异源表达

异源表达确实是个很困难的课题,不同的体系、菌种、载体,不同的组合,确实不知道会有哪种适合目的基因

另外重组工程菌的稳定性也是个难题,不过有不同的难度:

1。以质粒的形式存在于菌体里,以质粒表达
这种一般保存还是容易的,多数情况下用抗生素压着就问题不大,而且直接用质粒保存,用时现转也能顺利表达的情况也有的是

2。重组在宿主基因组中,与宿主蛋白一起表达
这就保存起来比较困难了,毕竟不是原装货,很有可能穿几代以后就被踢出来了,有时即使没有踢出来也不表达了(我就遇到过,鉴定基因还在,就是不表达了),很有可能插入的位点在宿主基因组的非活跃区域,过几代就基因沉默了。。。。
一般个人认为可以一试的方法包括
(1)用抗生素传代、保菌后抗生素复苏等等
(2)得到工程菌后第一代就保10管,取一管传一代再保10管,再取一管做使用菌株,也就是保存最原始的菌种
(3)筛选时多筛点,几十个菌株同时传代,5代以后(其实最好10-30代,可惜一般没那个精力)还能保留表达能力的算相对比较稳定了
异源蛋白的表达是个很复杂的问题,有许许多多的影响因素,而且由于蛋白本身千差万别,很难有一个很完善或很标准的流程方法。

另外,表达的宿主也是多种多样,目前比较常用的包括E.coli,酵母(以甲醇酵母居多),昆虫细胞,哺乳动物细胞等,各自有着其本身的特点,优缺点各异。

但是,异源表达又是分子生物学中很重要的一个工具,园子里不少战友都在做这方面的工作,许多帖子在讨论这方面的问题。因此想发起一个针对这方面的专题讨论,希望有助于大家的工作,当然也希望能对自己的工作有所帮助,欢迎大家讨论。

还有,由于本人只做了有关E.coli和甲醇酵母的工作,其他虽然我们研究所也有人做,但毕竟本身没做过,若有错误或不严谨的地方欢迎战友们指正。
首先在这里提出几方面问题,希望大家讨论:

1. 宿主的选择。

表达宿主虽众多,但比较常用的也就E.coli,酵母(以甲醇酵母居多),昆虫细胞,哺乳动物细胞等,各自代表了一种体系。

E.coli 原核宿主,无翻译后修饰。但周期短、费用低、表达量大,一直是最常用的宿主之一。蛋白一般很好表达,量很大,但很可能由于蛋白的翻译后修饰不完善而没有活性(或形成包涵体),尤其是表达真核蛋白时最应注意。

酵母,有了比较完备的翻译后修饰系统,尤其是糖基化。但是个人感觉酵母表达异源蛋白时对蛋白本身的特点要求很大,有的蛋白表达量非常大,有的却几乎一点也没有,很折磨人。

昆虫细胞和动物细胞本

人没有做过,但园子里也有很详细的介绍,搜一下google也有不少,其中还有许多是画成了表格,对比各自的优缺点,网络不好,没找链接,希望有人可以不全,多谢多谢!

另外,也有很多用链霉菌表达的成功实例,不过个人感觉链霉做起来相当麻烦,周期长,转化困难,表达量也没什么优势,而且翻译后修饰虽然也有,但仍与真核差别较大。不过链霉菌有许多次级代谢产物(一些小分子物质)可能比蛋白表达本身更有意义,我们实验室就有很多人在做这方面研究。
2. 转化子、表达子的筛选

转化子的筛选,由于许多质粒是穿梭质粒,因此大多具有E.coli中的抗性筛选标记,筛选起来是很方便的(当然,我不清楚细胞方面的筛选,一般使用病毒载体吧,希望高手们介绍一下)。

但是转化成功的并不意味着能够成功表达目的蛋白了,因此还需要“表达子”的筛选,尤其是整合入基因组的片断(E.coli一般是游离质粒表达,好像不用再筛选了,有就有,没有就没有了)。我做的是毕赤酵母(GS115,pPIC9k),在筛选过程中遇到了不小的问题,一般如果目的蛋白有些容易检测的特殊活性(比如抑菌活性),则筛选起来是比较容易的。但是如果没有,由于酵母是整合入基因组表达的,就不太好说了,我用原位点杂交的方法筛选过,效果不好,但筛选量倒挺大;还有就是5ml小量发酵筛选,工作量就比较大了,而且筛了400-500个也没有。

还有就是发现不同的筛选方法获得的阳性菌株好像不是很平行,将上述筛到的菌株放大到100ml时就没有了。请教师兄,他说有可能是不同水平发酵溶氧量差别很大,导致酵母生长状态差异,酵母又挺娇气的,差一点也不干活,比较郁闷。不知有没有解决的方法。

不知大家有什么好的筛选方法介绍一下吧。
3. 稀有密码子

由于是异源表达,不同宿主之间其密码子的偏好性就有不少的差异,这种差异经常直接导致了异源表达的失败。下面有几个问题,我有一些看法,希望大家能给与指导和帮助。

首先,如何确定是否是该问题导致的表达失败。我的一位同学给了我个判断方法的建议,觉得很有道理,和大家分享讨论。他建议我在不同水平简单检测一下表达的情况:基因水平,做个PCR之类的看看是否已成功转入(质粒或整合入宿主);做个半定量RT-PCR看看mRNA是否转录了;

再看看SDS-PAGE是否有蛋白表达。如果根本转化就失败了,没有什么好说的;如果基因进去了但mRNA没有表达,可能需要考虑启动子的问题,换个强启动子或干脆换个质粒;如果mRNA转录了可没有蛋白翻译,那就需要考虑是否是密码子偏好性或mRNA二级结

构的问题了。

然后进一步查证,需要利用软件或上网查找是否存在这样的二级结构,以及是否含有稀有密码子影响了翻译。在这个问题上我试着查了一些网站,如http://www.kazusa.or.jp/codon/ ;http://gcua.schoedl.de/ ;http://www.genebee.msu.su/cgi-bin/nph-rna2.pl。等等。但是许多东西看不太懂,理解起来有困难。希望能有软件高手详细介绍一下用法,尤其是能分析自己片断是否含有很多稀有密码子或二级结构等。在此感谢了!

接下来就是如果确定有可能是稀有密码子问题如何解决?目前我见到的有两种方法,一是有些宿主比如大肠杆菌的Rosetta,是由BL21改造,整合了含稀有密码子tRNA的片断,使其能顺利表达的新型宿主菌,不知其他种类的宿主是否也有这种商业化的修饰菌;另外就是利用PCR等方法将片断上的稀有密码子改造(突变),换成其他编码同样氨基酸的密码子。当然,还可能干脆就换表达体系了,这一般是大家最不希望的了。
4. 菌种的保存、退化

一般来说是加甘油20%左右,-70保存;或制成干粉保存。但是在做甲醇酵母时发现了个问题,就是重组工程菌的退化现象比较严重,一般都是学生做得好好的,但是毕业以后下面的师弟一接手,蛋白就不表达了,或表达量非常的低。连续好几个师兄的结果都是如此,很是奇怪。我猜测可能是由于整合入基因组,毕竟是个外源的基因,不知整合到了染色体的什么部分,会不会过段时间就给“踢”下来,或就沉寂了?E.coli在复苏时都有抗性压着,酵母好像没有太合适的(不知pPICZ系列的那个抗生素好用不好用,但毕竟好贵
)。

我有个想法,是否也应像公司在做工程细胞时那样,挑个几十上百个,一起传代,10几代后仍然稳定表达的才说明基因整合到了合适的部位,不会再下来了?但是毕竟做研究生没那么多时间来干这个,否则万一不行毕业就困难了。有没有其他解决方法呢?盼高手。
5. 拷贝数对表达量的影响

对于“游离”的质粒,比如E.coli的BL21表达时,质粒的拷贝数是否对表达量有所影响?当然,由于大肠表达最主要的问题经常是表达太高了形成了包涵体,所以说白了应该希望表达量更低点的可能比较多,经常尝试各种方法(低温、低浓度IPTG等等)来降低表达量。那么BL21中的质粒是否是单拷贝的呢(没查过,不太清楚)?如果不是,能否通过降低拷贝数来降低表达量防止包涵体的形成呢?

至于酵母那种整合到基因组中的质粒,那么拷贝数是否对表达量有影响呢?通过我自己的经历,个人猜测还是有的。在上面讨论了菌种的退化问题,1年左右,重组的酵母表达蛋白就消失了。但是我曾

经将这些蛋白表达消失的重组菌作了PCR鉴定,发现外源的片断仍然是存在的,就是不表达了,那么是什么原因呢?我有几种猜测:一是可能整合的位置恰好是染色体的沉寂区了,过段时间以后就沉默了,不表达了;还有一种就是会不会是原来是高拷贝的重组菌在冻存以后退化了,变成低拷贝的了(也就是可能有蛋白表达但量很低了)。当然,我后来没有作进一步的验证,比如做个杂交确证以下拷贝数到底多少,只是一种猜测。

那么,如何提高重组酵母菌的拷贝数呢?对于较早的PAO815质粒,采用的多是体外重组的方法达到高拷贝后再转化;对于pPICZ系列和pPIC9k等等则分别采用Zeocin和G418抗生素筛选的方法筛选高拷贝的质粒;园子里还讨论过一种多重转化获得高拷贝重组菌的方法也值得一试

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