平板划线法与稀释涂布平板法的区别
平板划线法与稀释涂布平板法的区别
一、平板划线分离法
由接种环以菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。
用途：一般多用于从菌种的纯化；
优点：可以观察菌落特征，对混合菌进行分离；
缺点：不能计数；
二、稀释涂布平板法：
稀释平板计数是根据微生物在固体培养基上所形成的单个菌落，即是由一个单细胞繁殖而成这一培养特征设计的计数方法，即一个菌落代表一个单细胞。计数时，首先将待测样品制成均匀的系列稀释液，尽量使样品中的微生物细胞分散开，使成单个细胞存在（否则一个菌落就不只是代表一个细胞），再取一定稀释度、一定量的稀释液接种到平板中，使其均匀分布于平板中的培养基内。经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数。此法所计算的菌数是培养基上长出来的菌落数，故又称活菌计数。一般用于某些成品检定（如杀虫菌剂等）、生物制品检验、土壤含菌量测定及食品、水源的污染程度的检验。
用途：一般多用于筛选菌株。一般用于平板培养基的回收率计数。
优点：可以计数，可以观察菌落特征。
缺点：吸收量较少，较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延。如果菌液密度大的话，长不出单菌落。
(完整版)稀释平板计数法
实验十一稀释平板计数法 实验目的 学习稀释平板菌落计数的基本原理和方法。 实验内容 用稀释平板菌落计数法对菌悬液进行计数。 实验原理 平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。但是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可能来自样品中的2—3或更多个细胞。因此平板菌落计数的结果往往偏低。为了清楚地阐述平板菌落计数的结果，现在已倾向使用菌落形成单位(cfu)而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。 平板菌落计数法虽然操作较繁，结果需要培养一段时间才能取得，而且测定结果易受多种因素的影响，但是，由于该计数方法的最大优点是可以获得活菌的信息，所以被广泛用于生物制品检验（如活菌制剂），以及食品、饮料和水〔包括水源水〕等的含菌指数或污染程度的检测。 实验器材 酿酒酵母菌悬液 马铃薯培养基 1m1吸管，平皿，试管，试管架，恒温培养箱等。 实验步骤 1．无菌器材的准备 (1) 无菌培养皿：取培养皿9套，包扎、灭菌。 (2) 无菌移液管的准备：取1m1移液管，在后部管口处用铁丝塞入棉花少许（长约1~1.5cm ），以防将菌液吸出，同时也可避免将外面的微生物吹入。棉花要塞得松紧适宜吹时能通气但不使棉花滑下为准。然后将移液管尖端放在4~5cm宽的长纸条一端呈45o角折叠纸条包住尖端，用左手捏住管身，右手将吸管压紧，在桌面上向前滚动，以螺旋式包扎起来，上端剩余纸条折叠打结后干热灭菌。 (3) 无菌水：取6支试管，分别装入4.5m1蒸馏水，加棉塞，灭菌。 2．样品稀释液的制备 (1) 编号 取无菌平皿9套，分别用记号笔标明10-4、10-5、10-6(稀释度)各3套。另取6支盛有4.5m1无菌水的试管，依次标是10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。
稀释涂布平板法计数公式
“微生物数量测量”是2017年高考大纲中的新内容，也是教学中的重要难点。稀释涂板法是计数微生物的常用方法，用于计数样品中活菌的数量。当样品的稀释度足够高时，在培养基表面上生长的菌落来自样品稀释液中的活细菌。通过计算平板上的菌落数，我们可以猜测样品中有多少种活细菌。 但是，菌落计数结果的处理常常成为学生容易出错的地方。典型示例：在从土壤中分离产生脲酶的细菌的实验中，将10g土壤样品溶液进行梯度稀释，并将0.1mL稀释倍数为105的土壤样品溶液接种在三个中板上。培养一段时间后，平板上的细菌菌落数分别为42、200和256。1g土壤样品中的细菌数为。 在PEP高中生物学选修课“生物技术实践”中，有这样一条陈述：用稀释包被板法计数菌落：为了确保结果的准确性，菌落数在30到30之间通常选择300和300进行计数。但是，如果我们理所当然地认为42、200和256个数据都在30?300范围内，那么直接对它们求平均并乘以稀释倍数就可以得出错误的结果1.66×108。这也是许多学生犯错误的原因。 实际上，教材中的相关表述仅说明了可计数菌落数的适当范围。在一定稀释度下，三个平板中的菌落数不能简单地直接平均，应注意稀释度的设定和计数结果的允许差异。
为了确保准确确定有效活菌计数，必须设置三个稀释度并进行分级，并且每个梯度应设置三个重复。为了确定土壤中细菌的数量，通常使用104、105和106倍的稀释剂进行平板培养。为了确定放线菌的数量，通常使用103、104和105倍的稀释度。为了确定真菌的数量，通常使用102、103和104倍的稀释度。 如果平板中的菌落数太少，必然会导致计数误差太大；相反，如果培养皿中的菌落太多，将导致计数困难。因此，世界上菌落计数的基本原理是对稀释的平板进行计数，其中平板上有30?300个菌落。同时，相同稀释度重复3次的平板上菌落数的标准差应小于允许的差。也就是说，在平板计数试验中，如果在相同稀释度下三个重复菌落的数量在30?300之间，但是数据相差很大，则需要将其丢弃。 如果在平板上重复3次的平均菌落数少，则容许误差也小。相反，如果平均菌落数较大，则允许误差将较大。如果选择了适当的稀释计数，则三个重复的标准差应小于规定的允许差。如果三个重复的标准差大于指定的允许差，则无法正确计算它们，必须重新测量。
稀释平板计数法
稀释平板计数操作方法 实验原理 平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。但是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可能来自样品中的2—3或更多个细胞。因此平板菌落计数的结果往往偏低。为了清楚地阐述平板菌落计数的结果，现在已倾向使用菌落形成单位(cfu)而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。 平板菌落计数法虽然操作较繁，结果需要培养一段时间才能取得，而且测定结果易受多种因素的影响，但是，由于该计数方法的最大优点是可以获得活菌的信息，所以被广泛用于生物制品检验（如活菌制剂），以及食品、饮料和水〔包括水源水〕等的含菌指数或污染程度的检测。 实验器材 LB液体、固体培养基 1m1移液器，平皿，试管，试管架，恒温培养箱等。 实验步骤 1．无菌器材的准备 (1) 无菌培养皿：取培养皿9套，包扎、灭菌。 (2) 无菌水：取6支试管，分别装入4.5m1蒸馏水，加棉塞，灭菌。 2．样品稀释液的制备 (1) 编号 取无菌平皿9套，分别用记号笔标明10-4、10-5、10-6(稀释度)各3套。另取6支盛有4.5m1无菌水的试管，依次标是10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。 (2) 稀释 用1m1移液器吸取0.5m1己充分混匀的菌悬液(待测样品)，至10-1的试管中，此即为10倍稀释。 将10-1试管置试管振荡器上振荡，使菌液充分混匀。用1m1移液器在10-1试管中来回吹吸菌悬液三次，进一步将菌体分散、混匀。吹吸菌液时不要太猛太快，吸时吸管伸入管底，吹时离开液面。混匀后吸取0.5ml至10-2试管中，此即为100倍稀释。……其余依次类推，整个过程如图所示。 3．平板接种培养 平板接种培养有浇注平板培养法和涂布平板培养法两种方法。 (1) 浇注平板培养法
无菌技术、倒平板操作、平板划线操作、稀释操作、涂布平板操作
无菌技术：主要包括1、对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒；2、将用于微生物培养的器皿、接种的用具和培养基等进行灭菌；3、为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行；4、实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。 倒平板操作： 1、将灭菌过的培养皿放在火焰旁的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拔出棉塞。 2、右手拿锥形瓶，使瓶口迅速通过火焰； 3、用左手将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基（约10～20ml）倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖，轻轻摇匀。 4、等待平板冷却凝固（大约需5～10min）后，将平板倒过来放置，使皿盖在下，皿底在上。 平板划线操作： 1、将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红； 2、在火焰旁冷却接种环，并打开盛有菌液的试管的棉塞； 3、将试管口通过火焰； 4、将已冷却的接种环伸入菌液中，沾取一环菌液； 5、将试管口通过火焰，并塞上棉塞； 6、左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养基。
7、灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三区域内划线。注意不要将最后一区域的划线与第一区相连。 8、将平板倒置，放入培养箱中培养。 稀释操作： 1、将分别盛有9ml水的6支试管灭菌，并按101～10的6次方（打不出六次方来）的顺序编号。 2、用移液管吸取1ml培养的菌液，注入101倍稀释的试管中。用手指轻压移液管上的橡皮头，吹吸三次，使菌液与水充分混匀。 3、从101倍稀释的试管中吸取1ml稀释液，注入102倍稀释的试管中，重复第2步的混匀操作。依次类推，直达完成最后一支试管的稀释。注：移液管需要经过灭菌。操作时，试管口和移液管应在离火焰的1～2cm处。 涂布平板操作： 1、将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中； 2、取少量菌液（不超过0.1ml），滴加到培养基表面； 3、将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却8～10s； 4、用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。 注意：1、将涂布器末端浸在盛有体积分数为70%的酒精的烧杯中。取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后将沾有少量酒精的涂布
土壤稀释涂布平板法
实验概要 分离、纯化及初步鉴定土壤中的拮抗植物病原菌的放线菌。 实验原理 土壤是微生物的“天然培养基”，也是最丰富的菌种资源库，我们可以从中分离出众多放线菌，尤其是可以从耕作土壤中筛选出拮抗植物病原菌的放线菌。 以耕作有武运粳和苏沪香粳的土壤为样品，应用稀释涂布平板法分离各种微生物。菌落计数后，通过菌落形态观察并挑取放线菌进行划线分离纯化，多次重复后得到单菌落。在进行放线菌形态等初步鉴定后，将纯化的菌株接入斜面传代保藏。最后，分离纯化的放线菌，初步鉴定其拮抗性。 拮抗植物病原菌的放线菌的分离纯化在农业增产、作物种植等方面都有着重要的意义。 主要试剂 1. 培养基： 高氏1号培养基、马铃薯葡萄糖培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、葡萄糖蛋白胨水培养基 2. 其他试剂： 银染液A液B液（细菌鞭毛染色） 40%KOH 5%α-萘酚（V.P.实验） 主要设备 培养皿 试管 锥型瓶 接种环 移液管 震荡器 电炉 载玻片 超净工作台 恒温培养箱 高压蒸汽灭菌锅 显微镜等 实验材料
土样： 苏沪香粳1，2组 杨稻6号93113，4组 武运粳5，6组 实验步骤 1.稀释涂布平板法(Spread Plate Method) 稀释涂布平板法是一种将菌体按比例制备成若干个稀释度，再分别经涂棒涂布培养而进行微生物分离纯化的方法。 (1) 倒平板； (2) 制备土壤稀释溶液连续不断稀释，得到不同稀释度的土壤溶液； (3) 涂布分别吸取三种稀释度菌液，均匀涂于培养基表面； (4) 培养； (5) 划线分离，直到获得纯培养。 2. 平板菌落计数法 平板菌落计数法是根据微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的现象进行的，也就是说一个菌落即代表一个单细胞。计数时，先将待测样品作一系列稀释，再取一定量的稀释菌液接种到培养皿中，使其均匀分布于平皿中的培养基内，经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可换算出样品中的含菌数。 这种计数法的优点是能测出样品中的活菌数。此法常用于某些成品检定（如杀虫菌剂），生物制品检定以及食品、水源的污染程度的检定等。但平板菌落计数法的手续较繁，而且测定值常受各种因素的影响。
稀释涂布平板法计数公式_整理《微生物的培养与应用》教学设计
《微生 JUNE 2021物的培 养与应 用》教 学设计
《微生物的培养与应用》教学设计 一、教材分析 1．教材中的地位 “微生物的实验室培养”是选修1的专题2“微生物的培养与应用”中的第1个课题，旨在为学生实践其他的生物技术实验做好铺垫，又由于本节内容位于传统的发酵技术之后，所以它是在传统的生物实践技术的基础上发展起来的，同时又为微生物的应用奠定了基础，因此，可用“承前启后”这个词语来概括本课题的地位。2．教学目标与重难点 依据课程标准及教学要求确立本课题教学目标如下： （1）知识目标：列举培养基的种类等基础知识，说明培养基配方及作用；概述无菌技术，尝试进行土壤微生物的分离、纯化和计数。 （2）能力目标：尝试培养基的制备、高压蒸汽灭菌和平板划线法等基本操作技术。熟练规范地进行无菌操作，成功地培养微生物。学会从土壤中分离纯化细菌并进行计数。 （3）情感态度价值观方面：体验制作牛肉膏蛋白胨培养基，培养纯化大肠杆菌的方法；参与实验过程，体验实验操作领悟实验原理，交流实验体会；形成勇于实践、严谨求实的科学态度和科学精神。 （4）教学重难点：无菌技术的操作、大肠杆菌的纯化、土壤微生物的分离、纯化、计数。 二、教学过程 引入：虽然微生物无处不在，但由于其一般个体微小，肉眼不可见，须在光学显微镜或电子显微镜下才可看见，所以学生对微生物的相关知识总体比较陌生。但是我们可以在实验室进行微生物培养，通过菌落来了解微生物种群的特征及其在生产生活中的应用。 1、培养基 通过填空的形式让学生回顾培养基的组成、种类、功能等
微生物教学要求学生较熟练掌握培养基的应用，而多数同学容易混淆选择培养基和鉴定培养基的组成和作用，通过小组讨论的形式，给学生足够的时间，尝试真正掌握两种培养基在作用上的差别。 1.无菌技术 了解消毒和灭菌的区别；能够说出消毒和灭菌的几种方法，并了解各种方法的适用范围。
涂布平板法
涂布平板法 实验器材 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基配制 牛肉膏 0.3g 蛋白胨 1g 氯化钠 0.5g 琼脂 2g 自来水 100mL pH 7.0～7.2 灭菌 1.05kg/cm2，22min 配制具体步骤 1．称量 按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入烧杯中。牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯。也可放在称量纸上，称量后直接放入水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速。另外，称药品时严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净、擦干，再称取另一药品，瓶盖也不要盖错。 2．溶化 在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。待药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。如果配制固体培养基，将称好的琼脂放入已溶化的药品中，再加热溶化，在琼脂溶化的过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底使烧杯破裂。最后补足所失的水分。 3．调pH 在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH值，如果pH偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH 值，直至pH达7．6。反之，则用1mol/L HCl进行调节。注意pH值不要调过头，以避免回调，否则，将会影响培养基内各离子的浓度。
对于有些要求pH值较精确的微生物，其pH的调节可用酸度计进行（使用方法，可参考有关说明书）。 4．过滤 趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利结果的观察。一般无特殊要求的情况下，这一步可以省去（本实验无需过滤）。很多都是不需要过滤的。 5．分装 按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内。分装装置见图Ⅴ-1。 分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。 (1)液体分装分装高度以试管高度的1/4左右为宜。 (2)固体分装分装试管，其装量不超过管高的1/5，灭菌后制成斜面，如图Ⅴ-2。分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。 (3)半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。 6．加塞 培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能（棉塞制作方法附本实验后面）。 7．包扎 加塞后，将全部试管用麻绳捆扎好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、日期。三角烧瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好，使用时容易解开，同样用记号笔注明培养基名称、组别、日期。 8．灭菌 将上述培养基以1．05kg/cm2（15磅/英寸2），121．3℃， 20分钟高压蒸汽灭菌。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。 9．搁置斜面 将灭菌的试管培养基冷至50℃左右，将试管棉塞端搁在玻棒上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。
稀释涂布平板法计数活菌的方法简介
+ 70 +生物学教学"01B年(第43卷)第"期稀释涂布平板法计数活菌的方法简介 龚军辉王晶（河北省保定市第一中学071000) 摘要本文对稀释涂布平板法计数微生物活菌数的易错问题进行剖析，介绍菌落计数的基本原则以及相关的计算公式，并给出 3组可供参考的示例。 关键词稀释涂布平板法活菌计数允许差 1问题的提出 “微生物数量的测定”是2017年高考考纲中新增 加的内容，同时也是教学的重难点。稀释涂布平板法 是对微生物计数的常用方法，用来统计样品中活菌的 数目。当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的 一个菌落来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计 平板上的菌落数，就能推测出样品中大约有多少活菌。但对菌落计数的结果处理往往成为学生的易错点。 经典例题：在从土壤中分离产脲酶细菌的实验中，将10 0土壤样液梯度稀释，在3个培养基平板上均 接种稀释倍数为10%的土壤样液0.1/L，培养一段时 间后，平板上长出的细菌菌落数分别为42、200、256。则10土壤样品中的细菌数量为_______个。 很多学生得出的答案为：1.66 X108。同时，学生 对于42这个数据如何处理存在疑问：是否需要舍弃？如果需要舍弃，标准是什么？ 2菌落计数的基本原则 2.1教材中的相关表述在人教版高中生物学选修1《生物技术实践》中，对于稀释涂布平板法计数菌落 有如此的表述：为了保证结果准确，一般选择菌落数 在30 ~ 300的平板进行计数。但是，若想当然地认为 42、200、256三个数据均处于30 ~ 300范围之内，然 后直接求平均值，再乘以稀释倍数，就会得出1.661 108的错误结果。这也是很多学生产生错误的原因。 事实上，教材中的相关表述只是在说明可计数的 菌落数量的适宜范围。某一稀释度下的3个平板中菌 落数并不能简单地直接求平均值，还应该关注稀释度 的设置以及计数结果的允许差。 2.2稀释度的设置及计数原则为了确保有效活菌数的准确测定，在采用平板计数检测中，必须设3个稀 释度且成梯度，每个梯度设3个重复[1]。测定土壤中 细菌的数量，一般选用104、105和106倍的稀释液进行 平板培养；测定放线菌的数量，一般选用103、104和 10%倍稀释"测定真菌的数量，一般选用102、103和104倍稀释。 如果平板中菌落的数量太少，必然会导致计数误 差太大;反之，如果平板中菌落数量过多，会造成计数上的困难。因此，国际上通用的菌落计数的基本原则，是以平板上出现30 ~ 300个菌落数的稀释平板为计数 标准。同时要求，同一个稀释度重复3次的平板上菌 落数标准差值应小于允许差值[2]。也就是说，在平板 计数检测中，如果同一稀释度下的3次重复菌落数虽 然均处于30 ~ 300个范围之内，但数据相差较大，就需 要舍弃。 2.3同一稀释度下3个重复的允许差值标准差的计算公式如下： 式中：SG—标准差，x—同一稀释度任一平板 菌落数，x—同一稀释度平板菌落平均值，* —同一 稀释度平板重复次数。 平板菌落数的允许差值如表1[3]。 表1平板菌落数允许差值 平板菌落平均数(个/皿）30 -5051 -100101 -300允许差值± 4102050 由表1可知，如果平板上3次重复的菌落平均数 较小，其允许的误差就小"反之，如果菌落平均数较大，则其允许的误差就大一些。若选一个适宜稀释度计 数，则3个重复的标准差值应小于规定的允许差值。若3个重复的标准差值大于规定的允许差值，则无法 正确计数，必须重新测定。 2.4对例题的进一步分析根据标准差公式，对上述 例题计算如下： 10%稀释度下3个平板的平均菌落数x= 42 +200 +256 ------3------= 166; 当x=42 时，x-x=-124，（x-x)2= 15 376; 当x=200 时，x-x=34，（x-x)2= 1156; 当x=256 时，x-X=90，（x-X)2= 8100; /15 376 + 1156 + 8100 … SD=槡------3T1--------=Z111。 参照表1中菌落数的允许差值可以看出，平板菌 落平均数166处于101 ~300之内， 标准所允许差值为