细胞生物学实验

细胞培养基本理论一细胞培养概述细胞培养（cell culture）模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。

群体培养（mass culture）将大量细胞置于培养瓶中，让其贴壁或悬浮生长，形成均匀的单层细胞或单细胞悬液。

克隆培养（clone culture）即将少数的细胞加入培养瓶中，贴壁后彼此间隔距离较远，经过繁殖每一个细胞形成一个集落，称为克隆。

组织培养（tissue culture）指把活体的组织取出，分成小块，直接置于培养瓶底或通过胶原纤维血浆支持物的培养瓶底来进行培养。

特点：1.，组织不失散，细胞保持原有的组织关系。

2，形成生长(cut growth)或形成由扁薄细胞构成的单层细胞培养物。

3，在体外生长时，细胞间呈相互依存、互相影响的关系。

器官培养（organ culture）将活体中器官或器官一部分取出，在体外生长、生存，并使其保持器官原有的结构和功能特征的培养。

特点：1，培养的器官在合适的条件下能生长和分化，存活数周或1 年。

2，观察受限，只能用组织切片的方法观察或用透射电镜、扫描电镜观察。

细胞培养优点：.1．活细胞：同时、大量、均一性、重复性；2．可控制：各种物理、化学、生物等因素可调控；3．研究方法多样：倒置、荧光、电子、激光共焦显微镜、流式细胞术、免疫组织化学、原位杂交、同位素标记；4．应用广：不同物种、年龄、组织，正常或异常缺点：人工所模拟的条件与体内实际情况仍不完全相同；当细胞被置于体外培养后，生活在缺乏动态平衡的环境中，时间久了，必然发生变化。

三细胞的形态和类型由不同生长方式造成的差异呈悬浮生长时，因生长在液体环境中，胞内渗透压高于周围液体环境，因此胞体基本呈圆形。

呈贴附于支持物上生长的细胞，开始为圆形，很快过渡成扁平形，并逐渐恢复至原先的细胞形态.细胞来源：成纤维型细胞；上皮型细胞；其它，不定型细胞按生长方式：贴壁型细胞（Monolayer cells）；悬浮型细胞（Suspension cells）绝大多数有机体细胞属贴壁型细胞，只有少数细胞类型如某些肿瘤细胞和白细胞可在悬浮状态下生长。

按细胞形态(贴壁细胞）：成纤维型细胞；上皮型细胞；其它，不定型贴壁型生长细胞或锚着依存性细胞处于体外培养状态下的贴附生长型细胞在形态上表现单一而失去了在体内原有的某些特征。

形态各异反映其胚层起源。

如来源于内外胚层的细胞多呈上皮型；来自中胚层的则易呈成纤维细胞型。

分为成纤维型细胞；皮型细胞；游走型细胞；多形型细胞贴壁型细胞形态比较成纤维型细胞：梭形或不规则三角形；中央有卵圆形核；胞质向外伸出长短不同的突起；中胚层间质起源上皮型细胞：扁平不规则多角形；细胞中央有圆形核；紧密相连单层膜样生长；内、外胚层细胞如皮肤、表皮衍生物、消化管上皮等游走型细胞：散在生长，一般不连成片；细胞质经常伸出伪足或突起；活跃的游走或变形运动；羊水细胞培养的早期多形细胞型：难以确定规律和稳定的形态；如神经组织的细胞等四贴壁型细胞的生长特点：贴附和伸展；接触抑制；生长的密度限制接触抑制（Contact inhibition）：细胞相互接触时，将停止增长；细胞停留在细胞周期的G0期；正常细胞并不互相重叠生长，但转化的细胞或肿瘤细胞却可以继续生长导致细胞重叠堆积生长。

生长的密度限制（Density Inhibition）又称：密度依赖性调节）正常细胞接触汇合成单层后，虽发生接触抑制，只要营养充分，细胞仍然能够进行增殖分裂，因此细胞数量仍在增多。

但当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养的枯竭和代谢物的影响，则发生密度抑制导致细胞分裂停止。

而转化细胞或肿瘤细胞的密度依赖性调节常常降低，能生长至较高的终末细胞密度。

生长过程单个细胞的生长过程——细胞周期（cell cycle）细胞系的生长过程——培养细胞的生命周期（Life Span of Culture Cells）每代细胞的生长过程原代培养期与细胞系原代培养（primary culture）从动物机体取出的进行培养的细胞群。

生长缓慢，繁殖一定的代数后（一般10代以内）停止生长。

细胞株（cell strain）从原代培养细胞群中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群，能够繁殖50代左右，在培养过程中其特征始终保持。

细胞系（cell line）从肿瘤组织培养建立的细胞群或培养过程中发生突变或转化的细胞，在培养条件下可无限繁殖克隆（clone）亦称无性繁殖系或无性系。

对细胞来说，克隆是指由同一个祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。

传代培养期（Passage）在培养条件较好情况下，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型，呈二倍体核型的细胞称二倍体细胞系（Diploid Cell Line）。

☐细胞应在初代培养期或传代后早期冻存。

☐一般情况下当传代10～50次左右，细胞增殖逐渐缓慢，以至完全停止，细胞进入衰退期。

衰退（老）期（senescence）☐一般有限细胞系在此期的细胞增殖缓慢，并逐渐完全停止，进而发生衰退和死亡。

☐其特点是端粒酶进行性缩短，直到最后细胞不能再进一步分裂。

☐例外：生殖细胞、干细胞和转化细胞（肿瘤细胞）☐组织培养细胞一代生存期分为潜伏期；指数增生期；停滞期实验室组成基本要求便于隔离、便于操作、便于灭菌、便于观察基本需要实验准备、无菌操作、控制培养基本组成基本实验室：消毒准备室、制备室、无菌操作室辅助实验室：细胞学实验室生化分析室摄影室及暗室消毒准备室配备包括实验台，高压灭菌锅、排风灭火设备、干热消毒柜、超声波清洗器、洗瓶机等。

制备室配备包括低温冰箱、天平、真空负压泵、PH计、旋转混合仪、水浴箱等。

基本设施配置基本设备；灭菌设备；无菌操作设备；光温控制设备；细胞培养设备；细胞学鉴定设备灭菌设备包括蒸汽压力灭菌锅；干热消毒柜；过滤灭菌装置；喷雾消毒器；紫外灯消毒物理消毒射线、紫外线、干热、湿热、滤过化学消毒来苏儿、新洁尔灭、过氧乙酸、70%酒精无菌操作设备原理：内设鼓风机，驱动空气通过高效滤器过滤，净化或垂直气流的状态送出，从而形成无菌洁净工作环境。

分类：垂直流/水平流超净工作台；单边操作台，双边操作台；普通操作台，医用（生物）操作台。

维护：检查滤膜，定期清洗，更换。

基本设施配置之一•生物安全柜根据主要几项生物安全柜国际标准的规定，安全柜可分为一级、二级和三级三大类以满足不同生物研究和防疫的要求。

安全柜的分类级别与生物安全登记无关。

一级生物安全柜：保护工作人员和环境，而不保护样品。

排气口安装有HEPA过滤器。

自带风机，依赖外接通风管中的风机带动气流。

二级生物安全柜：可提供对样品，环境，工作人员的保护。

排气口安装有HEPA过滤器，独有特征是具有垂直层状薄片（无定向的）HEPA过滤器。

内置风机，形成下沉气流;无自带风机，依赖外接通风管中的风机带动气流。

三级生物安全柜:为3－4级实验室生物安全等级而设计，柜体完全气闭。

通过手套进行操作，俗称“手套箱”。

实验品通过双门的传递箱进出。

适用于高风险的生物实验。

二级生物安全柜的使用：确认通风橱已经打开，并且空气正在循环；把框格降低到刻度处；不要阻碍空气流通；使用前用70％乙醇擦拭台面；不要使用酒精灯；减少手臂再通风橱内晃动基本设施配置之二光温控制设施包括时间程序控制器；空调及温度感应器基本设施配置之三细胞培养设备温度37℃±0.5℃；CO2浓度5%；相对湿度100%；定期清洗、消毒基本设施配置之四固定角式转子；水平转子；垂直转子注意：1000 RPM 10 MIN配平基本设施配置之五细胞学鉴定设备（倒置显微镜;荧光显微镜;酶标检测仪;流式细胞仪）三常用器皿、器械(解剖器具\培养器皿\移液器\特殊用具)•解剖器具主要用于解剖动物、取材和原代培养中切割组织。

常用的手术器械有手术刀柄及刀片、组织剪、眼科剪、镊子、尖镊、止血钳、持针器等。

各种器械至少要准备两套，以备轮换消毒用。

各种金属器械使用后，及时刷洗干净，用干净纱布拭干，上一薄层液体石蜡，以防生锈。

消毒法采用高压蒸汽灭菌或采用70％乙醇浸泡消毒。

•培养器皿如溶液瓶、培养瓶、培养皿、培养板等。

多孔培养板材料仅有塑料的一种，适宜少量细胞和单克隆生长，也适宜进行分组比较的生化、药理、毒理等方面的实验，其规格主要有6孔，12孔、24孔、96孔培养板。

•移液器电动移液器、微量移液器、多通道微量移液器•特殊用具细胞筛网、细胞刮刀、细胞计数板天然培养基最普遍使用的天然培养基是血清，基本以小牛血清最为普遍。

血清由于含有多种细胞生长因子、促贴附因子及其多活性物质。

常见使用最为5-20%。

血清培养基的主要问题：1血清的准确成份、含量仍不清楚。

2批间差异大，保存期短，标准化和连续性受到限制。

3非生理学液体，可能促进/抑制某些细胞生长。

4含有细胞毒性物质（补体、抗体、细菌毒素等）。

5取材中可能带入支原体、病毒，对细胞产生潜在影响。

6价格昂贵合成培养基根据细胞所需物质的种类和数量,用化学物质模拟合成、人工设计、配制的培养基。

从最初的基本培养基发展到无血清培养基、无蛋白培养基，并且还在不断发展。

显示剂：酚红谷氨酰胺•无血清培养基(serum free medium,SFM)不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。

•无蛋白培养基（protein free midium,PFM）不含有动物蛋白的培养基。

•限定化学成分培养基(chemical defined medium, CDM)不含有动物蛋白，同样也不是添加了植物水解物，而是使用了一些已知结构与功能的小分子化合物，如短肽、植物激素等。

常用培养基•MEM细胞培养基系列DMEM细胞培养基系列RPMI-1640细胞培养基系列199细胞培养基系列水解乳蛋白细胞培养基欧氏平衡盐F-10,F-12细胞培养基系列其它类型细胞培养基常用干粉培养基的配置认真阅读说明书。

说明书都注明干粉不包含的成分，常见的有NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES等。

这些成分有些是必须添加的，如NaHCO3、谷氨酰胺，有些根据实验需要决定。

配制是要保证充分溶解，NaHCO3、谷氨酰胺等物质都要等培养基完全溶解之后才能添加。

配制所用的水应是三蒸水，离子浓度很低。

所用器皿应严格消毒。

配制好的培养基应马上过滤，无菌保存于4度。

五、实验室操作注意事项做好实验前准备，避免反复进出而增加污染机会进入细胞培养室前需更换工作服,换鞋并洗净、消毒双手。

注意无菌室内的紫外灯室内常规用品不准随意拿出室外，所有物品不得挪作它用冰箱内的培养液要注明姓名、配制日期，不随便使用他人的培养液，以免交叉污染 注意各类设备运行状态，发现问题及时报告实验完毕，及时清洁工作台面，将使用过的实验用品移出无菌室定期对无菌室进行消毒灭菌细胞因子的检测方法：1) 生物学方法①依赖性细胞株：生物分析法②功能检测：生物分析法2) 分子生物学方法①分子杂交技术：mRNA的测定②多聚酶链反应技术（PCR）：mRNA的测定3）免疫学方法①免疫测定：免疫酶技术②功能测定与抗体抑制抗体检测技术1）免疫酶技术2）免疫荧光技术3）间接血凝试验4）放射免疫测定5）蛋白印迹6）免疫共沉淀酶联免疫吸附测定(ELISA)实验原理ELISA利用了免疫反应的高度特异性和酶促反应的高度敏感性检测抗原或抗体 使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性按一定步骤进行抗原抗体反应加底物显色，根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析检测方法：1.直接法2.间接法 3.双抗体夹心法4.双夹心间接法一、试剂及仪器准备（一）免疫吸附剂1.固相载体⑴要求：①吸附力强②能保持Ag或Ab活性③不参与化学反应⑵载体性能比较①载体材料：+、- 结果差别大②ELISA板：10ug/L IgG包被,加酶标抗IgG，显色后，测20孔的OD，要求CV<10% ⑶常用载体：材料：聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯等；形状：小试管、小珠、微量反应板2. Ag或Ab：纯度高、效价高、结合力高3. 免疫吸附剂(固相Ag或Ab)：⑴包被：将Ag或Ab固相化的过程包被缓冲液、包被方法⑵封闭：包被后在用1—5%小牛血清白蛋白再包被，以消除非特异吸附的干扰㈡酶结合物：1. 酶的要求：纯度高、催化转化率高、专一性强、性质稳定、来源丰富、标记后稳定。