异源表达
异源表达确实是个很困难的课题，不同的体系、菌种、载体，不同的组合，确实不知道会有哪种适合目的基因
另外重组工程菌的稳定性也是个难题，不过有不同的难度：
1。以质粒的形式存在于菌体里，以质粒表达
这种一般保存还是容易的，多数情况下用抗生素压着就问题不大，而且直接用质粒保存，用时现转也能顺利表达的情况也有的是
2。重组在宿主基因组中，与宿主蛋白一起表达
这就保存起来比较困难了，毕竟不是原装货，很有可能穿几代以后就被踢出来了，有时即使没有踢出来也不表达了(我就遇到过，鉴定基因还在，就是不表达了)，很有可能插入的位点在宿主基因组的非活跃区域，过几代就基因沉默了。。。。
一般个人认为可以一试的方法包括
(1)用抗生素传代、保菌后抗生素复苏等等
(2)得到工程菌后第一代就保10管，取一管传一代再保10管，再取一管做使用菌株，也就是保存最原始的菌种
(3)筛选时多筛点，几十个菌株同时传代，5代以后(其实最好10-30代，可惜一般没那个精力)还能保留表达能力的算相对比较稳定了
异源蛋白的表达是个很复杂的问题，有许许多多的影响因素，而且由于蛋白本身千差万别，很难有一个很完善或很标准的流程方法。
另外，表达的宿主也是多种多样，目前比较常用的包括 E.coli，酵母（以甲醇酵母居多），昆虫细胞，哺乳动物细胞等，各自有着其本身的特点，优缺点各异。
但是，异源表达又是分子生物学中很重要的一个工具，园子里不少战友都在做这方面的工作，许多帖子在讨论这方面的问题。因此想发起一个针对这方面的专题讨论，希望有助于大家的工作，当然也希望能对自己的工作有所帮助，欢迎大家讨论。
还有，由于本人只做了有关E.coli和甲醇酵母的工作，其他虽然我们研究所也有人做，但毕竟本身没做过，若有错误或不严谨的地方欢迎战友们指正。
首先在这里提出几方面问题，希望大家讨论：
1. 宿主的选择。
表达宿主虽众多，但比较常用的也就 E.coli，酵母（以甲醇酵母居多），昆虫细胞，哺乳动物细胞等，各自代表了一种体系。
E.coli 原核宿主，无翻译后修饰。但周期短、费用低、表达量大，一直是最常用的宿主之一。蛋白一般很好表达，量很大，但很可能由于蛋白的翻译后修饰不完善而没有活性(或形成包涵体)，尤其是表达真核蛋白时最应注意。
酵母，有了比较完备的翻译后修饰系统，尤其是糖基化。但是个人感觉酵母表达异源蛋白时对蛋白本身的特点要求很大，有的蛋白表达量非常大，有的却几乎一点也没有，很折磨人。
昆虫细胞和动物细胞本
人没有做过，但园子里也有很详细的介绍，搜一下google也有不少，其中还有许多是画成了表格，对比各自的优缺点，网络不好，没找链接，希望有人可以不全，多谢多谢！
另外，也有很多用链霉菌表达的成功实例，不过个人感觉链霉做起来相当麻烦，周期长，转化困难，表达量也没什么优势，而且翻译后修饰虽然也有，但仍与真核差别较大。不过链霉菌有许多次级代谢产物（一些小分子物质）可能比蛋白表达本身更有意义，我们实验室就有很多人在做这方面研究。
2. 转化子、表达子的筛选
转化子的筛选，由于许多质粒是穿梭质粒，因此大多具有E.coli中的抗性筛选标记，筛选起来是很方便的（当然，我不清楚细胞方面的筛选，一般使用病毒载体吧，希望高手们介绍一下）。
但是转化成功的并不意味着能够成功表达目的蛋白了，因此还需要“表达子”的筛选，尤其是整合入基因组的片断（E.coli一般是游离质粒表达，好像不用再筛选了，有就有，没有就没有了）。我做的是毕赤酵母(GS115,pPIC9k)，在筛选过程中遇到了不小的问题，一般如果目的蛋白有些容易检测的特殊活性（比如抑菌活性），则筛选起来是比较容易的。但是如果没有，由于酵母是整合入基因组表达的，就不太好说了，我用原位点杂交的方法筛选过，效果不好，但筛选量倒挺大；还有就是5ml小量发酵筛选，工作量就比较大了，而且筛了400-500个也没有。
还有就是发现不同的筛选方法获得的阳性菌株好像不是很平行，将上述筛到的菌株放大到100ml时就没有了。请教师兄，他说有可能是不同水平发酵溶氧量差别很大，导致酵母生长状态差异，酵母又挺娇气的，差一点也不干活，比较郁闷。不知有没有解决的方法。
不知大家有什么好的筛选方法介绍一下吧。
3. 稀有密码子
由于是异源表达，不同宿主之间其密码子的偏好性就有不少的差异，这种差异经常直接导致了异源表达的失败。下面有几个问题，我有一些看法，希望大家能给与指导和帮助。
首先，如何确定是否是该问题导致的表达失败。我的一位同学给了我个判断方法的建议，觉得很有道理，和大家分享讨论。他建议我在不同水平简单检测一下表达的情况：基因水平，做个PCR之类的看看是否已成功转入（质粒或整合入宿主）；做个半定量RT-PCR看看mRNA 是否转录了；
再看看SDS-PAGE是否有蛋白表达。如果根本转化就失败了，没有什么好说的；如果基因进去了但mRNA没有表达，可能需要考虑启动子的问题，换个强启动子或干脆换个质粒；如果mRNA 转录了可没有蛋白翻译，那就需要考虑是否是密码子偏好性或mRNA二级结
构的问题了。
然后进一步查证，需要利用软件或上网查找是否存在这样的二级结构，以及是否含有稀有密码子影响了翻译。在这个问题上我试着查了一些网站，如http://www.kazusa.or.jp/codon/ ；http://gcua.schoedl.de/ ；http://www.genebee.msu.su/cgi-bin/nph-rna2.pl。等等。但是许多东西看不太懂，理解起来有困难。希望能有软件高手详细介绍一下用法，尤其是能分析自己片断是否含有很多稀有密码子或二级结构等。在此感谢了！
接下来就是如果确定有可能是稀有密码子问题如何解决？目前我见到的有两种方法，一是有些宿主比如大肠杆菌的Rosetta，是由BL21改造，整合了含稀有密码子tRNA的片断，使其能顺利表达的新型宿主菌，不知其他种类的宿主是否也有这种商业化的修饰菌；另外就是利用PCR等方法将片断上的稀有密码子改造（突变），换成其他编码同样氨基酸的密码子。当然，还可能干脆就换表达体系了，这一般是大家最不希望的了。
4. 菌种的保存、退化
一般来说是加甘油20%左右，-70保存；或制成干粉保存。但是在做甲醇酵母时发现了个问题，就是重组工程菌的退化现象比较严重，一般都是学生做得好好的，但是毕业以后下面的师弟一接手，蛋白就不表达了，或表达量非常的低。连续好几个师兄的结果都是如此，很是奇怪。我猜测可能是由于整合入基因组，毕竟是个外源的基因，不知整合到了染色体的什么部分，会不会过段时间就给“踢”下来，或就沉寂了？E.coli在复苏时都有抗性压着，酵母好像没有太合适的（不知pPICZ系列的那个抗生素好用不好用，但毕竟好贵
）。
我有个想法，是否也应像公司在做工程细胞时那样，挑个几十上百个，一起传代，10几代后仍然稳定表达的才说明基因整合到了合适的部位，不会再下来了？但是毕竟做研究生没那么多时间来干这个，否则万一不行毕业就困难了。有没有其他解决方法呢？盼高手。
5. 拷贝数对表达量的影响
对于“游离”的质粒，比如E.coli的BL21表达时，质粒的拷贝数是否对表达量有所影响？当然，由于大肠表达最主要的问题经常是表达太高了形成了包涵体，所以说白了应该希望表达量更低点的可能比较多，经常尝试各种方法（低温、低浓度IPTG等等）来降低表达量。那么BL21中的质粒是否是单拷贝的呢（没查过，不太清楚）？如果不是，能否通过降低拷贝数来降低表达量防止包涵体的形成呢？
至于酵母那种整合到基因组中的质粒，那么拷贝数是否对表达量有影响呢？通过我自己的经历，个人猜测还是有的。在上面讨论了菌种的退化问题，1年左右，重组的酵母表达蛋白就消失了。但是我曾
经将这些蛋白表达消失的重组菌作了PCR鉴定，发现外源的片断仍然是存在的，就是不表达了，那么是什么原因呢？我有几种猜测：一是可能整合的位置恰好是染色体的沉寂区了，过段时间以后就沉默了，不表达了；还有一种就是会不会是原来是高拷贝的重组菌在冻存以后退化了，变成低拷贝的了（也就是可能有蛋白表达但量很低了）。当然，我后来没有作进一步的验证，比如做个杂交确证以下拷贝数到底多少，只是一种猜测。
那么，如何提高重组酵母菌的拷贝数呢？对于较早的PAO815质粒，采用的多是体外重组的方法达到高拷贝后再转化；对于pPICZ系列和pPIC9k等等则分别采用Zeocin和G418抗生素筛选的方法筛选高拷贝的质粒；园子里还讨论过一种多重转化获得高拷贝重组菌的方法也值得一试
金属硫蛋白的生理作用
金属硫蛋白的生理作用 张俊燕 （化学化工学院云南师范大学昆明650500） 摘要： 金属硫蛋白（MT）在1987年根据MT命名委员会规定，具有：低分子量，6000-7000道尔顿，含有60~63个氨基酸残基；高金属含量，每个蛋白质分子可结合7~12个金属离子；氨基酸特征组成，半胱氨酸的含量占23%~33%，不含芳香族氨基酸和组氨酸；独特的氨基酸序列结构，即半胱氨酸残基的分布有特征性分布的保守性很强；所有的半胱氨酸残基均为还原态出现，并以金属离子通过巯基结合，从而具有金属巯基化合物的光谱特性；具有金属硫醇簇结构。特征的蛋白质或多肽被称MT。 本文重点介绍金属硫蛋白在，清除自由基、解除重金属的毒素、抗辐射、调节机体内的微量元素等方面的生理作用。 关键词：金属硫蛋白、自由基、抗辐射、重金属、微量元素、生理作用。 引言： 一、金属硫蛋白简介 金届硫蛋白(metaHothioneins，MT)是一类富含金属与巯基的非酶蛋白，广泛存在于生物界它与“硬梆榔”的金属有着一种奇妙的亲缘关系．它能和许多金属元素结台成各种金属斑蛋白，所以又称为“重金属结台蛋白”。 二、金属硫蛋白的结构
现代生化丹1f『技术的应用．使研究者对MT 的分干结构有了较深捌的了解不管从何种生物悼中分离出来的MT，分子量6000~7000，比一般蛋白质的分子量低，为低分子量蛋白质哺乳动物的MT分子一般为61～62个氨基酸残基所组成的多肽链。其中含半胱氪酸20个，约占l／3；6～8个赖氪酸，7～10十丝氪酸在氨基酸末端是单一的乙酰甲硫氪酸在MT分子中，含有2个金属硫簇，分别螯合4个和3十二价金属离子。金属离子与半胱氪酸残基的琉基共价结台令人惊奇的是．MT 的20个半胱氨酸琉基均处于还原状态[1]。 三、金属硫蛋白的一般特征 经实验表明，金属硫蛋白具有很强抗热变性和抗蛋白酶消化作用，并且不宜失活，在0~4℃条件下可存活2-3年，在常温条件下也可保存1.5年[1]。 四、金属硫蛋白的生理作用 1、解除重金属的毒性： MT的巯基基团（-SH）能强烈螯合有毒金属汞、银、铅、镉、砷、铬、镍等[2, 3]，其中螯合铅的强度比锌大200倍，而螯合镉的强度又比铅大10倍，并可将之排出体外，从而使它们无法毒害人体，同时对体内锌等微量元素无影响。MT是目前临床是最理想的生物整合解毒剂。 2、清除体内自由基、防止机体衰老： MT是细胞中防御自由基伤害的一种重要机制，可藉由自由基的清除来达到防止DNA伤害的发生[4]；是体内清除自由基能力最强的一种，其清除自由基的能力约为SOD的1,000倍[5]，而也是谷胱甘（GSH）
密码子偏好性与异源蛋白表达
密码子偏性与异源蛋白表达 原文：Claes Gustafsson, et al. TRENDS in Biotechnology, 2004,22(7): 346-353. https://www.360docs.net/doc/5017317141.html,/corp/images/MS102504CG.pdf 翻译：zhxm409511 在1977年，当Genetech的科学家和他们的科研合作伙伴首次利用细菌生产出人类蛋白（生长激素释放抑制因子）时[1]，蛋白的异源表达在整个生物技术产业中发挥着关键的角色。那时，仅知道生长激素释放抑制因子的氨基酸序列，还不知如何从人的基因组中克隆该基因，因此，Genetech小组采用数条寡核苷酸合成了14个密码子长的生长激素释放抑制因子基因。Itakura和同事们设计这些寡核苷酸时遵循了三条标准[1]。首先，优先使用MS2噬菌体偏爱的密码子——尽管当时对大肠杆菌的基因组DNA序列还知之甚少，却已刚刚完成了MS2噬菌体的测序，并认为该噬菌体的序列能够代表大肠杆菌高表达基因所使用的密码子。其次，消除寡核苷酸不必要的分子内和分子间配对，因为这可能影响基因合成。第三，避免那些先是富含GC随后是富含AT的序列，当时认为这种序列可能会导致转录终止。结果，利用这条合成的基因首次制生产出来了具有功能活性的多肽。 25年后的今天，大多数基因克隆自cDNA文库或直接利用聚合酶链反应（PCR）从相应的基因组中扩增获得。要尽量避免从头合成基因，因为这样做需要消耗大量的财力和人力[2]。尽管基于PCR的克隆被广泛使用，但很多情况下它还是不及所描述的那样快捷和容易。它经常需要一些不易得到的模板（对于具有内含子的生物，需要cDNA模板），此外还需要进行PCR条件的优化，需要对PCR产物进行测序，如果PCR引入了任何的配对错误，还经常需要通过定点突变进行修复。然而，当扩增出的基因克隆入表达载体后，真正有趣的事情就发生了：经常是没有蛋白表达或表达水平很低。人们已经进行了大量的研究，以提高克隆基因的表达水平，包括优化宿主的生长条件，建立新的宿主系，改用新的宿主，和无细胞系统[3]。尽管这些方法都取得了一些进展，但它们都是围绕一个最根本问题进行的：一种生物所采用的编码蛋白的DNA序列经常不同于另外一种生物在编码该蛋白时所采用的DNA序列。 为什么不同的生物会偏爱不同的密码子？ 遗传密码采用61组三连核苷酸（密码子）编码20种氨基酸，采用3个密码子终止翻译。因此每个氨基酸利用1个（Met和Trp）至6个（Arg，Leu，和Ser）同义密码子编码。这些密码子在核糖体中被互补的tRNAs阅读，而这些tRNAs已经事先携带了相应的氨基酸。密码子的兼并性使得同一蛋白可采用多种不同的核苷酸序列编码。对于两种不同的生物，或对于同一生物的高表达和低表达基因，有时甚至在同一个操纵子内部，对不同密码
1-大肠杆菌重组蛋白表达提取及纯化实验(最新整理)
第一天 1、配置LB培养基： 酵母粉15g、胰蛋白胨30g、氯化钠30g，定容至3000ml。调节PH至 7.4（2M NaOH），高压蒸汽灭菌20分钟，37℃保存。分装成15瓶（每瓶200ml）。 2、接种（超净台要提前杀菌通风） 取4瓶上述培养基，每瓶加200μlAMP（1:1000）、60μl菌液。37℃过夜。 第二天 1、扩大培养（超净台） 4瓶扩至16瓶，每瓶培养基加200μlAMP，摇床培养1小时左右。 2、诱导（超净台） 加40μlIPTG，加完后去除封口的除牛皮纸，扎口较松。25℃摇床培养4小时。 3、离心获取菌体 4℃，8000rpm离心25分钟。注意配平。 4、超声波破碎菌体 离心后去上清，向沉淀加入（600mlPB裂解液、300μl溶菌酶、3mlPMSF）。将菌液转入2个烧杯中，冰浴超声波破菌，400W，75次，每次6秒，间隔2秒。离心收集上清液。 600mlPB裂解液：20mM/L PB，10mM/L EDTA，5%甘油，1mM/L DTT，调节PH至7.4。 超声波破碎：首先用去离子水清洗探头，再将盛有菌液的小烧杯置于有冰 水混合物的大烧杯中，冰水界面略高于菌液面即可。探头浸没于菌液中，不可伸入过长。注意破菌过程中由于冰的融化导致的液面变化。 5、抽滤（双层滤纸) 洗胶（GST）。将上述上清液抽滤，滤液与GST胶混合，磁力搅拌过夜。 第三天
1、抽滤蛋白-胶混合液，滤液取样20μl，留电泳。 2、洗杂蛋白，用1×PBS+PMSF(1000:1)约400ml，洗脱若干次，用移液枪吸去上层泡沫（杂蛋白），至胶上无泡沫为止。 3、洗脱目的蛋白，洗脱液加50ml，分3次进行（15+15+15），每次加入后间歇搅拌，自然静置洗脱15分钟，抽滤，勿使胶干，合并洗脱液，取样20μl，留电泳。用洗脱液调零，测OD280。（OD值达到1.5为佳） 4、将洗脱液置于透析袋中（透析袋应提前煮好），将透析袋置于2L透析液1中，加入磁珠置于4℃冰箱内磁力搅拌器上，4小时后换为透析液2。胶的回收：用3M氯化钠溶液（用1×PBS溶液溶解）、1×PBS（无沉淀）洗涤，20%乙醇洗脱，装瓶。 洗脱液：50mM/LTRIS-HCL 、10mM/LGSH 透析液1：20mM/L TRIS-HCL、1mM/L EDTA 、0.15mM/L DTT 透析液2：:0.5mM/L EDTA、1×PBS
重组蛋白表达系统的选择
重组蛋白表达系统的选择、表达策略和方法学研究 宁
1. 前言 在生命科学的很多研究和应用领域中，如何获得大量、均一、高纯、有活性的蛋白质都是一个关键问题。现代重组蛋白表达技术为我们提供了多种选择：传统的大肠杆菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞表达系统以及较新的植物和体外表达系统。每种表达系统都有很多成功的例子，但重组蛋白的个性不尽相同，没有任何一个系统和方法是普遍适用的，为目的蛋白选择一个恰当的表达系统也就成为表达工作的重中之重。 关于目的蛋白的一切信息，对表达系统的选择都是有帮助的，有几个最基本的问题一定要在表达之前回答清楚：目的蛋白的来源是原核还是真核生物？具有什么样的功能？分子量和聚合状态？是膜蛋白还是水溶蛋白？胞表达还是分泌表达？是否需要以及需要何种翻译后修饰？有没有配体、底物或产物类似物可以利用？对蛋白酶是否敏感？有多少分子及分子间二硫键？对目的蛋白的表达量、活性、表达速度和成本有怎样的要求？除了摸清目的蛋白的脾性，还要清楚各个表达系统的特点、优势和局限性，才能找到表达工作的大略方向，要获得最适合目的蛋白的表达方案，还需要在具体实验中调整优化。 表1比较了目前常用的表达系统的特点，并给出了粗略的适用围。 大肠杆菌酵母昆虫细胞哺乳动物细胞流程简单简单复杂复杂 培养基简单简单复杂复杂 成本低低中高 产率高中中低 表达量高高较高较低 蛋白折叠中较好较好好 胞外表达周质空间分泌至培养基分泌至培养基分泌至培养基 细胞增殖周期30min 90min 18H 24H 折叠常有错误折叠偶有不当折叠正确折叠正确 二硫键难以形成有有有 N-糖基化无甘露糖残基，高无唾液酸，简单复杂 O-糖基化无有有有 磷酸化无有有有 酰化无有有有 γ-羧基化无无无有 适用原核蛋白、简单 真核蛋白 真核蛋白、分泌 表达蛋白 真核蛋白、分泌 表达蛋白 复杂高等真核生 物蛋白 表1：常用表达系统比较
甜瓜属人工异源四倍体Cucumis×hytivus早期世代表型与基因表达变化研究
甜瓜属人工异源四倍体Cucumis×hytivus早期世代表型与基因 表达变化研究 多倍体化是高等植物进化过程的重要阶段,是植物进化的主要动力之一。研究表明,异源多倍体在形成的早期可发生广泛的基因组构成和基因表达水平的变化,与此同时,异源多倍体形成早期也常表现出不同于其二倍体祖先、且不能用孟德尔定律解释的新表型,这些变化直接关系到物种的形成和稳定。 分子标记及比较基因组学的发展为认识种间杂交和多倍体化进程提供了重 要依据。前人研究天然异源多倍体进化过程中发生的种种变化主要是通过比较其与二倍体祖先的“候选”后代而进行的。 但现有的天然异源多倍体大多数形成于成千上万年以前,基因组经历了长期的“多倍体二倍化”过程,其二倍体祖先也不断进化或已灭绝,因此很难确定它们在早期进化中发生的表型和基因表达变化的具体过程和机制。新合成的异源多倍体及一些“年轻”的异源多倍体,由于其亲缘关系明晰,为准确、深入研究多倍体基因组进化及相关机制提供了良好的模式系统。 通过这种模式系统,可以精确比较亲本二倍体种与人工异源多倍体早期世代间的表型和基因表达变化特点,从而为丰富多倍体物种进化理论提供重要的例证。本研究基于实验室已合成的甜瓜属人工异源四倍体C.×hytivus(2n=4x=38),比 较研究了其早期世代间的形态学和细胞学变化特征、基因表达变化的特点和黄瓜por基因在异源四倍早期世代的表达和序列变化特征,探讨了异源多倍化引发以 上变化的相关机制。 具体如下：1.甜瓜属人工异源四倍体C.×hytivus早期世代表型变化研究研究了甜瓜属人工异源四倍体C.×hytivus早期四个自交世代S1-S4的主要形态学
金属硫蛋白基本知识
金属硫蛋白 1、MT命名及定义 根据与 MT结合的金属的不同，对只舍一种金属，例如 Cd或 Cu等，可分别定名为镉金属硫蛋白或铜金属碗蛋白等；还可根据结合金属的摩尔含量写成 Cd 7–MT、Zn 7 –MT等 (表示每分子结合7个分子Cd或Zn)。对于含一种以上金属， 如同时含 Cd和Zn时，可写成Cd，Zn-MT。对其分子结构上的差别，可用罗马数字和小写字母标出，例如MT-Ⅱ、MT-Ⅰ、MT-Ⅱ a 等。 经典MT定义：根据金属硫蛋白命名委员会（Thecommitteeon the Nomenclature of Metallothionein）的建议，1988年，Kagi将具有以下特征的蛋白质或多肽定义为MT（Kagi & Schaffer, 1988）。 1.低分子量，一般为6,000－7,000道尔顿，含60-63个氨基酸残基； 2.高金属含量，每分子蛋白质可结合7个二价金属离子，或多至18个一价金属离子； 3.特有的氨基酸组成，无芳香族氨基酸及组氨酸； 4.富含Cys残基(约23-33%)，无二硫键；特征的氨基酸序列，Cys残基在氨基酸序列中占据相当保守的位置； 5.所有的Cys残基均以还原态存在；并通过巯基以硫酯键结合金属离子；从而具有金属巯基化合物的特征吸收光谱。 实际上，这只是对经典MT的一个定义。现在MT家族所包括的成员远远超出以上定义的范围。 ※ Cys半胱氨酸 2、MT的分类 1.1 根据 MT的结构差异，一般将其分3类 第1类：MT的氨基酸序列中的半胱氨酸位置与最先从马肾中分离的 MT的氨基酸序列中的半胱氨酸位置紧密相关的多肽。所有哺乳动物的 MT都属于这一类。其它来源的 MT只要其基本结构与哺乳动物的MT相似亦归这一类。 第2类：MT氨基酸序列结构中的半胱氨酸位置与马肾 MT关系较远，与哺乳动物 MT没有或很少有相似的进化关系。如酿酒酵母和某些高等植物的 MT属于这一类。 第 3类：非典型的 MT。是一类由非转译合成的金属硫醇盐多肽，由γ-谷氨酰半胱氨酰基单元组成。这类MT主要来源于真核微生物，常称之为类 MT。依据它们之间的差异，又可分为4种类 MT： 第一类：含大量的酸性氨基酸残基，天冬氨酸含量大于 14％，谷氨酸含量大于18％，这类 MT仅被Cu、Ag诱导。 第二类：它们由同样的肽基亚单位构成，基本结构为γ-谷氨酰肽或称(γ -EC) n G 或 (γ-Glu-Cys) n -Gly。 第三类: MT不舍芳香族氨基酸，分子量为9～9.5kD。
异源表达
异源表达确实是个很困难的课题，不同的体系、菌种、载体，不同的组合，确实不知道会有哪种适合目的基因 另外重组工程菌的稳定性也是个难题，不过有不同的难度： 1。以质粒的形式存在于菌体里，以质粒表达 这种一般保存还是容易的，多数情况下用抗生素压着就问题不大，而且直接用质粒保存，用时现转也能顺利表达的情况也有的是 2。重组在宿主基因组中，与宿主蛋白一起表达 这就保存起来比较困难了，毕竟不是原装货，很有可能穿几代以后就被踢出来了，有时即使没有踢出来也不表达了(我就遇到过，鉴定基因还在，就是不表达了)，很有可能插入的位点在宿主基因组的非活跃区域，过几代就基因沉默了。。。。 一般个人认为可以一试的方法包括 (1)用抗生素传代、保菌后抗生素复苏等等 (2)得到工程菌后第一代就保10管，取一管传一代再保10管，再取一管做使用菌株，也就是保存最原始的菌种 (3)筛选时多筛点，几十个菌株同时传代，5代以后(其实最好10-30代，可惜一般没那个精力)还能保留表达能力的算相对比较稳定了 异源蛋白的表达是个很复杂的问题，有许许多多的影响因素，而且由于蛋白本身千差万别，很难有一个很完善或很标准的流程方法。 另外，表达的宿主也是多种多样，目前比较常用的包括 E.coli，酵母（以甲醇酵母居多），昆虫细胞，哺乳动物细胞等，各自有着其本身的特点，优缺点各异。 但是，异源表达又是分子生物学中很重要的一个工具，园子里不少战友都在做这方面的工作，许多帖子在讨论这方面的问题。因此想发起一个针对这方面的专题讨论，希望有助于大家的工作，当然也希望能对自己的工作有所帮助，欢迎大家讨论。 还有，由于本人只做了有关E.coli和甲醇酵母的工作，其他虽然我们研究所也有人做，但毕竟本身没做过，若有错误或不严谨的地方欢迎战友们指正。 首先在这里提出几方面问题，希望大家讨论： 1. 宿主的选择。 表达宿主虽众多，但比较常用的也就 E.coli，酵母（以甲醇酵母居多），昆虫细胞，哺乳动物细胞等，各自代表了一种体系。 E.coli 原核宿主，无翻译后修饰。但周期短、费用低、表达量大，一直是最常用的宿主之一。蛋白一般很好表达，量很大，但很可能由于蛋白的翻译后修饰不完善而没有活性(或形成包涵体)，尤其是表达真核蛋白时最应注意。
金属硫蛋白在肺癌细胞系中的表达及其临床意义
金属硫蛋白在肺癌细胞系中的表达及其临床意义【摘要】目的探讨肺鳞癌、腺癌中金属硫蛋白在肺癌细胞系中的表达。方法运用sp免疫组化方法检测检测肺癌细胞系的表达定位。结果 mt在肺癌细胞系a549、be1表达，均为胞浆表达。在hbe为胞核表达。结论 mt在非小细胞肺癌转移起促进作用。 【关键词】金属硫蛋白；肺癌；转移 doi：10.3969/j.issn.1004-7484（x）.2012.08.120 文章编号：1004-7484（2012）-08-2512-01 expression and clinical significance of metallothionein in lung cancer cell lines liu jun，zhang yun-biao，zhang ting，shen xiao-xia，zhang jun-yi，jiang gui-yang 1.liaoning province shenyang city sujiatun district hospital pathology department，liaoning shenyang 110101； 2.liaoning province shenyang hunnan new district hospital，liaoning shenyang 110068； 3.department of ophthalmology the first affiliated hospital china medical university，liaoning shenyang 110001； 4.the fourth affiliated hospital of liaoning university of traditional chinese medicine department of hemodialysis，liaoning shenyang 110101； 5.department of pathology，chifeng university school of
金属硫蛋白综述
金属硫蛋白（Metallothionein，MT) 综 述 报 告 王吉
目录 一、MT的主要生理功能…………………………………… (一)重金属的去除解毒功能………………………………… (二)自由基的清除功能……………………………………… (三)抗肿瘤功能……………………………………………… 二、金属硫蛋白提取工艺………………………………… (一)MT的诱导………………………………………………… (二)MT的提取与分离纯化…………………………………… (三)MT的检测方法…………………………………………… 三、MT的应用……………………………………………… 四、MT的研究展望…………………………………………
金属硫蛋白（Metallothionein，MT） ——综述报告 王吉 摘要：金属硫蛋白(metallothionein，MT)是一种广泛存在于生物界、低分子 量、高金属含量、功能独特的蛋白质。目前，对MT的研究已涉及农业、医药、生物 化学、分子生物学、环境科学、卫生毒理学、食品科学、营养学、保健科学和方法学 等领域，其特殊的理化性质与结构及独特的生物学功能在疾病的发生、发展、诊断及 发病机制探讨中显示了重要作用。 关键词：金属硫蛋白MT，医学，环保，动物养殖 前言：金属硫蛋白(metallothionein，MT) ，化学名为金属硫组氨酸三甲基 内盐，是一类广泛存在于生物中的低分子质量(2 ～7kD)、富含半胱氨酸(20%～30%)、 不含组氨酸和芳香族氨基酸的一类金属结合蛋白质。MT能被金属、细胞因子、荷尔蒙、 细胞毒性药物、有机化学药物和应激等诱导。自1957年Margoshoes等首次报道从马 肾中分离得到Cd-MT以来，MT成为基础和应用科学的热点之一，也是我国“863 ”重 大攻关课题和“火炬”计划之一，我国在MT 的研究和应用方面已经在国际上占有重 要一席。但目前，人们对金属硫蛋白在生物学上的功能的认识远远不够，还有待进一 步研究。临床实验证明，MT具有调节生物体内微量元素浓度以及对重金属的解毒作用， 此外它对激素、细胞代谢的调节，细胞分化和增殖的控制以及参与紫外(UV)诱导反应 和清除自由基都有重要作用。对MT的研究和开发利用涉及农业、医药、保健、生物 工程、环境保护等各个领域。到目前为止，已经在瑞士、日本、美国、中国等国家相 继召开了 5 次金属硫蛋白国际会议。 一、MT的主要生理功能 (一)重金属的去除解毒功能 目前，金属硫蛋白解毒机理尚不明确，可能通过这样3 个途径： 1.与重金属螯合成无活性的复合物； 2.螯合重金属，并将其排出体外； 3.减少金属的进入量。目前普遍让人接受的一种观点是还原条件下MT通过巯基与金属离 子结合再形成Cys-M 或Cys-M-Cys 键。 (二)自由基的清除功能 正常情况下，参与代谢的氧大多数与氢结合生成水，然而有一部分氧被酶催化形成超氧阴离子，后者又可以形成氧化氢，它们都属于自由基。自由基有很多种，如氧自由基和羟自由基。一般来说，动物体组织内自由基较少，其参与体内的重要有益的反应。但当机体处于病理或应激时，体内自由基产生过多，就使机体许多重要的生物大分子发生不可逆的氧化损伤，从而导致细胞结构和功能的破坏甚至导致细胞的突变。由于MT具有特殊的化学结构，
低温脂肪酶基因的异源表达
低温脂肪酶基因的异源表达 引言 低温脂肪酶是一种胞外酶，酶的产生要经过异源表达，修饰折叠，最终分泌至细胞外。决定脂肪酶表达的因素是多方面的，如宿主、外源基因、外界环境以及它们之间的相互作用等。低温脂肪酶的异源表达大多选择大肠杆菌做为宿主。 现已发现分子伴侣能识别并调节细胞内多肽的折叠。如果宿主体细胞分子伴侣与外源基因表达所需要的分子伴侣不匹配，外源基因便不能正确表达。革兰氏阳性菌所产脂肪酶首先以“前酶原”的形式表达，酶的前体区域(pre．region)为信号肽，运输酶原至细胞外，酶原在胞外经蛋白酶水解后断裂产生成熟酶。Rosenau将革兰氏阴性菌脂肪酶的分泌机制概括为三种类型。 (1)含有ATP结合盒(ABC)的输出体(ATP-binding cassette exporter)。这种类型适用于N端缺少代表性的信号序列，但c端包含靶信号序列的脂肪酶的分泌。ABC输出体包括三种蛋白质，由内而外依次是ATP酶，弓型的细胞膜融合蛋白(MFP)和外膜蛋白(OMP)。三种蛋白质组合体横跨内外细胞膜，从而在周质中形成通道直接将酶分泌到胞外。 (2)分泌子(secreton)介导的分泌。这种类型主要由xcp基因编码的蛋白质组成，其分布于细胞内外膜，并在外膜形成孔状通道。 (3)自输送体(autotransporter)介导的分泌。通过该途径分泌的脂肪酶尽管分泌到胞外，但仍然与细胞表面密切相连或紧紧固着在细胞表面。脂肪酶包含两个独特的结构域，N端具有催化活性并且暴露在细胞外，c端结构与所谓的自动输送蛋白(autotransporterprotein)类似，通过形成B．折叠结构的分泌通道协助将脂肪酶N端转运出外膜。 Quyen在对脂肪酶异源表达的研究时发现，在分子伴侣的作用下，大肠杆菌中表达的P．cepacia 的脂肪酶可以分泌。但也有学者研究发现，能表达脂肪酶并不意味着能完全分泌至胞外。有一部分菌表达的重组蛋白存在于周质中，只有少部分分泌至胞外。Feller研究发现，莫拉氏菌TA144的脂肪酶在大肠杆菌中表达后，培养物的上清液几乎没有酶活性，而菌悬液有一定的酶活力，说明脂肪酶没有分泌到胞外，而是存在与外周质空间或镶嵌于细胞膜上。迄今为止，已经有多例低温脂肪酶能用基因工程技术成功表达的报告。Choo等将分离自阿拉斯加土壤的适冷的假单胞杆菌的低温脂肪酶基因在大肠杆菌中表达。其最适pH为8．0左右，在45℃时酶活力最高。以对硝基苯月桂酸酯为底物计算酶的活化能为7．7kcal／mol，低于其它南极适冷菌的12~~~~~~~17 kcal／mol，和中温铜绿假单胞菌的25 kcal／mol。Feller_9 报道了一株南极适冷型莫拉氏菌的脂肪酶基因在中温型大肠杆菌中的克隆与表达。结果发现，包含有耐冷型脂肪酶编码基因的克隆只有在生长温度从对应嗜温菌的最适生长温度37℃降至25~C或17℃以后，才表达有酯解活力脂肪酶，从而防止基因产物的热变性，重组酶的最适温度比野生型低了10~C，而且异源表达的脂肪酶比野生型具更明显的热不稳定性。Rashid[1 将深海分离出的假单胞杆菌KB700A脂肪酶基因在大肠杆菌中成功表达。其基因序列与中温菌P． P．fluorescens 的脂肪酶基因的序列同源性可达90％，该脂肪酶只有在Ca 作用下才表现酶活力，另外添加Mn2+ 、Sr2+ 等离子以及去垢剂皆可提高酶活。
实验三 重组蛋白的表达及Western boltting鉴定
实验三重组蛋白的表达及Western boltting鉴定 一、实验内容 1．重组蛋白在大肠杆菌中的诱导表达。 2．重组蛋白的Western boltting鉴定。 二、实验要求 通过实验，要求学生掌握外源基因在原核细胞中表达的方法，掌握Western bolt的基本原理、实验操作步骤及注意事项。 三、实验方法 1．重组蛋白的原核表达与SDS-PAGE分析 （1）将含有重组质粒的细胞在LB平板（含抗生素）上划线，37℃培养过夜。（2）从LB平板挑取单菌落分别移至2 mL的LB培养液（含抗生素），37 ℃振荡培养过夜。 （3）将过夜培养物按1：100转接于2 mL的LB培养液（含抗生素），37℃继续振摇培养至细菌生长对数中期（OD600值达0.5～0.6）。 （4）加入IPTG至终浓度0.5 mmol/L，37℃诱导表达3～6 hr。 （5）取200 μL菌液装入1.5 mL Eppendorf管中，以5000 rpm离心1 min，得到菌体细胞。将细胞重悬于30 μL水，再加入10 μL 4 × SDS-PAGE加样缓冲液，混匀，100℃煮沸10 min后，12,000 rpm离心2 min，吸取上清转移至另一新的离心管中。 （6）样品取5~10 μL进行SDS-PAGE分析。 2．Western blot分析 （1）取4 μL阳性克隆诱导后的样品，利用15%SDS-PAGE电泳分离。 （2）用半干式电转移法将蛋白转至NC膜上。 a.将聚丙稀酰胺凝胶浸泡在电转移缓冲液中平衡10 min。 b.裁剪与凝胶大小相同的NC膜，在电转移缓冲液中平衡10 min。 c.裁剪合适大小的滤纸，用电转移缓冲液浸润，按阳极、三层滤纸、NC膜、 凝胶、三层滤纸、阴极的顺序叠放电转移三明治。 d.按0.5 mA/cm2膜恒流电转移30～50 min。 （3）杂交 a.将NC膜在5%脱脂奶封闭液中室温反应1 hr。 b.TBST漂洗3 × 10 min c.转移膜至用TBST1：100稀释的一抗工作液（抗六个组氨酸单克隆抗体）中， 室温反应1 hr。 d.TBST漂洗3 × 10 min e.转移膜至用TBST1：2000稀释的辣根过氧化物酶（HRP）偶联的羊抗兔I gG
重组蛋白的表达
重组蛋白的概述 1.概述 分离纯化组成了基因工程的下游处理（downstream processing）阶段，这一过程又和上游过程紧密相联系，上游过程的诸方面影响到下游的分离纯化，所以在进行目标蛋白质表达纯化时要统一考虑和整体设计，并充分考虑上游因素对下游的影响，如是否带有亲和标签，是否进行分泌表达。目前应用最广泛的表达系统有三大类，分别是大肠杆菌表达系统、酵母表达系统和CHO细胞表达系统，不同的表达系统和培养方法显著影响下游的处理过程，目标蛋白表达是否形成包涵体，目标蛋白表达的定位（胞内、细胞内膜、周质空间和胞外），蛋白表达的量都依赖于所选择的表达系统。选择将所表达的蛋白分泌到细胞外或周质空间可以避免破碎细胞的步骤，并且由于蛋白质种类少，目标蛋白容易纯化；而在细胞质内表达蛋白，可能是可溶性表达，可能形成包涵体，可溶性的蛋白往往需要复杂的纯化步骤，而包涵体易于分离，纯度较高，但回收具有生物活性的蛋白却变的相当困难，需要对聚集的蛋白进行变复性，通常活性蛋白的得率比较低，表1列出了不同策略对表达、纯化的影响，对于其中的有些缺点可以通过一定的方法进行克服和避免，如利用DNA重组技术给外源蛋白加上一个亲和纯化的标签，有助于可溶性外源蛋白的选择性纯化，并能保护目标蛋白不被降解（96）。 表 1 重组蛋白不同表达策略的优点和缺点 表达策略优点缺点 分泌表达至细胞外增强正确二硫键的形成 降低蛋白酶对表达蛋白的降解 可获得确定的N末端 显著减少杂蛋白水平，简化纯化 不需要细胞破碎 表达水平低 多数蛋白不能进行分泌表达表达蛋白需要进行浓缩 细胞周质空间表达增强正确二硫键的形成 可获得确定的N末端 显著减少杂蛋白水平，简化纯化好些蛋白不能分泌进入周质空间没有大规模选择性的释放周质空 间蛋白的技术 周质蛋白酶可引起重组蛋白酶解 胞内包涵体表达包涵体易于分离 保护蛋白质不被降解 蛋白质不具有活性对宿主细胞生 长没有大的影响，通常可获得高的 表达水平需要体外的折叠和溶解，得率较低具有不确定N末端 胞内可溶性蛋白表达不需要体外溶解和折叠 一般具有正确的结构和功能高水平的表达常难以得到需要复杂的纯化 可发生蛋白质的酶解具有不确定的N末端 在细胞的提取物中，除了目标蛋白外，还含有其它各种性质的蛋白、核酸、多糖等。在这样一个混合体系中，蛋白质纯化要求将目标蛋白与其它的成分分离，得到一定的量，达到一定的纯度，同时要尽可能保留蛋白的生物活性，并使蛋白保持完整。所以蛋白质的分离纯化可以看作是一系列的分部收集过程，总是希望目标蛋白富集于其中的一个收集部位，而大量的杂蛋白存在于其它的收集部位。当然对目标蛋白纯度的要求要根据纯化蛋白的用途而定，对于治疗性的蛋白要求有大于99%的纯度，并对处方有活性和稳定性的要求，对于某些酶的纯度则要求较低，需要在纯度和得率之间进行一个平衡，所以下游的工艺流程取决于最终对目标蛋白的要求。 蛋白质的功能依赖于蛋白质的结构，对于有生物活性的蛋白质，在分离纯化过程中必须根据目标蛋白的特点，采用合适的操作条件和方法，保证目标蛋白的活性尽量不损失。除了在分离纯化的
重组蛋白IFNGA在大肠杆菌中的表达与纯化
高中组11年级 生物化学 3人项目 重组蛋白IFNGA在大肠杆菌中的表达与纯化
重组蛋白IFNGA在大肠杆菌中的表达与纯化 摘要： 干扰素γ（Interferon gamma，IFN-γ）是体内重要的细胞因子，能够通过调控免疫相关基因的转录协调机体的免疫反应，具有抗病毒、抗肿瘤、增强免疫力能功能。目前对于IFN-α、IFN-β重组表达的较多，而关于IFN-γ 蛋白的纯化表达较少.因此,本研究使用PCR方法扩增IFN-γ基因，将IFN-γ基因分别插入原核表达载体pET-30构建重组表达质粒pET-30--IFN-γ，转化大肠杆菌BL21和Rosetta菌株，在IPTG诱导下表达IFN-γ，SDS-PAGE分析重组表达蛋白。结果表明：成功构建重组表达质粒pET-30-IFN-γ；表达产物主要以包涵体形式存在；经Ni2+-NTA亲和层析纯化，获得高纯度重组蛋白。本实验纯化的蛋白有望在今后用于医学和生物学研究中。 关键词：干扰素；IFN-γ 蛋白；大肠杆菌表达系统；重组表达；蛋白纯化； 一、研究背景 干扰素（IFN）是一种广谱抗病毒剂，并不直接杀伤或抑制病毒，而主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制病毒（比如：乙肝病毒）的复制。其类型分为三类，α-（白细胞）型、β-（成纤维细胞）型，γ-（淋巴细胞）型；同时还可增强自然杀伤细胞（NK细胞）、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力。干扰素是一组具有多种功能的活性蛋白质（主要是糖蛋白），是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。它们在同种细胞上具有广谱的抗病毒、影响细胞生长，以及分化、调节免疫功能等多种生物活性。 其中，IFN-γ是体内重要的免疫调节因子，能通过与细胞表面受体结合，诱导病毒感染细胞产生多种抗病毒蛋白，使细胞内产生抗病毒状态而发挥抗病毒作用。在诱导效应因子表达的同时，由于IFN-γ能够提高细胞表面MHC分子的表达，增强免疫活性细胞对病原体的杀伤作用，从而协同促进了机体对病毒感染细胞的杀灭，而使机体处于抗病毒状态。虽然各种类型的干扰素均能介导细胞对病毒感染的反应，但IFN-γ 的免疫调节活性在协调免疫反应和确定机体长期的抗病毒状态中发挥更为重要的作用。其作用可大致总结为以下几点：①抗增生
大肠杆菌高效表达重组蛋白策略
大肠杆菌高效表达重组蛋白策略 前言 重组蛋白的制备在蛋白结构分析和医疗应用领域十分重要。药物蛋白的研究需要高纯度的重组蛋白来进行药物动力学和物理化学的研究[1]。重组蛋白在检测酶活、连接配体、蛋白相互作用等生物学领域广泛应用。已经表达出多种重组蛋白被证明有很大的应用潜力[2,3]。通过基因工程改造的方法已经获得了许多性状优良的宿主菌表达系统，尤其是通过大肠杆菌可以大量表达外源基因编码的重组蛋白[4]。但是仍然有两个问题制约着大肠杆菌表达系统对重组蛋白的表达：一个是表达量低，还有一个就是表达错误折叠的蛋白包涵体[5]。蛋白的表达和纯化工艺一直在发展进步，但是超过30%的重组蛋白为不具有生物活性的包涵体，严重影响了重组蛋白的生产应用[6,7]。 在理想条件下，重组蛋白由强启动子进行表达，产生大量的具有生物学活性的可溶性重组蛋白。但是，强启动子会导致重组蛋白的过表达,从而影响宿主菌体的生长并产生包涵体[8]。在某些条件下可以通过变性、复性的方法使包涵体恢复活性[9]，但是复性后的蛋白是否能够完全恢复活性仍然未可知。一般来讲，可以通过表达条件的优化来促进蛋白的可溶性表达，比如：诱导温度、培养基组成、宿主菌的种类。还可以通过多种方案来解决蛋白不溶的问题：蛋白重新折叠[10]，构建融合蛋白[11]。另外想要进一步增加蛋白可溶性可以与分子伴侣共表达[8]或者低温诱导[12]。本文对目前主要的促进蛋白可溶表达的方法进行了比较全面的总结。 1.大肠杆菌表达系统的构建 1.1选择表达宿主菌 对于大规模的表达重组蛋白，一般选择胞内表达或者周质空间表达。与周质空间表达相比，胞内表达的表达量更高，因此应用更为广泛。在实验研究和实际生产中，已经有很多大肠杆菌表达系统广泛应用于。在表达体系中较为常用的大肠杆菌为B菌株和K12菌株及它们的衍生菌株（表1[13]）。美国国立研究院已经认证了K12菌株的标准性以及安全的使用方案，因此K12菌株在生产应用中具有极大的优势。但是由B菌株演变而来的BL系列菌株与K12相比，突变了lon 和ompT两个基因[14]，因此具有许多表达优势：产物积累少，缺少蛋白酶，防止产物被降解。这些优势使得BL菌株也具有非常广泛的应用[15,16,17]。 通常来讲，针对不同的重组蛋白，宿主菌的选择也是不同的。如果重组蛋白含有大肠杆菌稀有密码子，就需要宿主能够表达针对这些密码子的tRNA，比如BL21 (DE3) CodonPlus-RIL，Rosetta (DE3)等菌株。如果重组蛋白具有许多二硫
9重组蛋白表达——可溶性表达
1.表达工程菌 蛋白可溶性表达很大原因取决于二硫键和正确折叠的问题，所以选用利于二硫键形成的宿主菌，如Origami(DE3), Origami B(DE3),Rosetta Origami(DE3) 等更利于蛋白表达。 2.促溶标签 前文的列表中已经详细列出，并简要介绍功能特点，值得注意的是选用促溶标签时，一定要考虑载体情况和表达工程菌的配合，如Trx标签主要是促进二硫键的配对，必须配合Origami(DE3)之类的工程菌使用，如果使用BL21(DE3)通常不会使目标蛋白的可溶性得到改善。 3.分子伴侣表达 在表达工程菌内同时装入一个表达伴侣蛋白的表达质粒，表达伴侣蛋白的质粒必须与表达外源蛋白的质粒避免“质粒不相容性”。目前，常用于大肠杆菌表达的分子伴侣主要是DNak(DnaJ,GrpE)和 GroEL(GroES)等，科研人员可根据自己的实验需要构建合适的分子伴侣质粒，含分子伴侣质粒的感受态细胞已经有商业化的产品BL21(pG-KJE8、pGro7、pKJE7、pG-Tf2、pTf16)系列,实验人员可以根据具体情况选购。 4.启动子选择 载体的启动子对于可溶性表达影响至关重要，pET系列的 T7/T7 lac为强启动子，强启动子在提高蛋白产量的同时也增强了包涵体的形成，如果遇到此种情况可以考虑换用弱启动子的载体，如pGEX系列，还可选择含cspA启动子的pCold系列载体。 5.分泌性表达 将外源目标蛋白分泌表达到培养基中，实现这个功能需要将原核蛋白信号肽序列加到外源蛋白的上游即可；目前，福因德生物已经开发出pFRD-pelB系列载体，可以帮助实现在大肠杆菌中分泌表达。 6.培养条件的优化 最常用的优化条件为：诱导温度、诱导剂浓度和诱导时间；还可以优化培养基的营养成分和离子物质，比如，我们使用营养成分稍低的LB培养基，可同时向培养基中添加葡萄糖，镁离子、氯化钠、硫酸铵等盐离子。 1）低温诱导:比如20℃,低温情况下,转录和翻译变慢,蛋白质浓度低,有更多的时间正确折叠； 2）向培养基中加入0.4M蔗糖，高渗引起了渗透性休克反应，该反应增加了细胞内谷氨酸、脯氨酸和海藻糖的水平，为蛋白的正确折叠提供了环境； 3）42℃短暂热休克，然后降温到20℃：热休克增加了DnaK/J和GroEL/ES的水平，通常的程序是37℃培养到A600nm=0.5,然后快速升温到42℃维持15min左右，然后降到20℃并诱导蛋白的表达。 4）自诱导培养基，适合于T7启动子系列的诱导表达，当工程菌增长到一定密度后，自己缓慢开启诱导开