医疗器械生物学评价 第五部分 体外细胞毒性试验
医疗器械包装检验参考
标题：医疗器械包装检验参考1. 引言医疗器械包装是医疗器械的重要组成部分，其质量直接关系到医疗器械的安全性和有效性。
因此，医疗器械包装检验在医疗器械生产过程中具有重要意义。
本文将详细介绍医疗器械包装检验的参考标准、检验项目及方法，以期为相关企业和机构提供参考。
2. 医疗器械包装检验参考标准2.1 我国医疗器械包装检验标准我国医疗器械包装检验主要参照以下标准：- GB/T 19633-2005《医用包装、容器和材料环氧乙烷灭菌过程的验证》- YY/T 0681.1-2008《医用包装材料与容器第1部分：通用要求》- YY/T 0681.2-2008《医用包装材料与容器第2部分：可重复使用灭菌容器》- YY/T 0681.3-2008《医用包装材料与容器第3部分：一次性使用无菌容器》- YY/T 0681.4-2008《医用包装材料与容器第4部分：纸制无菌包装》- YY/T 0681.5-2008《医用包装材料与容器第5部分：塑料制无菌包装》2.2 国际医疗器械包装检验标准国际医疗器械包装检验主要参照以下标准：- ISO 11607-1：2006《医疗器械包装第1部分：通用要求》- ISO 11607-2：2006《医疗器械包装第2部分：最终灭菌医疗器械包装的验证》- ASTM D 4169-2004《运输包装件的振动、冲击和堆码压力试验》3. 医疗器械包装检验项目及方法3.1 物理性能检验3.1.1 拉伸强度与断裂伸长率检测方法：参照GB/T 1040.3-2006《塑料拉伸性能的测定第3部分：薄膜和薄板》进行测试。
3.1.2 热封强度检测方法：参照GB/T 8807-1988《塑料薄膜热封强度测定方法》进行测试。
3.1.3 抗摆锤冲击性能检测方法：参照GB/T 8809-1988《塑料薄膜抗摆锤冲击性能试验方法》进行测试。
3.2 阻隔性能检验3.2.1 水蒸气透过率检测方法：参照GB/T 1037-1988《塑料薄膜和薄片水蒸气透过率的测定》进行测试。
医用分子筛制氧设备产品技术审评规范(医用分子筛制氧设备产品注册技术审查指导原则)
医用分子筛制氧设备产品技术审评规范根据《医疗器械注册管理办法》（国家食品药品监督管理局令第16号）的要求并结合医用分子筛制氧设备的特点，为规范该类产品的技术审查工作和指导该类产品的注册申报工作，特制定本规范。
一、适用范围本规范适用于医用分子筛制氧设备。
该类产品适用于以医疗、保健为目的，以沸石分子筛为吸附剂，用变压吸附法（PSA）制取医用氧气的医用分子筛设备（以下简称“制氧设备”）。
二、技术审查要点（一）产品名称的要求1、产品名称建议规范为“医用分子筛制氧机（装置）”；2、若有商品名称，应注意不应有夸大产品功效和误导消费者的含义。
（二）产品的结构组成1、单人用的制氧设备至少应由制氧主机、流量计和湿化器等组成。
2、多人用制氧设备至少应由气源、分子筛吸附分离装置、控制装置、氧气流量检测装置和产品气滤器等部分组成。
图1：家用型制氧设备图2：大型制氧设备空气压缩机 空气预处理 气体控制阀 分子筛吸附塔 监控系统 产品气处理系统 输出废气排出图3：制氧设备结构组成（1）空气压缩机：提供吸附时所必须的气体压力及用于分离氧气的原料（空气）。
（2）空气预处理：主要包括气体降温，除水，过滤等功能。
（3）气体控制阀：由空气压缩机加压后并经过空气预处理系统处理后的加压空气，由控制阀按照一定的控制逻辑，对分子筛吸附塔进行周期性的加压、排气。
（4）分子筛吸附塔：在一个密闭的空间之内，密实地填充沸石分子筛。
利用分子筛对气体的选择性吸附特性，分离空气中的氮气、二氧化碳与氧气。
（5）监控系统：（如适用）操作气体控制阀，按照预先设定的工作流程，实现变压吸附。
通过一系列传感器、电路系统，实现产品的氧浓度监测、故障报警、定时等监视、报警和自动控制功能。
（6）产品气处理系统：主要指对制氧设备产生的氧气进行收集、过滤、调压、湿化等处理的部分。
（三）产品工作原理1、分子筛：分子筛是人工水热合成的硅铝酸盐晶体,其硅铝比不同生成各种不同型号分子筛。
医疗器械生物学试验审评规范（2010版）
医疗器械生物学试验审评规范（2010版）医疗器械生物学试验审评规范（2010版）一、目的本规范的目的是为了正确、有效地实施GB/T16886医疗器械生物学评价系列标准。
本规范提出了医疗器械生物学试验中试验资料方面的要求，指导检测机构和北京市生产企业进行医疗器械生物学试验。
二、医疗器械生物学试验的基本要求医疗器械生物学试验的目的是确定与人体直接或间接接触的医疗器械/材料是否引起潜在的毒性。
医疗器械/材料不应直接或通过释放材料中的成分引起：（1）局部或全身不良反应；（2）致畸、致突变、致癌性；（3）生殖和发育毒性。
医疗器械生物学评价是在系统试验数据基础上的评价，是为了确保最终产品的受益超过器械材料产生的潜在风险。
当选择适宜的医疗器械生物学评价试验时，应考虑器械所用材料的化学特性，以及和人体接触的性质、程度、频率和时间。
通常这些试验包括：急性毒性、亚慢性和慢性毒性；对皮肤、眼睛和黏膜的刺激；致敏性；血液相容性；遗传毒性；致癌性；以及发育和生殖毒性等。
然而，根据器械的特性、用途以及与人体接触的特性，这些试验也不能充分表明某些特殊器械的安全性。
对于特殊靶器官毒性的附加试验，例如神经毒性和免疫毒性，对某些器械是必须的。
（例如，直接和脑实质以及脑脊液接触的神经器械，应要求动物植入试验，评价对脑实质的影响、癫痫易感性、以及对脉络丛和蛛网膜绒毛分泌和吸收功能机理的影响。
）对于特殊用途和改变用途的医疗器械/材料，应确定哪些试验是适宜的。
对于不同材料构成的多部件医疗器械，宜对所用的每种材料或部件根据临床使用的情况分别进行生物学试验和评价。
三、医疗器械生物学评价标准目前，医疗器械生物学试验主要参考以下国家标准和行业标准：GB/T 16886.1-2001医疗器械生物学评价——第1部分：生物学评价和试验GB/T 16886.2-2000医疗器械生物学评价——第2部分：动物保护要求GB/T 16886.3-2008医疗器械生物学评价——第3部分：遗传毒性、致癌性和生殖毒性试验GB/T 16886.4-2003医疗器械生物学评价——第4部分：和血液相互作用试验选择（DIS）GB/T 16886.5-2003医疗器械生物学评价——第5部分：体外细胞毒性试验GB/T 16886.6-1997医疗器械生物学评价——第6部分：植入后局部反应试验GB/T 16886.7-2001医疗器械生物学评价——第7部分：环氧乙烷灭菌残留量GB/T 16886.9-2001医疗器械生物学评价——第9部分：潜在降解产物的定性和定量框架GB/T 16886.10-2005医疗器械生物学评价——第10部分：刺激和迟发型超敏试验（DIS）GB/T 16886.11-1997医疗器械生物学评价——第11部分：全身毒性试验GB/T 16886.12-2000医疗器械生物平价第12部分：样品制备与参照样品GB/T 16886.13-2001医疗器械生物学评价第13部分：聚合物医疗器械的降解产物的定性与定量GB/T 16886.14-2003医疗器械生物学评价第14部分：陶瓷降解产物的定性与定量GB/T 16886.15-2003医疗器械生物学评价第15部分：金属与合金降解产物的定性与定量GB/T 16886.16-2003医疗器械生物学评价第16部分：降解产物和可溶出物的毒代动力学研究设计GB/T 16886.17-2005医疗器械生物学评价第17部分：可沥滤物允许限量的建立YY/T 0268-2008牙科学口腔医疗器械生物学评价第1单元：评价与试验YY/T 0127.1-1993口腔材料生物试验方法：溶血试验YY/T 0127.2-1993口腔材料生物试验方法：静脉注射急性全身毒性试验YY/T 0127.3-1998口腔材料生物评价第2单元：口腔材料生物试验方法根管内应用试验YY/T 0127.4-1998口腔材料生物评价第2单元：口腔材料生物试验方法骨埋植试验YY/T 0127.5-1999口腔材料生物评价第2单元：口腔材料生物试验方法吸入毒性试验YY/T 0127.6-1999口腔材料生物评价第2单元：口腔材料生物试验方法显性致死试验YY/T 0127.7-2001口腔材料生物评价第2单元：口腔材料生物试验方法牙髓牙本质应用试验YY/T 0127.8-2001口腔材料生物评价第2单元：口腔材料生物试验方法皮下植入试验YY/T 0127.9-2001口腔材料生物评价第2单元：口腔材料生物试验方法细胞毒性试验：琼脂覆盖法及分子滤过法YY/T 0127.10-2001口腔材料生物评价第2单元：口腔材料生物试验方法鼠伤寒沙门氏杆菌回复突变试验（Ames试验） YY/T 0127.11-2001牙科学用于口腔的医疗器械生物相容性临床前评价2单元：口腔材料生物试验方法盖髓试验医疗器械生物学评价标准GB/T16886.1给出了生物学评价试验及生物学评价流程，但是对于某些新的高风险医疗器械可能还需要补充其它的试验项目。
医疗器械生物学评价第五部分体外细胞毒性试验
医疗器械生物学评价第 5 局部：体外细胞毒性试验1范围GB/T 16886 的本局部阐述了评价医疗器械体外细胞毒性的试验方法。
这些方法规定了以下供试品以直接或通过集中的方式与培育细胞接触和进展孵育；a〕用器械的浸提液，和／或b〕与器械接触。
这些方法是用相应的生物参数测定哺乳动物细胞的体外生物学反响。
2标准性引用文件以下文件中的条款通过GB/T 16886 的本局部的引用而成为本局部的条款。
但凡注日期的引用文件，其随后全部的修改单〔不包括订正的内容〕或均不适用于本局部，然而，鼓舞依据本局部达成协议的各方争论是否可使用这些文件的最版本。
但凡不注日期的引用文件，其最版本适用于本局部。
GB/T 16886. 1 医疗器械生物学评价第1 局部：评价与试验〔GB/T 16886.1-2023,idt ISO 10993- 1:1997〕CB/ T 16886. 12-2023 医疗器械生物学评价第12 局部：样品制备和参照材料〔idt ISO 10993-12 :1996〕3术语与定义GB/ T 16886. 1/ ISO 1993-1 中确立的以及以下术语和定义适用于本局部。
3.13.2 阴性比照材料negative control material依据本局部试验时不产生细胞毒性反响的材料。
注：阴性比照的目的是验证背景反响，例如高密度聚乙烯1〕牙科材料的阴性比照物。
阳性比照材料 pos itive control material依据本局部试验时可重现细胞毒性反响的材料。
已作为合成聚合物的阴性比照材料，氧化陶瓷棒则用作注：阳性比照的白目的是验证相应试验系统的反响，例如用有机锡作稳定剂的聚氯乙烯的阳性比照，酚的稀释液用于浸提液的阳性比照。
2）已用作固体材料和浸提液1)高密度聚乙烯可从美国药典委员会〔Rockvillie, Maryland, USA〕和Hatano 争论所食品和药品安全中心〔Ochiai 729-5 ,Hanagawa.257-Japan〕获得。
二类医疗器械研究资料
二类医疗器械研究资料篇一：医疗器械注册研究资料生物相容性评价实例5.2生物学评价研究1、评价的依据和方法生物相容性是指生命体组织对非活性材料产生的一种性能。
一般是指材料与宿主之间的相容性，包括组织相容性和血液相容性。
生物相容性既不引起生物体组织、血液等的不良反应。
生物相容性评价最基本内容之一是生物安全性，生物安全性是指材料与人体之间相互作用下必须对人体无毒性、无致敏性、无刺激性、无遗传毒性、无致癌性，对人体组织、血液、免疫系统无不良反应。
产品1栓塞剂属于6877介入器材，与人体接触，能够在人体内进行降解，对其生物相容性评价依据《GB/T 16886.1-XX 医疗器械生物学评价_第1部分：风险管理评价与试验》中的内容。
产品1栓塞剂生物学评价方法流程如下：该器械与人体直接接触或间接接触获得材料的识别信息并考虑化学表征材料与市场上器械所用材料相同该材料与市售器械具有相同化学组成制造、灭菌相同、加工助剂不同没有足够的风险评定所需充分的论证和/或临床相关数据根据材料化学性质和接触类别和时间对器械进一步评价进行的生物学评价试验的选择试验和/或豁免试验的论证进行毒理学风险评定最终评价。
2、产品所用材料的描述产品1栓塞剂是采用明胶与甲醛交联而成，其生产工艺与现在市售的产品2颗粒栓塞剂生产工艺基本一致，经合成（交联）、固化、洗涤、冻干、灭菌而成，产品2颗粒栓塞剂在中国已经有使用数年的历史，并具有良好的生物相容性，已经广泛应用了医疗器械行业。
经相关文献报道，产品1无全身毒性、无亚急性和亚慢性毒性、无慢性毒性[1]，植入符合规定[2]、无细胞毒性[3]，无刺激性和致敏性[4]，组织相容性好等特点。
3、材料表征3.1医疗器械材料的定性与定量的说明或分析3.1.1 主要材料名称：明胶:由猪皮中含有的胶原蛋白不完全酸水解、碱水解或酶降解后纯化得到的一种制品。
购自温州罗赛洛明胶有限公司，属于药品辅料，执行《中华人民共和国药典》XX版标准。
临床评价报告
临床评价报告文件编号：XXX产品医疗器械临床评价报告编制/日期：审核/日期：批准/日期：XXX21年X月X日第1页共9页产品名称：XXX产品产品型号：申请者：临床评价单位：临床评价类别：列入《免于进行临床试验的医疗器械目录》产品临床对比评价临床评价负责人（签字）：日期2015年1月11日第2页共9页临床评价报告一、概述我公司（XXXXXXXX）研制开发的XXX产品供临床使用。
根据《医疗器械分类目录》的规定，XXX产品为第二类注射穿刺器械，类别代号为：6815.目前国内已有多个同类产品注册上市，广泛应用多年，其临床上的安全性、有效性早已得到确认。
二、产品设计本产品的设计XXXXXXXX。
三、工作原理XXX产品的工作原理是按无菌操作要求，撕开注射器单包装，去掉注射器保护套，抽取、溶解或配制药液用。
四、市场概况现在市场销售的同类产品主要有XXX等。
这些产品在使用过程未发生过任何意外事故的报道；其中本公司的XXX产品与国内厂家工作原理基本相同。
XXX产品为列入《免于进行临床试验的医疗器械目录》产品，现将申报产品与《目录》所述内容进行对比以判定申报产品是否为列入《目录》产品。
第3页共9页申报产品与《目录》产品的对比表比较项目目录产品申报产品差异性支持性资料名称符合医疗器产品技术要求和产品说产品名称一次性使用配药用注射器 XXXXXXXXXXX械命名规则，二者实质明书等同一次性使用配药用注射器采用符合YY 0242的聚丙烯或对人体无毒副作用的其他高分子材料制成，可由护帽、配药针、外套、干规格，可配侧孔或斜面配药针；产品以无菌形式提供；产品性能指标采用下列参考标准中的适用部分，如：YY/T 0821一次性使用配药用注射器。
描述效果等同，二者实明书产品技术要求和产品说适用范围供抽取或配制药液用。
二者实质等同产品说明书注：支持性资料是指申报产品与《目录》产品的差异性对申报产品的安全有效性不产生影响的理由和依据，可以附件的形式提供。
生物学评价报告
生物学评价报告生物学评价是对与人体接触的医疗器械、生物材料等产品进行的一系列评估，以确定其对人体的安全性和有效性。
本报告旨在对某一特定产品进行全面的生物学评价，为其临床应用提供科学依据。
一、产品概述本次评价的产品是一款新型的心脏支架，由特殊的合金材料制成，表面经过特殊处理以提高生物相容性。
该支架设计用于治疗冠状动脉狭窄，通过介入手术置入患者体内，以支撑血管并保持血流通畅。
二、评价目的确定该心脏支架在预期使用条件下是否具有生物安全性，是否会引起局部或全身性的不良反应，以及是否能够有效地实现其预期的治疗效果。
三、评价依据1、相关的国家标准和行业标准，如 GB/T 16886 系列标准。
2、国际上公认的生物学评价指南和规范。
3、已有的同类产品的生物学评价数据和临床应用经验。
四、材料和方法1、材料表征对支架的材料成分进行化学分析，确定其主要元素和杂质含量。
对材料的物理性能进行测试，包括硬度、弹性模量等。
2、体外细胞毒性试验使用人源细胞系（如内皮细胞、平滑肌细胞等）进行培养。
将支架材料的提取物与细胞共同培养，观察细胞的形态、生长和增殖情况，以评估细胞毒性。
3、致敏试验采用豚鼠最大剂量法进行致敏试验。
观察动物在接触支架材料后的皮肤反应，判断是否引起过敏反应。
4、刺激试验进行皮肤刺激试验和眼刺激试验。
将支架材料直接接触动物的皮肤或眼睛，观察是否引起刺激症状。
5、血液相容性试验检测支架材料对血液凝固、血小板黏附和聚集等的影响。
评估材料与血液接触后的溶血情况。
6、体内植入试验将支架植入动物（如大鼠或兔）的冠状动脉。
在预定的时间点进行组织学检查，观察支架周围组织的炎症反应、血管内皮化情况等。
五、结果与讨论1、材料表征化学分析结果显示，支架材料的主要成分符合设计要求，杂质含量在可接受范围内。
物理性能测试表明，材料的硬度和弹性模量等参数适合预期的应用。
2、体外细胞毒性试验细胞培养结果显示，在支架材料提取物存在的情况下，细胞形态正常，生长和增殖未受到明显抑制，表明无明显的细胞毒性。
医疗器械的生物学评价与测试过程
医疗器械的生物学评价与测试过程新的注册法规在体系和要求上变得越来越严，以前80多家机构可以做审核和注册，经过上一轮的筛选过后就变成了50多家。
新的法规出台后会进一步筛掉一些公告机构，因此医疗器械的注册和上市会越来越严。
今天的话题仅仅是围绕医疗器械的评价与测试这个过程，首先简单介绍什么是生物材料的测试；第二个要讲一下如何进行生物学评价的过程，这里主要介绍通过测试来进行医疗生物学评价；第三我讲一下ISO10993生物学相容性测试。
体外毒性测试关于医疗器械测试，这里简单地分为两大类：体外测试及体内测试。
首先来看体外测试，举几个例子：包括细胞毒性，溶血，遗传毒性……什么叫做体外毒性测试呢？就是不需要动物做的测试。
像细胞毒性，我们用小鼠型纤维细胞；像血液相容性测试、溶血测试，我们用兔子血或人血；遗传毒性测试，通常我们用细菌和小鼠淋巴瘤细胞。
之所以选择用细胞或体外测试，主要为了减少动物使用，考虑动物福利的原因。
国内也越发注重动物保护动物福利，以后可能会立法。
新加坡、法国、欧洲都有比较激进的动物保护者采取了针对实验动物的保护行动。
因此，现在越来越多研发体外测试或替代测试方法。
因后者是比较灵敏的筛选性测试。
比如细胞毒性测试大致7天能得到结果，对后续研发或进一步测试很有指向性。
但体外测试无法完全代表体内环境的情况。
人体内环境有内环境稳态，包括免疫系统，酸碱平衡，耐受性容错性更好，因此，不能完全代替体内环境。
因此需要做体内测试，选择动物模型，更接近人体解剖结构和生化条件。
研发皮肤类，选择家兔做模型，因其皮肤更接近人体皮肤。
研发心血管类产品，倾向于选择猪，因其心脏结构最接近人体。
因此，当我们希望在更深层次研究和探寻器械功能是否合用的情况下，先做动物测试。
当然，要考虑动物福利322原则，尽量减少动物使用，考虑动物的伦理问题，人道和科学地对待动物，不能滥用、虐待动物，对实验进行详细计划，尽可能多地获取实验指标。
避免重复、无益实验。
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医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验1范围GB/T16886的本部分阐述了评价医疗器械体外细胞毒性的试验方法。
这些方法规定了下列供试品以直接或通过扩散的方式与培养细胞接触和进行孵育；a）用器械的浸提液，和／或b）与器械接触。
这些方法是用相应的生物参数测定哺乳动物细胞的体外生物学反应。
2规范性引用文件下列文件中的条款通过GB/T16886的本部分的引用而成为本部分的条款。
凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。
GB/T16886.1医疗器械生物学评价第1部分：评价与试验（GB/T16886.1-2001,idtISO10993-1:1997）CB/T16886.12-2000医疗器械生物学评价第12部分：样品制备和参照材料（idtISO10993-12:1996）3术语与定义GB/T16886.1/ISO1993-1中确立的以及下列术语和定义适用于本部分。
3.1阴性对照材料negativecontrolmaterial按照本部分试验时不产生细胞毒性反应的材料。
注：阴性对照的目的是验证背景反应，例如高密度聚乙烯1）已作为合成聚合物的阴性对照材料，氧化陶瓷棒则用作牙科材料的阴性对照物。
3.2阳性对照材料pos itivecontrolmaterial按照本部分试验时可重现细胞毒性反应的材料。
注：阳性对照的白目的是验证相应试验系统的反应，例如用有机锡作稳定剂的聚氯乙烯2）已用作固体材料和浸提液的阳性对照，酚的稀释液用于浸提液的阳性对照。
_____________________________________1)高密度聚乙烯可从美国药典委员会（Rockvillie,Maryland,USA）和Hatano研究所食品和药品安全中心（Ochiai729-5,Hanagawa.257-Japan）获得。
提供这一信息是为本部分的使用者提供方便，但ISO对使用该产品不提供担保。
2)有机锡聚氯乙烯阳性对照材料可从SIMSPortexLtd,Hythe,Kent,CT216JL,UK（产品号码499-300-000）获得。
ZDEC和ZDBC 聚氨甲酸乙酯可从Hatano研究所食品和药品安全中心（Ochiai729-5,Hanagawa257-Japan)获得。
提供这一信息是为本部分的使用者提供方便，但ISO对使用该产品不提供担保。
3.3试剂对照reagentcontrol在不加试验材料的条件下，按浸提条件和试验步骤得到的浸提介质。
注：在本部分中，该定义取代GB/T16886.12/lSO10993-12中3.1给出的定义。
3.4培养器皿culturevessels适用于细胞培养的器皿，包插玻璃培养皿、塑料培养瓶或塑料多孔培养板和微量滴定板等器皿。
注，在这些试验方法中，这些器皿只要符合组织培养级别的要求，并适用于哺乳动物细胞培养．可以互换使用。
3.5近汇合subconfluency在对数生长期末，约80%的细胞汇合。
4样品制备4.1总则供试品可选用：a）材料浸提液；和／或B）材料本身。
样品制备应符合CB/T16886.12/ISO10993-12。
4.2材料浸提液的制备4.2.1浸提原则为了测定潜在的毒理学危害，浸提条件应模拟或严于临床使用条件，但不应导致试验材料发生，诸如熔化、溶解或化学结构改变等明显变化。
注：浸提液中任何内源性或外源性物质的浓度及其接触试验细胞的量取决于接触面积、浸提体积、pH、化学溶解度、扩散率、溶质度、搅拌、温度、时间和其他因素。
4.2.2浸提介质哺乳动物细胞检测中应使用下列一种或几种溶剂。
对浸提介质的选择应进行验证：a)含血清培养基；b)无血清培养基；c)生理盐水溶液；d)其他适宜的溶剂。
注：溶剂的选择应反映出浸提的目的，并应考虑使用极性和非极性两种溶剂。
适宜的溶剂包括纯水、植物油、二甲基亚砜（DMSO）。
在所选择的测试系统中．如DMSO浓度大于0.5%（体积分数），则有细胞毒性。
4.2.3浸提条件lSO10993-12的基本要求。
a)37℃±2℃下不少于24h；b)50℃±2℃下72h±2h；c)70℃±2℃下24h±2h；d)121℃±2℃下1h士0.2h。
可根据器械特性和具体使用情况选择推荐的条件。
当浸提过程使用含血清培养基时，只能来用4.2.3.2a）规定的浸提条件。
4.3直接接触试验材料的制备4.3.1在细胞毒性检测中，多种形状、尺寸或物理状态（即液态或固态）的材料未经修整即可进行测试。
固体样品应至少有一个平面。
其他形状和物理状态的样品应进行调整。
4.3.2应考虑试验样品的无菌性。
用于试验系统之前，制备试验材料时应考虑灭菌方法或灭菌剂对器械的影响。
4.3.3对液体进行试验应：a）直接附着；或b）附着到具有生物惰性和吸收性的基质上。
注：滤膜是适用的基质。
4.3.4对高吸收性材料，如果可能，试验前应用培养基将其浸透，以防吸收试验器皿中的培养基。
5细胞系5.1优先采用已建立的细胞系并应从认可的贮源获取3）5.2在需要特殊敏感性时，只能使用直接由活体组织获取的原代细胞、细胞系和器官型培养物，但需证明其反应的重现性和准确性。
5.3细胞系原种培养贮存时，应放在相应培养基内，在-80℃或-80℃以下冻存，培养基内加有细胞保护剂，如二甲基亚砜或甘油等，长期贮存（几月至几年）只能在-130℃或-130℃以下冻存。
5.4试验应使用无支原体污染细胞，使用前采用可靠方法检测是否存在支原体污染。
6培养基6.1培养基应无菌。
6.2含血清或无血清培养基应符合选定细胞系的生长要求。
注：培养基中允许含有对试验无不利影响的抗生素。
培养基的稳定性与其成分和贮存条件有关。
含谷氨酰胺和血清的培养基在2℃～8℃条件下贮存不超过一周，含谷氨酰胺的无血清培养基在2℃～8℃条件下贮存不超过2周。
6.3培养基的pH值应为7.2～7.4。
7细胞原种培养制备7.1用选定的细胞系和培养基制备试验所需足够的细胞。
使用冻存细胞时，如加有细胞保护剂应除去，使用前至少传代培养一次。
7.2取出细胞，用适宜的酶分散法和／或机械分散法制备成细胞悬浮液。
———————————————3）推荐的细胞系如CCL1（NCTCclone929），CCL163（Balb/3T3cloneA31）、CCL171（MRC-5）、CCL75（Wl-38）、CCL81（Vero）、CCL10[BHK-21(C-l3)和V-79379A。
这一信息只是为本部分的使用者提供方便，但ISO对使用该产品不提供担保。
也可使用其他能得出相同或更佳结果的细胞系。
8试验步骤8.1平行样数至少采用三个平行试验样品数和对照数。
8.2浸提液试验8.2.1该试验用于细胞毒性定性和定量评价。
8.2.2从持续搅拌的细胞悬浮液中吸取等量的悬浮液，注入浸提液接触的每只培养器皿内，轻轻转动培养器皿使细胞均匀地分散在器皿的表面。
8.2.3根据培养基选择含或不含5%（体帜分数）二氧化碳的空气作为缓冲系统，在37℃士2℃温度下进行培养。
试验应在近汇合单层细胞或新鲜悬浮细胞上进行。
如仅是检测克隆形成，应采用较低的细胞密度。
8.2.4试验前用显微镜检查培养细胞的近汇合和形态情况。
8.2.5试验可选用：a)浸提原液；和b)以培养基作稀释剂的系列浸提稀释液。
试验如果用单层细胞，应弃去培养器皿中的培养基，在每只器皿内加等量浸提液或上述稀释液。
如用悬浮细胞进行试验，细胞悬浮液制备好后立即将浸提液或上述稀稀释液加到每只平行器皿中。
8.2.6采用水等非生理浸提液时，浸提液用培养基稀稀后应在最高生理相容浓度下试验。
注：建议在稀释浸提液时使用浓缩的（如2倍、5倍）培养基。
8.2.7加等量的空白试剂和阴性及阳性对照液至其他平行器血中。
注：如需要，还可以用新新鲜培养基做对照试验。
8.2.8器皿按8.2.3中所述同样条件进行培养，培养期间应符合选定方法的要求。
8.2.9经过至少24h的培养后，接8.5确定细胞毒性反应。
8.3直接接触试验8.3.1该试验用于细胞毒性定性和定量评价。
8.3.2从持续搅拌的细胞悬液中吸取等量的悬浮液，注入与试验样品直接接触的每只器皿内。
轻轻水平转动器皿，使细胞均匀地分散在每只器皿的表面。
8.3.3根据培养基选择含或不含5%（体积分数）二氧化碳的空气作为缓冲系统，在37℃±2℃温度下进行培养，直至培养细胞生长至近汇合。
8.3.4试验前用显微镜检查培养细胞的近汇合和形态情况。
8.3.5弃去培养器皿中的培养基，加新鲜培养基至各器皿内。
8.3.6在每只器皿中央部位的细胞层上各轻轻放置一个试验样品，应确保样品覆盖细胞层表面约十分之操作时应注意防止样品不必耍的移动，否则可能会导致细胞的物理性损伤，这可从被移动细胞的碎片来判断。
注：如可能，在细胞加入前将样品放入培养器皿内。
8.3.7同法制备阴性和阳性对照材料平行器皿。
8.3.9去除上层培养基，接8.5确定细胞毒性反应。
8.4间接接触试验8.4.1琼脂扩散试验注：各种不同分子量和纯度的琼脂可通用。
吸水性材料置于琼脂之前先用培养基进行湿化处理，以防止琼脂脱水。
用活体染色剂如中性红可有助于检测细胞毒性。
活体染色剂可在培养前或培养后与样品一起加入．如在培养前加，应在避光条件下进行细胞培养，以防因染色剂光活化作用而引起细胞损伤。
8.4.2滤膜扩散试验μm、无表面活性剂的滤膜，并加入等量持续搅拌的细胞悬浮液，轻轻水平转动培养皿使细胞均匀地分散在每只滤膜的表面。
8.5细胞毒性判定8.5.1可来用定性或定量方法检测细胞毒性。
a）定性评价：用显微镜检查细胞（如果需耍，使用细胞化学染色）评价诸如一般形态、空泡形成、脱落、细胞溶解和膜完整性等方面的变化，一般形态的改变可描述性地在试验报告中记录或以数字记录，以下是给试验材料计分的有效方法。
细胞需性计分含义0无细胞毒性1轻微细胞毒性2中度细胞毒性3重度细胞毒性试验报告中应包括评价方法和评价结果。
b）定量评价：测定细胞死亡、细胞生长抑制、细胞繁殖或细胞克隆形成。
可以用客观的方法对细胞数量、蛋白总量、酶的释放、活体染料的释放和还原或其他可测定参数进行定量测试，使用的方法和测试结果应在试验报告中记录。
注：一些检测细胞毒性的特殊方法，可能需要零点或基线细胞培养对照。
8.5.2应慎重选择评价方法，试验样品如果释放对试验系统或对检测有影响的物质时，试验结果可能无效。
注：评价细胞活力，释放甲醛的材料须经过可靠的试验验证。
8.5.3各平行培养皿的检测结果如有显着差异，则判定试验不当或无效。