灵活性和简便性, 在分子生物学研究方面有广泛应用前景.

关键词 DNA 分子克隆 方法

DNA 分子克隆是指将一段目的DNA 分子片段与特定载体DNA 分子连接, 形成重组DNA 分子. DNA 分子克隆是基本的分子生物学实验技术, 广泛用于生物学、医学等各个领域. 传统的DNA 分子克隆方法主要包含以下步骤: 目标DNA 分子制备、目标分子与载体酶切、连接、转化及筛选.

从分子克隆技术建立之初起, 针对传统DNA 分子克隆方法的改进就一直在进行, 其中很多技术改进已转化为商品化克隆试剂盒, 如T-A Cloning [1], TOPO Cloning, Gateway [2,3]技术等. 这些新技术在不同程度上简化了克隆过程, 提高了克隆效率, 也能满足大部分研究需求. 但是对于一些问题, 传统克隆方法和新技术仍不能很好地解决. 例如, 可能希望在已克隆了一个基因(以gene 1指代)的真核表达载体上再克隆另一个基因(如检测标记EGFP 或筛选抗性标记等, 以gene 2指代), 且gene 2需使用独立启动子来单独表达而非融合表达. 此时, 不能再选择该载体的多克隆位点来克隆gene 2. 因为, 第一, 可能已经没

有合适的酶切位点; 第二, 即使有合适的酶切位点, 在该部位插入gene 2将扰乱gene 1的表达. 理想的情况是, 在第一个基因表达框架之外(如polyA 序列下游)的载体骨架上, 找到合适的酶切位点, 插入gene 2表达片段(包括启动子、基因及转录终止信号). 然而, 在大多数商业化载体中, 往往很难找到合适的位点来进行这类操作.

如果有一种克隆方法, 可以不受插入部位的序列限制, 即不用限制性切割, 便可以解决上述问题. Aslanidis 和de Jong [4]建立过一种非连接依赖性克隆方法(ligation-independent cloning of PCR products, LIC-PCR), 基本原理是: 在PCR 片段末端及PCR 扩增的线性载体末端分别加上12 bp 核苷酸, 利用T4 DNA 聚合酶的外切活性, 产生末端为单链的上述两种分子, 由于这两种分子末端互补, 退火后转化可得到重组分子. Rashtchian 等人[5]将此方法进行了改进, 使末端12 bp 核苷酸含dUMP, 从而可以用尿嘧啶DNA 糖基化酶(UDG)进行特异切割, 便于产生单链

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末端. 各种LIC 方法本质上与T-A 克隆类似, 它们都需要线性化载体, 区别在于线性化载体及PCR 片段末端互补单链长度不同, T-A 克隆时分子末端仅有一个碱基互补, 而LIC 中, 分子末端具有更长的互补单链[6], 这使得分子间退火后无需使用DNA 连接酶. 虽然LIC-PCR 具有序列非限制性特点, 但此类方法均需获得线性化载体, 并且需要将载体和待克隆分子末端单链化, 步骤相对复杂繁琐. 本文描述了一种新的DNA 分子克隆方法, 它具有序列非依赖性特点, 同时操作较简便, 应用灵活, 可作为分子克隆的一种新选择.

1 材料与方法

1.1 材料

人乙型肝炎病毒(HBV)复制质粒PCH9/3091(约6.1 kb)由德国Nassal 实验室构建[7], 中国人民解放军第三军医大学西南医院兰林博士赠送. PCH9/3091含有HBV 1.1×全基因组DNA, 由CMV 启动子驱动HBV 前基因组RNA(pgRNA)转录, 该质粒在转入肝源性细胞后可支持HBV 复制. pEGFP-N1, pEGFP-C1 (Clontech 公司)和pEGFP-N1-SM22为本实验室保存[8]. pEGFP-N1-SM22以pEGFP-N1为骨架, 多克隆位点区插入了小鼠SM22启动子(长约2.2 kb). pCDNA3.1-pol 为本实验室构建, 该质粒以pCDNA3.1(Invitrogen)为骨架, 多克隆位点区克隆有HBV 多聚酶基因(pol, 长约2.5 kb). Lenti-GFP 为本实验保存, 该质粒以慢病毒骨架质粒pLentiLox3.7为骨架, 含有EGFP 基因表达框架. HepG2细胞为本实验室保存. PCR 试剂(PrimeSTAR HS)为TaKaRa 公司产品; 胶回收试剂盒为QIAGEN 公司产品; PCR 产物纯化试剂盒为Roche 公司产品; 小量质粒提取试剂盒为Promega 公司

产品; 地高辛标记检测试剂盒(DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit Ⅱ)及转染试剂Fugene HD 为Roche 公司产品; DNAase Ⅰ, 限制性内切酶Sal Ⅰ, Sma Ⅰ, Bgl Ⅱ, Bam H Ⅰ及Dpn Ⅰ均为Promega 公司产品; RNase A 为Merck 公司产品; 本文所用PCR 引物由上海Invitrogen 公司合成, 引物序列见表1.

1.2 方法

(1) 克隆策略. 最初在HBV 体外复制研究中, 希望控制PCH9/3091的转染效率. 共转染荧光表达质粒pEGFP-N1是一种较便于观察的方式, 但由于EGFP 从另一个质粒表达, 通过荧光表达情况来反映PCH9/3091的转染效率可能不太准确. 如果将EGFP 表达框架克隆到PCH9/3091, 则PCH9/3091的转染效率可以通过观察荧光得到更准确的反映. 为达到此目的, 首先需要得到一个完整的EGFP 表达框架, 包括启动子、增强子、EGFP 基因、终止信号, 然后将该片段插入HBV 复制元件以外的质粒骨架适当位置. 完整的EGFP 表达框架可以方便地从pEGFP-N1扩增而获得, 但将该片段插入PCH9/3091的合适位置却颇为困难, 因为在该质粒上没有合适的酶切位点. 为解决该问题, 本研究建立了一种新的克隆策略, 称为不依赖酶切和连接的分子克隆(restriction digestion and ligation-independent cloning, RLIC). RLIC 的基本原理类似于Stratagene 公司的DNA 定点诱变技术(site-directed mutagenesis). 图1(A)所示为Stratagene 定点诱变原理: 设计一对突变引物, 该引物含有一个突变目标碱基(用红色突起表示), 该突变碱基两侧序列与质粒相应位置互补, 此对引物与待突变质粒退火并线性扩增, 产物为带缺刻的环状分子, 该分子转化到感受态菌后被修复, 得到诱变质粒. 图1(B)为本

表1 PCR 引物序列a)

引物 序列(5′→3′)

F pch9-egfp

TCGAATTGATCTGATCAAATTCCG ACCGTATTACCGCCATGCAT

PCH9 EGFP

R pch9-egfp CATACGATTTAGGTGACACTATAG GGACAAACCACAACTAGAATGC

PCH9 EGFP

F cmv CCATTGACGCAAATGGGCGGTA

G R egfp CAGCTCGACCAGGATGGGCACCA

R p-lenti

CGTAGAATCGAGACCGAGGAGAGGGTTA TCACGGTGGTCTCCATGCGACGT pLenti-GFP V5 pol

a) 黑体示引物序列中与载体互补的部分; 下画线示引物序列中与待扩增片段互补的部分