医疗器械生物学评价第五部分体外细胞毒性试验
腹腔镜手术器械技术审查指导原则(2017年第30号)
附件2第二类腹腔镜手术器械产品注册技术审查指导原则本指导原则旨在指导和规范第二类腹腔镜手术器械的技术审评工作，帮助审评人员理解和掌握该类产品结构、性能、预期用途等内容，把握技术审评工作基本要求和尺度，对产品安全性、有效性作出系统评价。
本指导原则是对腹腔镜手术器械产品的一般要求，审评人员应依据具体产品的特性确定其中的具体内容是否适用，并对注册申报资料的内容进行补充要求。
本指导原则所确定的主要内容是在目前的科技认识水平和现有产品技术基础上形成的，因此，审评人员应注意其适宜性，密切关注适用标准及相关技术的最新进展，考虑产品的更新和变化。
本指导原则不作为法规强制执行，不包括行政审批要求。
但是，审评人员需密切关注相关法规的变化，以确认申报产品是否符合现行法规要求。
一、适用范围本指导原则适用于管理类别为第Ⅱ类，与腹腔镜配套使用、供腹腔手术操作用器械，分类编码为6822。
目前临床与腹腔镜配套使用的手术器械种类繁多，本指导原则适用于与腹腔镜配套的可重复使用的腹腔镜手术器械。
与软性消化道内窥镜配套使用的器械、一次性使用的腹腔镜手术器械则不在本原则中描述。
二、技术审查要点（一）产品名称的要求产品的命名应符合《医疗器械通用名称命名规则》、《医疗器械分类目录》等相关法规的要求，或国家标准、行业标准上的通用名称。
产品名称在通用名称基础上可带有表示用途、使用方式或结构等描述性词语，举例如下：1.腹腔镜手术器械。
2.腹腔镜手术分离钳/抓钳/剪等（用途）。
3.可弯曲腹腔镜手术器械（结构）。
4.重复性使用腹腔镜手术器械（使用方式）。
（二）产品的结构和组成腹腔镜手术器械，通常由穿刺器及其转换器（用于穿透体壁建立手术器械进出通道的穿刺器）；气腹针（用于建立气腹）；分离钳、剪刀、抓钳（用于手术中进行分离组织、剪切组织、抓取组织的各类功能钳）；持针钳、推结器、打结钳、荷包钳、腹壁缝合钳（用于手术缝合操作）；扇形钳、拉钩（用于手术中拨、挡、拉器官、组织，提供更佳手术视野）；施夹器（钳）（用于施放钛夹、结扎夹等）；冲洗吸引器械（用于手术中作内腔冲洗和吸引，保证手术视野清晰）；取物钳、活检钳（用于手术中取出组织、标本、异物）；举宫器（用于举托子宫）；靶式钳（用于夹取吻合器等其他器械配件）；造影钳、穿刺针（用于手术中注液、抽液用）；切开刀（用于切开胆道等组织）；腹腔镜甲状腺手术用的专用注水器、分离器、剥离器等；其他用于腹腔镜手术的操作器械，如圆棒、量棒、引导棒等组成。
药用聚异戊二烯橡胶细胞毒性的研究
橡 胶 工 业CHINA RUBBER INDUSTRY134第68卷第2期Vol.68 No.22021年2月F e b.2021药用聚异戊二烯橡胶细胞毒性的研究刘海洪1，崔 喆1，2，付 鹏1，2*（1.郑州大学 材料科学与工程学院，河南 郑州 450001；2.河南省先进尼龙材料及应用重点实验室，河南 郑州 450001）摘要：以两种不同催化体系合成的药用聚异戊二烯橡胶（IR0307和IR80）为研究对象，分别以质量分数为0.9%的氯化钠注射液和纯化水为浸提介质，在两种浸提条件（在高压灭菌器内于121 ℃下浸提60 min 或在密闭容器内于37 ℃下浸提24 h ）下进行浸提处理，然后采用显微镜观察法和四唑盐比色法测定IR0307和IR80的体外细胞毒性，分析不同浸提条件下IR0307和IR80的细胞毒性反应等级。
在药用聚异戊二烯橡胶生产中，建议控制催化剂的残留量以及对杂质和金属离子的含量和种类，使用洁净的非污染型防老剂和稳定剂。
关键词：聚异戊二烯橡胶；氯化钠注射液；纯化水；浸提；显微镜；四唑盐比色法；细胞毒性中图分类号：TQ333.3 文章编号：1000-890X （2021）02-0134-06文献标志码：A DOI ：10.12136/j.issn.1000-890X.2021.02.0134聚异戊二烯橡胶具有顺式-1，4-结构含量和相对分子质量大、凝胶含量小、纯净、无杂质、透明、有光泽等优点，在医药包装材料和医疗器械配件，如注射液用胶塞、真空采血器胶塞、橡胶垫片、预灌封注射器用橡胶针头护帽和输液器用橡胶肝素帽等中大量应用[1-5]。
市场上流通的药用聚异戊二烯橡胶生产时所用的催化剂主要有齐格勒型催化剂、烷基锂型催化剂和稀土化合物催化剂等。
目前比较典型的药用聚异戊二烯橡胶是美国科腾聚合物有限公司采用烷基锂型催化剂生产的IR0307和广东茂名石化有限公司采用齐格勒型催化剂生产的IR80[6-9]。
医疗器械生物学评价
医疗器械生物学评价医疗器械的生物学评价是医疗器械开发和使用的一个重要环节。
它主要是对医疗器械在生物体内的生物相容性、安全性和有效性进行评估，以确保它对人体没有不良的影响，达到设计预期的治疗效果。
医疗器械的生物学评价通常包括以下几个方面：生物相容性、毒理学评估、细胞毒性、致敏反应、细胞增殖和差异化等。
生物相容性是评价医疗器械在生物体内引起的生物学反应的能力，其中包括局部和全身反应。
局部反应可以是炎症、纤维组织形成和血管新生等，全身反应可以是免疫反应和全身毒性等。
这些反应的评价通常通过动物实验和体外实验来进行。
毒理学评估是评价医疗器械对生物体产生的毒性作用的能力。
这包括急性毒性、亚急性毒性、慢性毒性等。
通常通过动物实验和体外实验，如细胞毒性和基因毒性实验来评估医疗器械的毒性。
细胞毒性是评价医疗器械对细胞的直接杀伤作用和影响细胞功能的能力。
一般通过体外实验来评估医疗器械对细胞的毒性。
致敏反应是评价医疗器械引起的变态反应的潜在能力。
通过动物实验和体外实验，如小鼠皮肤致敏实验和人类淋巴细胞转化试验等来评估医疗器械的致敏性。
细胞增殖和差异化是评价医疗器械对细胞的增殖和分化的能力。
这可以通过细胞培养实验来评估。
医疗器械的生物学评价需要根据不同的器械特性和使用方式来确定具体的评价方法。
通常的评估流程包括：确定评估项目和方法、收集相关数据、分析数据、评价结果和风险分析、确定产品的生物安全性和有效性。
生物学评价结果对于医疗器械的研发和使用具有重要的指导意义。
它可以帮助设计人员选择合适的材料和生产工艺，以及优化设备的结构和功能，来提高医疗器械的生物相容性和安全性。
对于临床使用的医疗器械，生物学评价可以评估其治疗效果和副作用，为临床决策提供依据。
总之，医疗器械的生物学评价是保障医疗器械安全有效的重要环节。
只有通过全面、系统的生物学评价，才能确保医疗器械对人体没有不良的影响，保证其在临床应用中能够发挥预期的治疗效果。
医疗器械生物学试验审评规范
医疗器械生物学试验审评规范生物学试验是医疗器械评价的重要组成部分，它能够评估医疗器械对人体生物环境的影响，包括生物相容性、感染性、毒性等方面。
医疗器械的生物学试验审评规范（2024版）主要分为试验前准备、试验设计、试验实施、数据分析和试验报告等五个部分。
首先是试验前准备。
在进行生物学试验之前，需要进行试验方案的制定，包括试验的目的、方法、所需的设备和试剂等。
试验前准备还包括试验对象的选择，试验对象可以是动物模型或体外细胞模型。
对于选择动物模型，需要考虑其与人体的相似度，以及其对器械的反应和耐受性。
其次是试验设计。
试验设计应该符合科学原理和伦理要求。
在试验设计中，需要明确试验组和对照组的设置，以及每组的样本数量。
对于内植物械，还需要考虑试验时间的选择，以模拟实际使用中的情况。
试验实施是生物学试验的核心环节。
在试验实施中，需要将器械和试验对象进行接触，观察其对试验对象的影响。
试验实施需要遵循一定的操作规范，确保试验的可靠性和准确性。
同时，需要密切注意试验对象的生理指标和生理状况，及时处理可能出现的异常情况。
数据分析是对试验结果进行统计和分析的过程。
数据分析可以使用合适的统计方法，如方差分析、相关分析等，从而得出结论。
数据分析还可以评估试验结果的可靠性和置信度，以及是否符合预期。
最后是试验报告的撰写。
试验报告应该详细记录试验的目的、方法、实施过程和试验结果等信息。
试验报告还需要对试验结果进行客观、全面的分析和解释，从而得出结论和建议。
试验报告需要符合一定的格式要求，以便审核和审评人员的阅读和理解。
医疗器械生物学试验审评规范（2024版）的实施，对于促进医疗器械的研发和推广具有重要意义。
它能够规范试验工作，提高试验结果的准确性和可靠性，从而保障医疗器械的安全性和有效性。
同时，该规范也为医疗器械企业和监管部门提供了操作指南和评估依据，使得审评工作更加规范化和科学化。
医疗器械生物学评价要点
医疗器械生物学评价要点医疗器械生物学评价是指对医疗器械的生物相容性、生物安全性等进行评价的过程。
这一评价是为了确保医疗器械在使用过程中对人体不产生毒副作用、不引发过敏反应等不良影响，保证医疗器械的安全有效性。
下面是医疗器械生物学评价的主要要点：1.材料选择与表面特性：医疗器械所选用的材料必须具备良好的生物相容性，不能引起过敏反应或其他不良反应。
此外，医疗器械的表面特性如表面粗糙度、表面能等也需要进行评价，以保证其与生物体的相互作用符合要求。
2.细胞毒性评价：细胞毒性评价主要是通过体外实验来评估医疗器械对细胞的毒性作用。
常见的评价方法包括MTT实验、细胞增殖实验、细胞凋亡实验等。
通过这些实验可以评估材料是否会对细胞造成毒害作用，给出合理的使用建议。
3.刺激性和过敏源评价：医疗器械使用过程中可能会引起刺激性反应或过敏反应，因此需要进行相应的评价。
这包括对器械的刺激性和致敏性进行评价，以确定其对皮肤、黏膜等的刺激作用或致敏潜力。
4.肥大细胞激活试验：肥大细胞激活试验是一种评估医疗器械导致过敏反应潜力的试验。
通过测定器械样品对肥大细胞的激活程度来判断其致敏潜力，进一步评估其生物安全性。
5.妊娠毒性评价：针对妊娠期妇女使用的医疗器械，需要进行相关的妊娠毒性评价。
这包括通过实验评估器械对胚胎发育的影响、对母体的毒性作用等，以保证医疗器械在妊娠期的使用安全性。
6.致突变性评价：医疗器械使用过程中可能会对细胞的遗传物质产生突变，因此需要通过相关试验评估医疗器械的致突变性。
常见的评价方法包括细菌逆突变试验、小鼠骨髓微核试验等。
7.慢性毒性评价：对于长期使用的医疗器械，还需要进行慢性毒性评价。
通过长期的动物实验来评估医疗器械对动物的毒性作用，并推测其在人体中的慢性毒性反应。
8.免疫学评价：医疗器械可能会引起免疫反应，因此需要进行相关的免疫学评价。
这包括对医疗器械的免疫原性进行评价，以及对其对机体免疫功能的影响进行评估。
生物学评价报告
生物学评价报告生物学评价是对与人体接触的医疗器械、生物材料等产品进行的一系列评估，以确定其对人体的安全性和有效性。
本报告旨在对某一特定产品进行全面的生物学评价，为其临床应用提供科学依据。
一、产品概述本次评价的产品是一款新型的心脏支架，由特殊的合金材料制成，表面经过特殊处理以提高生物相容性。
该支架设计用于治疗冠状动脉狭窄，通过介入手术置入患者体内，以支撑血管并保持血流通畅。
二、评价目的确定该心脏支架在预期使用条件下是否具有生物安全性，是否会引起局部或全身性的不良反应，以及是否能够有效地实现其预期的治疗效果。
三、评价依据1、相关的国家标准和行业标准，如 GB/T 16886 系列标准。
2、国际上公认的生物学评价指南和规范。
3、已有的同类产品的生物学评价数据和临床应用经验。
四、材料和方法1、材料表征对支架的材料成分进行化学分析，确定其主要元素和杂质含量。
对材料的物理性能进行测试，包括硬度、弹性模量等。
2、体外细胞毒性试验使用人源细胞系（如内皮细胞、平滑肌细胞等）进行培养。
将支架材料的提取物与细胞共同培养，观察细胞的形态、生长和增殖情况，以评估细胞毒性。
3、致敏试验采用豚鼠最大剂量法进行致敏试验。
观察动物在接触支架材料后的皮肤反应，判断是否引起过敏反应。
4、刺激试验进行皮肤刺激试验和眼刺激试验。
将支架材料直接接触动物的皮肤或眼睛，观察是否引起刺激症状。
5、血液相容性试验检测支架材料对血液凝固、血小板黏附和聚集等的影响。
评估材料与血液接触后的溶血情况。
6、体内植入试验将支架植入动物（如大鼠或兔）的冠状动脉。
在预定的时间点进行组织学检查，观察支架周围组织的炎症反应、血管内皮化情况等。
五、结果与讨论1、材料表征化学分析结果显示，支架材料的主要成分符合设计要求，杂质含量在可接受范围内。
物理性能测试表明，材料的硬度和弹性模量等参数适合预期的应用。
2、体外细胞毒性试验细胞培养结果显示，在支架材料提取物存在的情况下，细胞形态正常，生长和增殖未受到明显抑制，表明无明显的细胞毒性。
35生物学评价控制程序-CE
1、目的为满足MDD93/42/EEC的要求以及适用的法规规定，依据ISO10993（GB/T16886）《医疗器材生物性评估》对公司体系覆盖的医疗器械产品进行生物相容性测试，特制订本控制程序。
2、适用范围适用于带有CE标志产品的生物相容性评价测试。
3、术语、缩略语3.1设计开发小组负责生物相容性的送检和管理。
3.2管理者代表或企业负责人负责委外检测合同的商谈和签订。
4、工作程序4.1材料和器械生物学评价的基本原则4.1.1在选择制造器械所用材料时，应首先考虑材料的特点和性能，包括化学、物理学、电学、形态学和力学等性能。
器械总体生物的评价应考虑以下几个方面:1）生产所用材料；2）助剂、工艺污染和残留；3）可沥滤物质；4）降解产物；5）其他成分以及它们在最终产品上的相互作用；6）最终产品的性能和特点。
4.1.2用于生物学评价的试验与解释应考虑材料的化学成分，包括接触状况和器械及其成份与人体接触的性质、程度、次数和周期，为简化试验选择，根据以下原则对器械分类来指导对材料和最终产品试验。
潜在危害范围很广，可能包括：1）短期作用(如急性毒性，对皮肤、眼和结膜表面刺激、致敏、溶血和血栓形式)；2）长期或特异性毒性作用(如亚慢性或慢性毒性作用、致敏遗传毒性、致癌和对生殖的影响)。
4.1.3每种材料和最终产品都考虑所有潜在的生物危害,但这并不意味着所有已潜在危害的试验都必须进恩施金凰新材料有限公司行。
在下列任何一种情况下，应考虑材料和最终产品重新进行生物评价。
1）制造产品所用的原材料改变时；2）产品配方、特殊工艺改变时；3）贮存期内最终产品中的任何变化；4）产品用途改变时；5）有迹象表明产品用于人体时会产生副作用。
4.2试验1）细胞毒性按标准ISO10993-5要求进行测试；2）迟发性超敏反应按标准ISO10993-10要求进行测试；3）皮肤刺激（皮内）反应按标准ISO10993-10要求进行测试；4）热原反应按标准ISO 10993-11要求进行测试；5）急性毒性按标准ISO 10993-11要求进行测试；5、支持性文件1）ISO10993-5《医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验》2）ISO10993-10《医疗器械生物学评价第10部分：刺激与迟发型超敏反应试验》2）ISO10993-11《医疗器械生物学评价第11部分全身毒性试验验》恩施金凰新材料有限公司。
硬管内窥镜产品注册技术审查指导原则
硬管内窥镜产品注册技术审查指导原则指导原则2007.11本指导原则旨在指导与规范第二类硬管内窥镜产品的技术审评工作，帮助审查人员增进对该类产品机理、结构、要紧性能、预期用途等方面的懂得，方便审查人员在产品注册技术审评时把握基本的要求与尺度。
此外，由于我国医疗器械法规框架仍在构建中，审查人员仍需密切关注有关适用标准与注册法规的变化，以确认申报产品是否符合法规要求。
一、适用范围本指导原则只包含2002年版《医疗器械分类目录》中的第二类硬管内窥镜产品，即喉镜、鼻窦镜、膀胱镜、子宫镜、直肠镜、羊水镜。
二、技术审查要点（一）产品名称1．喉镜，其他名称：“喉内窥镜”；2．鼻窦镜，其他名称：“鼻镜”、“鼻内窥镜”；3．膀胱镜，其他名称：“尿道膀胱镜”、“纤维导光膀胱镜”；4．子宫镜，其他名称：“子宫腔镜”、“宫腔镜”；5．直肠镜；6．羊水镜，其他名称：“羊膜镜”。
（二）产品的结构与构成1.典型产品结构示意图（1）喉镜（2）鼻窦镜（3）膀胱镜（4）子宫镜（5）直肠镜（6）羊水镜2.产品的结构构成喉镜、鼻窦镜、羊水镜由外镜管、光导束、内镜管、光学系统、镜体、光导束接口、目端接管、目镜罩等构成。
膀胱镜由光学内窥镜、操作器、镜鞘、窥镜桥等构成。
子宫镜一种由22°角外镜管、光导束、内镜管、光学系统、镜体、光导束接口、目端接管、目镜罩、输液管、操作管、限位器、宫颈塞等构成；另一种由内窥镜体、操作器、鞘套构成。
直肠镜一种是带有光学系统的内窥镜，由闭孔器、窥视管、手柄、镜盘、注气嘴、光导束接口等构成；另一种是没有光学系统的内窥镜，只有内外窥视管，中间装有照明光导束，带有手柄、镜盘、注气嘴、光导束接口等构成的直肠镜。
3.产品材料（1）与人体接触的内外镜管、镜鞘、窥视管通常使用1Cr18Ni9Ti管材制造。
（2）光学系统通常使用不一致牌号的光学玻璃制造。
（3）光导束通常使用不一致孔径的玻璃纤维材料。
（4）镜体、光导束接头、目端接管、窥镜桥、闭孔器、操作器通常使用不锈钢材料或者52铜材料加工之后电镀。
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WORD格式可编辑 专业知识整理分享 医疗器械生物学评价 第5部分：体外细胞毒性试验
1 范围 GB/T 16886 的本部分阐述了评价医疗器械体外细胞毒性的试验方法。 这些方法规定了下列供试品以直接或通过扩散的方式与培养细胞接触和进行孵育； a）用器械的浸提液，和／或 b）与器械接触。 这些方法是用相应的生物参数测定哺乳动物细胞的体外生物学反应。
2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过GB/T 16886 的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。 GB/T 16886. 1 医疗器械生物学评价 第1部分：评价与试验（GB/T 16886.1-2001,idt ISO 10993- 1:1997） CB/ T 16886. 12-2000 医疗器械生物学评价 第12部分：样品制备和参照材料（idt ISO 10993- 12 :1996）
3 术语与定义 GB/ T 16886. 1/ ISO 1993-1中确立的以及下列术语和定义适用于本部分。 3.1 阴性对照材料 negative control material 按照本部分试验时不产生细胞毒性反应的材料。 注：阴性对照的目的是验证背景反应，例如高密度聚乙烯1） 已作为合成聚合物的阴性对照材料，氧化陶瓷棒则用作牙科材料的阴性对照物。 3.2 阳性对照材料 positive control material 按照本部分试验时可重现细胞毒性反应的材料。 注：阳性对照的白目的是验证相应试验系统的反应，例如用有机锡作稳定剂的聚氯乙烯2）已用作固体材料和浸提液的阳性对照，酚的稀释液用于浸提液的阳性对照。
_____________________________________ 1) 高密度聚乙烯可从美国药典委员会（Rockvillie, Maryland, USA）和Hatano研究所食品和药品安全中心（Ochiai 729-5 ,Hanagawa.257-Japan）获得。提供这一信息是为本部分的使用者提供方便，但ISO对使用该产品不提供担保。 2) 有机锡聚氯乙烯阳性对照材料可从SIMS Portex Ltd,Hythe, Kent,CT21 6JL,UK（产品号码499-300-000）获得。ZDEC和ZDBC 聚氨甲酸乙酯可从Hatano 研究所食品和药品安全中心（Ochiai 729-5 , Hanagawa257-Japan) 获得。提供这一信息是为本部分的使用者提供方便，但ISO 对使用该产品不提供担保。 WORD格式可编辑 专业知识整理分享 3.3 试剂对照 reagent control 在不加试验材料的条件下，按浸提条件和试验步骤得到的浸提介质。 注：在本部分中，该定义取代 GB/T 16886. 12/ lSO 10993-12中3.1给出的定义。 3.4 培养器皿 culture vessels 适用于细胞培养的器皿，包插玻璃培养皿、塑料培养瓶或塑料多孔培养板和微量滴定板等器皿。 注，在这些试验方法中，这些器皿只要符合组织培养级别的要求，并适用于哺乳动物细胞培养．可以互换使用。 3.5 近汇合 subconfluency 在对数生长期末，约80% 的细胞汇合。
4 样品制备 4.1 总则 供试品可选用： a）材料浸提液；和／或 B）材料本身。 样品制备应符合CB/T 16886. 12/ISO 10993-12。 4.2 材料浸提液的制备 4.2.1 浸提原则 为了测定潜在的毒理学危害，浸提条件应模拟或严于临床使用条件，但不应导致试验材料发生，诸如熔化、溶解或化学结构改变等明显变化。 注：浸提液中任何内源性或外源性物质的浓度及其接触试验细胞的量取决于接触面积、浸提体积、pH、化学溶解度、扩散率、溶质度、搅拌、温度、时间和其他因素。 4.2.2 浸提介质 哺乳动物细胞检测中应使用下列一种或几种溶剂。对浸提介质的选择应进行验证： a) 含血清培养基； b) 无血清培养基； c) 生理盐水溶液； d) 其他适宜的溶剂。 注：溶剂的选择应反映出浸提的目的，并应考虑使用极性和非极性两种溶剂。适宜的溶剂包括纯水、植物油、二甲基亚砜（DMSO）。在所选择的测试系统中．如DMSO 浓度大于0.5% （体积分数），则有细胞毒性。 4.2.3 浸提条件 4.2.3.1 浸提应使用无菌技术，在无菌、化学惰性的封闭容器中进行，应符合GB/ T 16886. 12/ lSO 10993-12 的基本要求。 4.2.3.2 推荐的浸提条件是： a) 37℃±2℃下不少于24 h； b) 50℃±2℃下72 h±2 h； c) 70℃±2℃下24 h±2 h； d) 121℃±2℃下1 h士0. 2 h。 可根据器械特性和具体使用情况选择推荐的条件。 当浸提过程使用含血清培养基时，只能来用4. 2. 3. 2 a）规定的浸提条件。 WORD格式可编辑 专业知识整理分享 4.2.3.3 浸提液用于细胞之前，如果进行过滤、离心或其他处置方法，最终报告（见第9章）中应予以说明，对浸提液pH值的调整也应在提告中说明。对浸提撞的处理，例如对pH值的调整会影响试验结果。 4.3 直接接触试验材料的制备 4.3.1 在细胞毒性检测中，多种形状、尺寸或物理状态（即液态或固态）的材料未经修整即可进行测试。固体样品应至少有一个平面。 其他形状和物理状态的样品应进行调整。 4.3.2 应考虑试验样品的无菌性。 4.3.2.1 无菌器械试验材料的试验全过程应按无菌操作法进行。 4.3.2.2 试验材料如取自通常在使用前灭菌的器械，应按照制造商提供的方法灭菌，并且试验全过程应按无菌操作法进行。 用于试验系统之前，制备试验材料时应考虑灭菌方法或灭菌剂对器械的影响。 4.3.2.3 试撞材料如取自使用中不需要灭菌的器械，则应在供应状态下使用，但在试验全过程中应按无菌操作法进行。 4.3.3 对液体进行试验应： a）直接附着；或 b）附着到具有生物惰性和吸收性的基质上。 注：滤膜是适用的基质。 4.3.4 对高吸收性材料，如果可能，试验前应用培养基将其浸透，以防吸收试验器皿中的培养基。
5 细胞系 5.1 优先采用已建立的细胞系并应从认可的贮源获取3） 5.2 在需要特殊敏感性时，只能使用直接由活体组织获取的原代细胞、细胞系和器官型培养物，但需证 明其反应的重现性和准确性。 5.3 细胞系原种培养贮存时，应放在相应培养基内，在-80℃或-80℃以下冻存，培养基内加有细胞保护剂，如二甲基亚砜或甘油等，长期贮存（几月至几年）只能在-130℃或-130℃以下冻存。 5.4 试验应使用无支原体污染细胞，使用前采用可靠方法检测是否存在支原体污染。
6 培养基 6.1 培养基应无菌。 6.2 含血清或无血清培养基应符合选定细胞系的生长要求。 注：培养基中允许含有对试验无不利影响的抗生素。 培养基的稳定性与其成分和贮存条件有关。含谷氨酰胺和血清的培养基在2℃～8℃条件下贮存不超过一周，含谷氨酰胺的无血清培养基在2℃～8℃条件下贮存不超过2周。 6.3 培养基的pH 值应为7. 2～7. 4。 7 细胞原种培养制备 7.1 用选定的细胞系和培养基制备试验所需足够的细胞。使用冻存细胞时，如加有细胞保护剂应除去，使用前至少传代培养一次。 7.2 取出细胞，用适宜的酶分散法和／或机械分散法制备成细胞悬浮液。 ——————————————— 3） 推荐的细胞系如CCL1（NCTC clone 929），CCL 163（Balb/3T3 clone A31）、CCL171（MRC-5）、CCL 75（Wl-38）、CCL81（Vero）、CCL10[BHK-21(C-l3) 和V-79 379A。这一信息只是为本部分的使用者提供方便，但ISO 对使用该产品不提供担保。也可使用其他能得出相同或更佳结果的细胞系。 WORD格式可编辑 专业知识整理分享 8 试验步骤 8.1 平行样数 至少采用三个平行试验样品数和对照数。 8.2 浸提液试验 8.2.1 该试验用于细胞毒性定性和定量评价。 8.2.2 从持续搅拌的细胞悬浮液中吸取等量的悬浮液，注入浸提液接触的每只培养器皿内，轻轻转动培养器皿使细胞均匀地分散在器皿的表面。 8.2.3 根据培养基选择含或不含5%（体帜分数）二氧化碳的空气作为缓冲系统，在37℃士2℃ 温度下进行培养。 试验应在近汇合单层细胞或新鲜悬浮细胞上进行。 如仅是检测克隆形成，应采用较低的细胞密度。 8.2.4 试验前用显微镜检查培养细胞的近汇合和形态情况。 8.2.5 试验可选用： a ) 浸提原液；和 b ) 以培养基作稀释剂的系列浸提稀释液。 试验如果用单层细胞，应弃去培养器皿中的培养基，在每只器皿内加等量浸提液或上述稀释液。 如用悬浮细胞进行试验，细胞悬浮液制备好后立即将浸提液或上述稀稀释液加到每只平行器皿中。 8.2.6 采用水等非生理浸提液时，浸提液用培养基稀稀后应在最高生理相容浓度下试验。 注：建议在稀释浸提液时使用浓缩的（如2倍、5倍）培养基。 8.2.7 加等量的空白试剂和阴性及阳性对照液至其他平行器血中。 注：如需要，还可以用新新鲜培养基做对照试验。 8.2.8 器皿按8. 2.3 中所述同样条件进行培养，培养期间应符合选定方法的要求。 8.2.9 经过至少24 h 的培养后，接8. 5 确定细胞毒性反应。 8.3 直接接触试验 8.3.1 该试验用于细胞毒性定性和定量评价。 8.3.2 从持续搅拌的细胞悬液中吸取等量的悬浮液，注入与试验样品直接接触的每只器皿内。轻轻水平转动器皿，使细胞均匀地分散在每只器皿的表面。 8.3.3 根据培养基选择含或不含5% （体积分数）二氧化碳的空气作为缓冲系统，在37℃±2℃温度下进行培养，直至培养细胞生长至近汇合。 8.3.4 试验前用显微镜检查培养细胞的近汇合和形态情况。 8.3.5 弃去培养器皿中的培养基，加新鲜培养基至各器皿内。 8.3.6 在每只器皿中央部位的细胞层上各轻轻放置一个试验样品，应确保样品覆盖细胞层表面约十分之 操作时应注意防止样品不必耍的移动，否则可能会导致细胞的物理性损伤，这可从被移动细胞的碎片来判断。 注：如可能，在细胞加入前将样品放入培养器皿内。 8.3.7 同法制备阴性和阳性对照材料平行器皿。 8.3.8 器皿按8.3.3中所述同样条件进行培养，培养期间（最少24h）应符合选定方法的要求。 8.3.9 去除上层培养基，接8.5确定细胞毒性反应。 8.4 间接接触试验 8.4.1 琼脂扩散试验 8.4.1.1 该试验用于细胞毒性定性评价，该方法不适用于不能通过琼脂层扩散的可沥滤物或与琼脂反应的物质。