斑蝥水提液体外细胞毒性研究

广东药学院学报　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｕｕｎｇｄｏｎｇ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｆｅｂ．２０１５，３１（１）　

斑蝥水提液体外细胞毒性研究　王计长，徐文雅，郭丽冰，贾真，刘文秀，赵越　（广东药学院中药学院，广东广州５１０００６）　

摘要：目的通过体外细胞培养技术，探讨斑蝥水提液对肿瘤细胞和人正常细胞的增殖抑制作用。方法　将斑蝥水提液作用于人肝癌细胞ＨｅｐＧ．２、人肝癌细胞ＢＥＬ一７４０２、人肺癌细胞Ａ５４９、人正常肝细胞ＬＯ一２、　人胚肾细胞２９３Ａ．采用ＣＣＫ一８法测定斑蝥水提液对上述细胞生长的抑制作用。结果斑蝥水提液对上　述细胞均有明显毒性作用，能抑制细胞的生长增殖，呈量效关系。斑蝥水提液对ＨｅｐＧ．２、ＢＥＬ一７４０２、　Ａ５４９、ＬＯ一２、２９３Ａ细胞的，ｃ　依次为３３ｌ、２８７、５２３、３９７、４４３　ｍＬ。结论斑蝥水提液具有抗肿瘤效果，　体外抗肿瘤的同时对正常肝肾细胞也有毒性抑制作用。　关键词：斑蝥：细胞毒性：ＣＣＫ一８　中图分类号：Ｒ９４４．３９文献标志码：Ａ　ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００６—８７８３．２０１５．０１．０１９　文章编号：１００６—８７８３（２０１５）０１．０ｏ８４．０４　

Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｑｕｅｏｕｓ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｏｆ　Ｍｙｌａｂｒｉｓ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ＷＡＮＧ　Ｊｉｚｈａｎｇ，ＸＵ　Ｗｅｎｙａ，ＧＵＯ　Ｌｉｂｉｎｇ，ＪＩＡ　Ｚｈｅｎ，ＬＩＵ　Ｗｅｎｘｉｕ，ＺＨＡＯ　Ｙｕｅ　（Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ　５　１０００６，Ｃｈｉｎａ）　

Ａｂｓｔｒａｃｔ：０ｂｊｅｃｆｉｖｅ　Ｔｏ　ｓｔｕｄｙ　ｔｈｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｑｕｅｏｕｓ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｏｆ　Ｍｙｌａｂｒｉｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂｏｔｈ　ｔｕｍｏｒ　ａｎｄ　ｎｏｒｍａｌ　ｃｅＢｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｈｅ　ＣＣＫ一８　ａｓｓａｙ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｍｅａｓｕｒｅ　ｔｈｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｑｕｅｏｕｓ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｏｆ　Ｍｙｌａｂｒｉｓ　Ｏｆｆ　ＨｅｐＧ一２，ＢＥＬ一７４０２，Ａ５４９，ＬＯ一２　ａｎｄ　２９３Ａ　ｃｅｌｌｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅ　５０％ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（／Ｃ５０）ｏｆ　ｔｈｅ　ａｑｕｅｏｕｓ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｏｆ　Ｍｙｌａｂｒｉｓ　ｏｎ　ＨｅｐＧ一２，ＢＥＬ一７４０２，Ａ５４９，ＬＯ一２　ａｎｄ　２９３Ａ　ｃｅｌｌｓ　ｗａｓ　３３　１，２８７，５２３，３９７　ａｎｄ　４４３　ｇ／ｍＬ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ　ａｑｕｅｏｕｓ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｏｆ　Ｍｙｌａｂｒｉｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｎ　ｂｏｔｈ　ｔｕｍｏｒ　ａｎｄ　ｎｏｒｍａｌ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ａ　ｄｏｓｅ—ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｉｓ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｄｉｓｐｌａｙｓ　ａｎ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｔｕｍｏｒ　ｃｅｌｌｓ　ａｓ　ｗｅｌｌ　ａｓ　ｔｈｅ　ｌｉｖｅｒ　ａｎｄ　ｋｉｄｎｅｙ　ｎｏｒｍａｌ　ｃｅｌｌｓ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｍｙｌａｂｒｉｓ；ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｉｅｓ；ＣＣＫ一８　

斑蝥因其具有较强的抗肿瘤活性作用，一直是　抗癌药物的研究热点。大多数研究集中于斑蝥素等　脂溶性成分，一直被认为是斑蝥抗肿瘤活性成分的　斑蝥素却不溶于水，但临床应用较多的斑蝥注射液　（艾迪注射液ｌ】　）为斑蝥的水提液，目前对于斑蝥的　水溶性成分的研究一直被忽视，根据文献报道［２。］斑　蝥体内有大量水溶性的结合型斑蝥素，可能以斑蝥　素酸镁、斑蝥素酸钾和斑蝥素酸钙等形式存在，也证　明其可以抑制肿瘤细胞的增殖ｌ４　］，但是否有显著的　抗肿瘤作用并对正常细胞是否也有影响．未见文献　报道。本文旨在通过体外细胞毒活性实验，研究斑　蝥水提液对肿瘤细胞的抑制作用及对正常细胞的毒　性作用。为斑蝥水提液的下一步生物转化的减毒增　效作用研究作准备。　

收稿日期：２０１４—１２—０１　基金项目：国家自然科学基金项目（８１３７４０７２）　作者简介：王计长（１９８８一），男，２０１２级硕士研究生，主要从事中药新剂型与新技术研究，Ｅｍａｉｌ：ｗａｎｇｊｚｌ３＠ｓｉｎａ．ｃｏｎ；通信作　者：赵越，教授，主要从事中药新剂型与新技术研究，Ｅｍａｉｌ：ｚｙｂｍｂｙｌｋ＠１６３．ｃｏｒｎ。　网络出版时间：２０１５—０１＋０８　１５：５４网络出版地址：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／４４．１４１３．Ｒ．２０１５０１０８．１５５４．００１．ｈｔｍｌ　第１期　王计长，等．斑蝥水提液体外细胞毒性研究　８５　１材料　１．１细胞株　人肝癌细胞ＨｅｐＧ．２、人肝癌细胞ＢＥＬ．７４０２、人　肺癌细胞Ａ５４９、人正常肝细胞Ｌ０—２，由广东药学院　生命科学与生命制药学院提供：人胚肾细胞２９３Ａ　由中山大学药学院提供。　１．２药物与试剂　斑蝥为芜青科昆虫南方大斑蝥Ｍｙｌａｂｒｉｓ　ｐｈａｌｅｒａｔａ　Ｐａｌｌａｓ的干燥虫体，购于安国路路通中药　饮片有限公司；胎牛血清（杭州四季青）；ＲＰＭＩＩ６４０　培养液（Ｈｙｃｌｏｎｅ）；０．２５％Ｔｒｙｐｓｉｎ　ＥＤＴＡ（美国　ＧＩＢＣＯ）；ＣＣＫ一８试剂盒（碧云天公司）。　１．３主要仪器　二氧化碳培养箱（ＧａｌａｘｙＳ）；ＳＷ—ＣＪ。１ＧＵ超净工　作台（苏州安泰）；倒置生物显微镜ＢＤＳ２００（重庆奥　特）；ＴＤ３低速离心机（湖南湘仪）；Ｍｏｄｅ１．１６８０酶标　仪（ＢＩＯ．ＲＡＤ）；移液枪（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司）。　

２方法　２．１试药的制备　参考文献［６］，取斑蝥粗粉适量，加２０倍量水　浸泡３０　ｍｉｎ，加热回流提取２　ｈ，冷却、离心，取上层　液体，浓缩成浸膏。与ＲＰＭＩ１６４０培养液混合均匀　并配制成所需的不同给药浓度．０．２２　Ｉｘｍ滤膜过滤　除菌备用，即得含药培养液。　２．２细胞培养　取各种细胞用ＲＰＭＩ１６４０培养液［含１０％（　）　胎牛血清、１００　Ｕ／ｍＬ青霉素和１００　Ｉｘｇ／ｍＬ链霉　素］，置于３７℃、５％（　）ＣＯ，的细胞培养箱中培养。　待细胞生长２～３　ｄ至对数期，弃去旧培养液，ＰＢＳ润　洗，用０．２５％Ｔｒｙｐｓｉｎ．ＥＤＴＡ胰蛋白酶消化，于显微　镜下见细胞间隙增大、胞质回缩变圆即终止消化，去　掉胰酶，加入新的培养液轻轻吹打制成单细胞悬液。　备用。　２．３细胞增殖抑制的测定（ＣＣＫ一８法）　根据不同细胞生长速率，调整细胞浓度８～１２ｘ　１０　／ｍＬ，每孔１００／ｘＬ接种于９６孔板，培养２４　ｈ使　其贴壁后，吸掉旧培养液，加入含不同药物浓度的培　养液１００　ＩＸＬ．并设置对照组（不含药的ＲＰＭＩ１６４０　培养液）、空白组（ＲＰＭＩ１６４０培养液），每组设４个　复孔。置于细胞培养箱培养４８　ｈ后，吸掉旧培养　液，加入１００　ＩｘＬ新培养液和１０　Ｌ的ＣＣＫ．８试剂，　轻摇混匀。继续培养反应１　ｈ后取出，按照ＣＣＫ．８　试剂盒方法，以６３０　ｎｍ为参考波长，用ＢＩＯ．ＲＡＤ酶　标仪在波长４５０　ｎｍ处测定吸光度（Ａ）值。计算细　胞抑制率ＩＲ＝（对照组Ａ一实验组Ａ）／（对照组Ａ一空　白组Ａ）×１００％。　２．４统计学处理　采用ＳＰＰＳ　２０．０统计软件，实验数据以元±ｓ表　示。根据细胞抑制率ＩＲ用统计回归方法求半数抑制　浓度ＩＣ　Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。　３结果　３．１　斑螫水提液对各肿瘤细胞的增殖抑制作用　从表１可以看出斑蝥水提液对肝癌细胞ＨｅｐＧ．　２的生长抑制作用在１００—５７０　Ｉｘｇ／ｍＬ范围内与剂　量呈正相关，与对照组比较差异有统计学意义，Ｐ＜　０．０５。其对肝癌细胞ＨｅｐＧ．２的半数抑制浓度，ｃ　＝３３１　Ｉｘｇ／ｍＬ。　从表２可以看出斑蝥水提液对肝癌细胞ＢＥＬ一　７４０２具有明显的抑制作用，呈剂量依赖关系。从不　同给药浓度的抑制率来看，当给药浓度为９６　Ｉｘｇ／ｍＬ　时，对肝癌细胞ＢＥＬ．７４０２有显著的抑制作用；其对　肝癌细胞ＢＥＬ．７４０２半数抑制浓度ＩＣ　。＝２８７　ｇ／　ｍＬ，比对肝癌细胞ＨｅｐＧ一２半数抑制浓度ＩＣ轴＝３３１　Ｉｘｇ／ｍＬ低，提示斑蝥水提液对同种属、同器官来源　但组织学来源不同的肿瘤细胞系敏感性不同。　表１斑蝥水提液对肝癌细胞ＨｅｐＧ－２的抑制作用　Ｔａｂｌｅ　１　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｑｕｅｏｕｓ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｏｆ　Ｍｙｌａｂｒｉｓ　ｏｎ　ＨｅｐＧ一２　ｃｅｌｌｓ（ｎ＝４，２：ｔ：ｓ）　与对照组比较：　Ｐ＜Ｏ．０５。　从表３中可发现斑蝥水提液对肺癌细胞Ａ５４９　的抑制作用与给药浓度呈正相关，具有显著的抑制　效果，其半数抑制浓度ＩＣ　。＝５２３　ｇ／ｍＬ。从图１中　各　值可看出斑蝥水提液对ＨｅｐＧ．２、ＢＥＬ一７４０２、　Ａ５４９　３种肿瘤细胞的敏感性强弱排列：ＢＥＬ一７４０２＞　ＨｅｐＧ．２＞Ａ５４９　表明斑蝥水提液对不同种属细胞敏　感性不同，对人肝癌细胞的敏感性较强。　８６　广东药学院学报　第３１卷　表２斑蝥水提液对肝癌细胞ＢＥＬ一７４０２的抑制作用　Ｔａｂｌｅ　２　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｑｕｅｏｕｓ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｏｆ　Ｍｙｌａｂｒｉｓ　ｏｎ　ＢＥＬ一７４０２　ｃｅｌｌｓ（／２：４，ｘ＋ｓ）　与对照组比较：　Ｐ＜０．０５。　表３斑蝥水提液对肺癌细胞Ａ５４９的抑制作用　Ｔａｂｌｅ　３　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｑｕｅｏｕｓ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｏｆ　Ｍｙｌａｂｒｉｓ　ｏｎ　Ａ一５４９　ｃｅｌｌｓ（ｎ＝４，ｘ＋ｓ）　与对照组比较：　Ｐ＜０．０５。　３．２斑蝥水提液对正常细胞的毒活性作用　从表４、表５可看出．在１７０～８６０　Ｉｘｇ／ｍＬ范围内　斑蝥水提液对人肝细胞ＬＯ．２和人胚肾细胞２９３Ａ　均有一定抑制作用，且呈剂量依赖性。在相同药物　浓度下对人肝细胞ＬＯ一２的抑制作用比人胚肾细胞　２９３Ａ的高，斑蝥水提液对肝细胞的毒性比胚肾细胞　毒性大　表４斑蝥水提液对人肝细胞ＬＯ一２的毒性抑制作用　Ｔａｂｌｅ　４　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｑｕｅｏｕｓ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｏｆ　Ｍｙｌａｂｒｉｓ　ｏｎ　ＬＯ一２　ｃｅｌｌｓ（ｎ＝４，ｘ＋ｓ）　与对照组比较：　Ｐ＜０．０５。　表５斑蝥水提液对人胚肾细胞２９３Ａ的毒性抑制作用　Ｔａｂｌｅ　５　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｑｕｅｏｕｓ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｏｆ　Ｍｙｌａｂｒｉｓ　ｏｎ　２９３Ａ　ｃｅｌｌｓ（ｎ＝４，ｘ＿ｓ）