铜绿假单胞菌操作规程
铜绿假单胞菌检验操作规程
保健用品微生物检验方法-—铜绿假单胞菌测定
保健用品微生物检验方法 第3部分：铜绿假单胞菌测定 警示——使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验。本标准并未指出所有可能的安全问题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。 1 范围 本标准规定了保健用品中微生物中铜绿假单胞菌的测定方法。 本标准适用于生产和经营的保健用品中的铜绿假单胞菌测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 铜绿假单胞菌 Pseudomonas aeruginosa 属于假单胞菌属，为革兰氏阴性杆菌，氧化酶阳性，能产生绿脓菌素。此外还能液化明胶，还原硝酸盐为亚硝酸盐，在42 ℃±1 ℃条件下能生长。 4 试剂和材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯 。实验用水符合GB/T 6682中二级水的要求。 4.1 灭菌生理盐水:详见附录A.1。 4.2 灭菌液体石蜡:详见附录A.2。 4.3 灭菌吐温-80:详见附录A.3。 4.4 SCDLP:详见附录A.4。 4.5 十六烷基三甲基溴化铵:详见附录A.5。 4.6 乙酰胺:详见附录A.6。 4.7 革兰氏染液:详见附录A.7。 4.8 绿脓菌素测定培养基:详见附录A.8。 4.9 硝酸盐蛋白胨水:详见附录A.9。 4.10 明胶液化培养基:详见附录A.10。
5 仪器和设备 5.1 天平：感量0.1 g。 5.2 灭菌刻度吸管:10 mL、5 mL、1 mL。 5.3 高压灭菌器。 5.4 量筒：100 mL、200 mL、2000 mL。 5.5 恒温水浴箱或隔水式恒温箱:44.5 ℃±0.5 ℃。 5.6 无菌锥形瓶：100 mL、200 mL、250 mL、2000 mL。 5.7 研钵。 5.8 振荡器。 5.9 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃、42 ℃±1 ℃、28 ℃±2 ℃。 5.10 接种针、接种环。 5.11 显微镜。 5.12 小倒管。 5.13 玻璃棒。 5.14 冰箱：2 ℃～5 ℃。 6 样品 6.1 样品的采集 所采集的样品，应具有代表性，一般视每批保健用品数量大小，随机抽取相应数量的包装单位。检验时，应从不少于2 个包装单位的取样中共取10 g(5.1)或10 mL(5.2)。包装量小于20 g的样品，采样时可适量增加样品包装数量。 6.2 注意事项 6.2.1 供检验样品，应严格保持原有的包装状态。容器不应有破裂，在检验前不得打开，防止样品被污染。 6.2.2 接到样品后，应立即登记，编写检验序号，并按检验要求尽快检验。如不能及时检验，样品应放在室温阴凉干燥处，不要冷藏或冷冻。 6.2.3 若只有一个样品而同时需做多种分析，如微生物、毒理、化学等，则宜先取出部分样品做微生物检验，再将剩余样品做其它分析。 6.2.4 在检验过程中，从打开包装到全部检验操作结束，均须防止微生物的再污染和扩散，所用器皿及材料均应事先灭菌(5.3)，全部操作应在符合生物安全要求的实验室中进行。 6.2.5 如检出铜绿假单胞菌，自报告发出之日起该菌种应保存一个月。 6.3 样品的制备 6.3.1 液体样品 水溶性液体样品，用灭菌吸管吸取10 mL加到90 mL（5.4）灭菌生理盐水（4.1）中，混匀后，制成1:10匀液。 油性液体样品，取样品10 g，先加5 mL 灭菌液体石蜡（4.2）混匀，再加10 mL灭菌的吐温-80，在 40 ℃～44 ℃水浴中（5.5）振荡混合10 min，加入灭菌的生理盐水75 mL（在40 ℃～44 ℃水浴中预温），在40 ℃～44 ℃水浴中乳化，制成1:10的悬液。
铜绿假单胞菌检查
铜绿假单胞菌检查 1 简述 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），习称绿脓杆菌，为假单胞菌属菌种，广泛分布在土壤，水及空气中，人和动物的皮肤、肠道、呼吸道均有存在，故可通过环境和生产的各个环节污染药品，本菌是常见的化脓性感染菌、在烧伤、烫伤、眼科及其他外科疾患中长引起继发感染，由于本菌对许多抗菌药物具有天然的耐药性，增加了治疗的难度。国内外药典均将铜绿假单胞菌列为检查项目之一。 铜绿假单胞菌按增菌，分离、纯培养、革兰染色、镜检及生化试验等步骤进行检验。 2 仪器、设备和用具（见大肠埃希菌2）。 3 试液、指示液 3.1 0.9%无菌氯化钠溶液或磷酸盐缓冲液[附录3.1，3.3]。 3.2 pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液[附录3.2]。 3.3 1%盐酸二甲基对苯二胺试液[附录2.1]。 3.4 盐酸试液[附录2.12]。 3.5 氯仿[附录1.57]。 4 培养基 4.1 营养肉汤培养基[附录 5.1]。 4.2 胆盐乳糖（BL）培养基[附录 5.6]。 4.3 营养琼脂培养基[附录 5.2]。 4.4 溴代十六烷基三甲胺[附录 5.14]。
4.5 绿脓菌素测定用培养基（POP琼脂）[附录 5.26]。 4.6 明胶培养基[附录3.27]。 4.7 硝酸盐胨水培养基[附录 5.28]。 5 对照用菌液 铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104]营养琼脂斜面培养物少许，接种至5ml营养肉汤培养基内，于36±1℃培养18～24h后，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至1:106，使对照菌加入量含10～100cfu（一般用量为0.1ml），菌数测定在做阳性对照实验用营养琼脂浇碟或平板涂布经培养后计数确定。 6 操作方法 6.1 供试品的取样量（见细菌、霉菌和酵母菌计数5.3）。 6.2 供试液的制备（见细菌、霉菌和酵母菌计数7）；（大肠埃希菌6.2）。 6.3 增菌培养 取胆盐乳糖培养基2份，每份100ml，1份加入1:10供试液10ml（相当于供试品1g或1ml）。另1份加入与供试液等量的稀释剂作阴性对照。于36℃±1℃培养18～24h（必要时可延至48h）。阴性对照菌应无军生长。 6.4 分离培养 轻轻摇动上述增菌培养液，以接种环取1～2环培养液（如有菌膜应挑取之），划线接种于溴代十六烷基三甲胺琼脂平板，于36℃±1℃培养18～24h。铜绿假单胞菌在该培养基平板上的典型菌落为扁平、
简述桶装水中铜绿假单胞菌的几种检测方法
龙源期刊网 https://www.360docs.net/doc/9059612.html, 简述桶装水中铜绿假单胞菌的几种检测方法作者：马慧娟徐慧高宏 来源：《食品安全导刊·中旬刊》2019年第03期 引言 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），也称为绿脓杆菌，属于假单胞菌属。广泛分布于自然界（土壤、空气、水源等）及正常人皮肤、肠道和呼吸道，大小为（1.5～3.0）μm×（0.5～0.8）μm，属于非发酵革兰氏阴性杆菌。该菌在普通培养基上生长良好，专性需氧，菌落形态不一，多数直径在 2～3 mm，边缘不整齐，扁平湿润。在血琼脂平板上形成透明溶血环。铜绿假单胞菌是一种重要的水源性致病菌，广泛存在于各类型水中，对消毒剂、干燥、紫外线等理化因素具有很强的抵抗力，可引起急性肠道炎、脑膜炎、败血症和皮肤炎症等疾病。 目前检测铜绿假单胞菌的标准中采用的主要是传统生化方法，包括分离培养、生化鉴定等，不能实现大批量水样的快速检测。近几年，随着科技的发展，检测铜绿假单胞菌的方法多种多样，本文对近年铜绿假单胞菌检测技术进行综述，为铜绿假单胞菌的快速、准确检测研究技术提供参考。 铜绿假单胞菌检测技术 国标滤膜法 检测桶装水中铜绿假单胞菌的方法是GB 8538-2016《食品安全国家标准饮用天然矿泉水检验方法》。铜绿假单胞菌产色素分为三种：产绿脓菌素，产青脓素，产红脓素;铜绿假单胞菌在4℃不生长而在42℃可以生长;具有氧化酶，可以使细胞色素C氧化，再由氧化型细胞色素C使对苯二胺氧化，生成有色的醌类化合物：可以产生一种脱酰胺酶，可使乙酰胺经脱酰胺作用释放氨，滴加纳氏试剂（碘化汞钾），氨在碱性条件下与碘化汞钾作用，生成红色络合物;根据这些生化特性，通过滤膜过滤将铜绿假单胞菌富集到CN琼脂上，再用生化试剂管进行生化鉴定。也可以用VITEK 2 Compact 全自动细菌鉴定系统用于微生物鉴定，准确率高，可用于微生物实验室的日常检测工作。 实时荧光定量PCR检测 外毒素 A 基因在铜绿假单胞菌中高度保守，根据 GenBank 中铜绿假单胞菌外毒素A基因片段序列，设计特异性引物及TaqMan探针，并利用实时荧光 PCR技术，对目标靶序列进行 特异性扩增，建立了一套检测食品中铜绿假单胞菌的方法，特异性试验和灵敏性试验良好，该检测方法具有特异、快速的特点，能够满足检测要求，为食品中铜绿假单胞菌的快速检测奠定了基础。 LAMP检测
桶装水中铜绿假单胞菌检测方法的比较
1403 桶装水中铜绿假单胞菌检测方法的比较 张淑红，吴清平，徐晓可，张菊梅，潘宝怡、彭飞艇 （广东省菌种保藏与应用重点实验室,广东省微生物应用新技术公共实验室,广东省华南应用微生物重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地,广东省微生物研究所，广东广州 510070） 摘要：分别采用传统国标GB/T 8538-2008方法、基于OprL 基因的PCR 方法和环介导等温扩增(LAMP)方法检测桶装水中的铜绿假单胞菌，比较三种方法的检测效果。结果显示，采集的46份市场水样中，用传统GB8538-2008方法检出了3份阳性样品，检出率为6.5%，检测时间至少2天；而PCR 和LAMP 方法都检出4份阳性样品，检出率为8.7%，并且可在24 h 内报告结果。PCR 和LAMP 方法与传统方法相比具有快速灵敏等优点，可用于大批量水样的快速检测和结果初筛。 关键词：铜绿假单胞菌；传统方法；PCR ；LAMP 文章篇号：1673-9078(2011)11-1403-1405 Comparison of Detection of Pseudomonas aeruginosa in Bottled Water ZHANG Shu-hong, WU Qing-ping, XU Xiao-ke, ZHANG Ju-mei, PAN Bao-yi, PENG Fei-ting (Guangdong Provincial Key Laboratory of Microbial Culture Collection and Application, Guangdong Open Laboratory of Applied Microbiology, State Key Laboratory of Applied Microbiology (Ministry-Guangdong Province Jointly Breeding Base ),South China Guangdong Institute of Microbiology, Guangzhou 510070, China) Abstract: Three methods including traditional method GB/T 8538-2008, PCR assay based on OprL gene and LAMP assay were used to detect the Pseudomonas aeruginosa in bottled water and the results were compared. It was found that 3 bottled water samples (6.5%) were positive detected by GB8538-2008 method, while 4 bottled water samples were detected positive by both PCR and LAMP methods with the positive rate of 8.7%. As for the test of time, the traditional method need at least 2 days to finish, compared to less than 24h using PCR and LAMP methods. Therefore, PCR and LAMP assays were more rapid and sensitive than traditional method, which may be used for rapid detection of large quantities of water samples. Key words ：Pseudomonas aeruginosa ; Traditional Method; PCR; LAMP 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa ）是一种重要的水源性致病菌，广泛存在于各类型水中，对消毒剂、干燥、紫外线等理化因素具有很强的抵抗力，可引起急性肠道炎、脑膜炎、败血症和皮肤炎症等疾病[1~3]。 近年来，随着全球范围内桶装饮用水消费量的不断上升，国内外有关铜绿假单胞菌污染桶装水的报道逐渐增多，引起了诸多学者和消费者的普遍关注[4~10] 。目前桶装饮用水铜绿假单胞菌检测技术方面，除传统的生化培养外，PCR 和环介导等温扩增技术（LAMP ）等分子方法逐步建立起来，应用于水样快速检测中。本文通过对市场销售的桶装水进行抽样检测，比较了传统培养法与PCR 和LAMP 方法的特点，为桶装饮用水的快速检测提供参考。 收稿日期：2011-08-01 基金项目：广东省科技计划项目（2009A080209002、2010B031000020） 作者简介：张淑红（1978-），女，硕士，助理研究员，研究方向：食品微生物安全检测技术 通讯作者：吴清平研究员 1 材料与方法 1.1 样品来源和标准菌株 所检测的46份水样为广州市场销售的各类品牌桶装饮用水（包括34份矿泉水、2份纯净水和10份山泉水），样品均在保质期内。 1.2 主要仪器 SIGMA1-15微量离心机、SIGMA 3K30台式高速冷冻离心机、PE2400 PCR 仪、电泳仪、UV Ⅰ凝胶成像系统、TOMYES-215日本全自动灭菌、移液器、恒温培养箱、FMC-1000恒温水浴锅、超净工作台等。 1.3 主要试剂 DNA Marker2000购自TaKaRa 公司；PCR Mix 购自Fermentas 公司；铜绿假单胞菌LAMP 试剂盒购自华峰生物科技有限公司；琼脂糖购自美国Promega 公司。LB 肉汤、CN 琼脂及配套试剂、乙酰胺肉汤、金氏B(King ′s B)培养基、氧化酶试纸等购自广东环凯微生物科技有限公司。 w w w .m o d e r n f o o d .c o m .c n
桶装水中铜绿假单胞菌检测和解决办法
桶装水中铜绿假单胞菌检测和解决办法 摘要：铜绿假单胞菌经过水源水消毒，管道消毒和臭氧消毒后，其活力会大大降低，处于非可培养状态，导致传统方法培养不出和检测结果的假阴性。本文通过对检测方法的分析，提出一种可以彻底杀灭铜绿假单胞菌的方法。 关键字：桶装水；铜绿假单胞菌；检测；解决 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种重要的水源性致病菌，广泛存在于各类型水中，对消毒剂、干燥、紫外线等理化因素具有很强的抵抗力，可引起急性肠道炎、脑膜炎、败血症和皮肤炎症等疾病。 近年来，随着全球范围内桶装饮用水消费量的不断上升，国内外有关铜绿假单胞菌污染桶装水的报道逐渐增多，引起了诸多学者和消费者的普遍关注。目前桶装饮用水铜绿假单胞菌检测技术方面，除传统的生化培养外，PCR 和环介导等温扩增技术（LAMP）等分子方法逐步建立起来，应用于水样快速检测中。本文在分析检测方式的基础上提出彻底解决的办法。 一．铜绿假单胞菌的传统检测方法 参考《饮用天然矿泉水检验方法》 GB/T8538-2008/54 铜绿假单胞菌-滤膜法和ISO16266：2006（E）水质-铜绿假单胞菌的检测和计数－滤膜法进行检验。具体步骤：将250 mL水样用孔径为0.45 μm的滤膜过滤，并将滤膜移至 CN 琼脂选择性培养基上，36 ±1 ℃℃恒温培养 48 h。铜绿假单胞菌在 CN 琼脂出现的菌落形态有 3 种：有脓青素产生的蓝/绿色、无荧光的菌落，直接判为检出；产生有荧光素的黄色菌落，进一步做产氨(乙酰胺肉汤)试验确认，产氨试验阳性的判为检出；产生红脓素的红褐色、无荧光的菌落，要继续做氧化酶试验、产氨试验、荧光(金氏 B 斜面)试验，若氧化酶阳性、产氨试验阳性结果判为铜绿假单胞菌检出。 二．铜绿假单胞菌 PCR 检测方法 将 250 mL 水样用孔径为 0.45 μm 的滤膜过滤，将滤膜转移至 100 mL LB 肉汤（内
铜绿假单胞检验作业指导书 (2)
品有限公司生效日期：2014.01.01 页码：第1页，共4页 1 目的 规定矿泉水铜绿假单胞菌的检验方法，保证按标准化操作。 2 适用范围 适用于饮用天然矿泉水中铜绿假单胞菌检测。 3 术语 铜绿假单胞菌：又称绿脓杆菌，是假单胞菌属中最常见的菌种。属于革兰氏阴性细长杆菌，无芽孢，无荚膜，专性需氧菌，4℃不生长（所以一般情况下不能冷藏保存，需在室温下于阴凉处保存），可产生多种色素，主要为绿脓素。 4 职责 质检员负责按作业指导书进行检验。 5 流程图 无 6 作业内容 6.1 检验方法原理 微孔滤膜是一种微孔径的过滤膜（通常孔径为0.22μm、0.45μm，滤膜直径为47mm），滤膜能滤过大量水样，并将水中含有的细菌截留在滤膜上，然后将滤膜贴在选择性培养基上，经培养后，直接计数滤膜上的典型微生物菌落数，算出一定体积水样中含有的微生物菌落总数。 6.2 实验器材、培养基及试剂 6.2.1 实验器材 紫外灯（波长为360±20nm）、不锈钢滤器装置、滤膜（直径47mm，微孔径0.22μm）、抽滤设备、无齿镊子、显微镜（10×～100×）、量筒、灭菌锥形瓶、培养皿、恒温培养箱（36±1℃）、恒温水浴锅（46±1℃）、酒精灯、冰箱（0～8℃）、超净工作台。 6.2.2培养基及试剂 假单胞菌琼脂基础培养基/CN琼脂，金氏B培养基，乙酰胺肉汤，萘啶酮酸（CN琼脂）配套试剂，甘油，钠氏试剂（乙酰胺肉汤配套试剂），营养琼脂培养基（NA），氧化酶试纸。6.3操作步骤 6.3.1推测性检验 6.3.1.1水样过滤：在100级的洁净工作台进行过滤操作。 6.3.1.2用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分，将粗糙面朝上，贴放在已灭菌的滤床上，固定好 滤器，将250mL水样或稀释液通过孔径0.22μm的滤膜过滤。