蛋白质的理化性质与分离纯化
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蛋白质的理化性质与分离纯化
生物 化学
1 理化性质
(1) (2) (3) (4) (5) (6)
第四节 蛋白质的理化性质 及其分离纯化
酸碱性质
分子量
胶体性质 紫外吸收 变性作用 化学反应
分离纯化 分析鉴定
RT Mr = lim π c→0 c
蛋白质的分子量
化学组成法 SDS-PAGE法 SDS-PAGE法 凝胶过滤法 渗透压法 沉降系数法和沉降平衡法
生物 化学
1 理化性质
(1) (2) (3) (4) (5) (6)
第四节 蛋白质的理化性质 及其分离纯化
蛋白质紫外吸收
大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙 氨酸、酪氨酸和色氨酸。 氨酸、酪氨酸和色氨酸。 这三种氨基酸的在280nm 这三种氨基酸的在280nm 附近有最大 吸收，使得大多数蛋白质在280nm 吸收，使得大多数蛋白质在280nm 附近 显示强的吸收。 显示强的吸收。 利用这个性质， 利用这个性质，可以对蛋白质进行定 性鉴定。 性鉴定。
酸碱性质 分子量 胶体性质
紫外吸收
变性作用 化学反应
分离纯化 分析鉴定
生物 化学
1 理化性质
(1) (2) (3) (4) (5) (6)
第四节 蛋白质的理化性质 及其分离纯化
蛋白质变性、 蛋白质变性、沉淀与凝固 蛋白质的变性作用(denaturation) 变性后的蛋白质由于疏水基团 某些物理或化学因素，： 某些物理或化学因素，破坏蛋白质的结构 变性蛋白质的性质改变： 变性蛋白质的性质改变 状态， 状态，引起蛋白质理化性质改变并导致其生 的暴露而易于沉淀， ，溶解度下降 物理性质：旋光性改变， ①的暴露而易于沉淀，但沉淀的蛋白 ， 物理性质：旋光性改变 溶解度下降， 理活性丧失，称为蛋白质的变性。 理活性丧失，称为蛋白质的变性。 沉降率升高，粘度升高，光吸收度增加等； 沉降率升高，粘度升高，光吸收度增加等； 质不一定都是变性后的蛋白质。 质不一定都是变性后的蛋白质。 蛋白质变性的实质是次级键的断裂和重排， 蛋白质变性的实质是次级键的断裂和重排， 化学性质：官能团反应性增加， ② 化学性质：官能团反应性增加，易被 有些变性蛋白质在一定条件下还 不涉及肽键的断裂。 不涉及肽键的断裂。 蛋白酶水解。 蛋白酶水解。 引起蛋白质变性的因素 。 可以复性，是可逆变性。 生物学性质：原有生物学活性丧失， ③可以复性，是可逆变性 生物学性质：原有生物学活性丧失， 物理因素： ① 物理因素：高温、高压、紫外线、电离 抗原性改变。 抗原性改变。 高温、高压、紫外线、 加热使蛋白质变性并凝聚成块状 辐射、超声波、机械剪切等； 辐射、超声波、机械剪切等； 称为凝固。因此， 强碱、有机溶剂 化学因素：强酸、 ② 称为凝固。因此，凡凝固的蛋白质 、重 化学因素：强酸、强碱、有机溶剂、 金属盐等。 金属盐等。 一定发生变性。 一定发生变性。
蛋白质的分离纯化和表征
2.盐溶和盐析
蛋白质的分离纯化和表征
第21页
2. 盐析 在蛋白质水溶液中，加入大量高浓度强
电解质盐如硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等， 可破坏蛋质分子表面水化层，中和它们电 荷，因而使蛋白质沉淀析出，这种现象称 为盐析。
而低浓度盐溶液加入蛋白质溶液中，会 造成蛋白质溶解度增加，该现象称为盐溶。
盐析机理：破坏蛋白质水化膜，中和表面 净电荷。
灵敏度高，能检测1微克蛋白，重复性好。
蛋白质的分离纯化和表征
第48页
蛋白质纯度判定
各种层析单峰，电泳单带，双向电泳单点， 末端氨基酸测定一个，溶解度曲线单转折。
蛋白质的分离纯化和表征
第49页
盐溶盐溶—盐析
• 等电点沉淀蛋白质溶液中加入NaCl后沉淀 溶解—盐溶
• 原因？
分子在等电点时，相互吸引，聚合沉淀，加入少
许盐离子后破坏了这种吸引力，使分子分散，溶
于水中 蛋白质的分离纯化和表征
第9页
盐析 盐析（（NH4）2SO4）
• 向蛋白质溶液中加入大量硫酸铵后蛋白质 会沉淀析出
• 原因？
蛋白质脱去水化层而聚集沉淀
蛋白质的分离纯化和表征
第46页
蛋白质含量测定Ⅱ
3．Folin-酚法（Lowry法） 蛋白质中酪氨酸或半胱氨酸，能与Folin-酚试
剂起氧化还原反应，生成蓝色化合物，500nm比 色测定。
Folin-酚试剂配制比较复杂。 4．BCA法
蛋白质还原Cu2 +成Cu+，与4,4’-二羧基-2,2’-二 喹啉（BCA）形成配合物，显紫色，比色测定。
到达最高值。
蛋白质的分离纯化和表征
第13页
三、蛋白质分离纯化普通标准
总目标：增加制品纯度或比活 1.前处理：因动/植物/细菌而异 2.粗分级分离：采取盐析/等电点沉淀/有 机溶剂分级分离等方法 3.细分级分离：采取凝胶过滤、离子交换 层析、吸附层析以及亲和层析等 4.结晶
蛋白质的分离纯化和表征
第21页
2. 盐析 在蛋白质水溶液中，加入大量高浓度强
电解质盐如硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等， 可破坏蛋质分子表面水化层，中和它们电 荷，因而使蛋白质沉淀析出，这种现象称 为盐析。
而低浓度盐溶液加入蛋白质溶液中，会 造成蛋白质溶解度增加，该现象称为盐溶。
盐析机理：破坏蛋白质水化膜，中和表面 净电荷。
灵敏度高，能检测1微克蛋白，重复性好。
蛋白质的分离纯化和表征
第48页
蛋白质纯度判定
各种层析单峰，电泳单带，双向电泳单点， 末端氨基酸测定一个，溶解度曲线单转折。
蛋白质的分离纯化和表征
第49页
盐溶盐溶—盐析
• 等电点沉淀蛋白质溶液中加入NaCl后沉淀 溶解—盐溶
• 原因？
分子在等电点时，相互吸引，聚合沉淀，加入少
许盐离子后破坏了这种吸引力，使分子分散，溶
于水中 蛋白质的分离纯化和表征
第9页
盐析 盐析（（NH4）2SO4）
• 向蛋白质溶液中加入大量硫酸铵后蛋白质 会沉淀析出
• 原因？
蛋白质脱去水化层而聚集沉淀
蛋白质的分离纯化和表征
第46页
蛋白质含量测定Ⅱ
3．Folin-酚法（Lowry法） 蛋白质中酪氨酸或半胱氨酸，能与Folin-酚试
剂起氧化还原反应，生成蓝色化合物，500nm比 色测定。
Folin-酚试剂配制比较复杂。 4．BCA法
蛋白质还原Cu2 +成Cu+，与4,4’-二羧基-2,2’-二 喹啉（BCA）形成配合物，显紫色，比色测定。
到达最高值。
蛋白质的分离纯化和表征
第13页
三、蛋白质分离纯化普通标准
总目标：增加制品纯度或比活 1.前处理：因动/植物/细菌而异 2.粗分级分离：采取盐析/等电点沉淀/有 机溶剂分级分离等方法 3.细分级分离：采取凝胶过滤、离子交换 层析、吸附层析以及亲和层析等 4.结晶
蛋白质的分离纯化(1)
蛋白质等电点： 在某pH时蛋白质所带正电荷与负电荷恰好相等，即蛋
白质的净电荷为零时的pH称等电点（pI）。
蛋白质等离子点： 没有其他盐类干扰时, 蛋白质质子供体基团解离出来
的质子数与质子受体基团结合的质子数相等时的pH称为等 离子点。
二、蛋白质的紫外吸收性质
蛋白质溶液能吸收一定波长的紫外光，主要是由带 芳香环的氨基酸决定的。其在280nm处对紫外吸收能力 的强弱顺序为：
电
电
泳
泳
方
方
向
向
等电聚焦电泳
SDS-PAGE
双向电泳后的凝胶经染色蛋白呈现二维分布图，水平方向反映 出蛋白在pI上的差异，而垂直方向反映出它们在分子量上的差别。
所以双向电泳可以将分子量相同而等电点不同的蛋白质以及等 电点相同而分子量不同的蛋白质分开。
5.层析聚焦(P310)
是根据蛋白质的等电点差异分离蛋白质混合物的柱层析方法。
(polyacrylaminde gel electrophoresis) 电泳
PAGE
样品浓缩成很薄的起始区带（0.1mm）
它以聚丙烯酰胺 凝胶为支持物，一般 制成凝胶柱或凝胶板 （不连续体系）。
浓缩胶 分离胶
凝胶的浓度（孔径大小）、 缓冲液组分和离子强度、 pH以及电场强度都是不同的
分离成单区带
依次洗脱收集后， 通过紫外吸收法测定吸 收峰。
这样大小不同的蛋白 质就被分离开来了。
（二）根据蛋白质溶解度不同的纯化方法
（蛋白质的胶体和沉淀性质）
主要方法： 1：等电点沉淀和PH值控制 2：蛋白质的盐溶和盐析 3：有机溶剂分级分离法 4：改变温度
1.等电点沉淀和PH值控制
即在不改变其它条件的情况下，PH处于等电点时的蛋白质 溶解度达到最低点。而位于等电点两侧的PH条件下蛋白质的溶
白质的净电荷为零时的pH称等电点（pI）。
蛋白质等离子点： 没有其他盐类干扰时, 蛋白质质子供体基团解离出来
的质子数与质子受体基团结合的质子数相等时的pH称为等 离子点。
二、蛋白质的紫外吸收性质
蛋白质溶液能吸收一定波长的紫外光，主要是由带 芳香环的氨基酸决定的。其在280nm处对紫外吸收能力 的强弱顺序为：
电
电
泳
泳
方
方
向
向
等电聚焦电泳
SDS-PAGE
双向电泳后的凝胶经染色蛋白呈现二维分布图，水平方向反映 出蛋白在pI上的差异，而垂直方向反映出它们在分子量上的差别。
所以双向电泳可以将分子量相同而等电点不同的蛋白质以及等 电点相同而分子量不同的蛋白质分开。
5.层析聚焦(P310)
是根据蛋白质的等电点差异分离蛋白质混合物的柱层析方法。
(polyacrylaminde gel electrophoresis) 电泳
PAGE
样品浓缩成很薄的起始区带（0.1mm）
它以聚丙烯酰胺 凝胶为支持物，一般 制成凝胶柱或凝胶板 （不连续体系）。
浓缩胶 分离胶
凝胶的浓度（孔径大小）、 缓冲液组分和离子强度、 pH以及电场强度都是不同的
分离成单区带
依次洗脱收集后， 通过紫外吸收法测定吸 收峰。
这样大小不同的蛋白 质就被分离开来了。
（二）根据蛋白质溶解度不同的纯化方法
（蛋白质的胶体和沉淀性质）
主要方法： 1：等电点沉淀和PH值控制 2：蛋白质的盐溶和盐析 3：有机溶剂分级分离法 4：改变温度
1.等电点沉淀和PH值控制
即在不改变其它条件的情况下，PH处于等电点时的蛋白质 溶解度达到最低点。而位于等电点两侧的PH条件下蛋白质的溶
简述一般根据蛋白质的哪些性质分离、纯化蛋白质
离子交换层析 带正电的离子交换树 脂结合带负电的蛋白。
（四）利用选择性吸附的纯化 方法
疏水作用层析是根据蛋白质表面的疏 水性差别。
在疏水作用层析中，不是暴露的疏 水基团促进蛋白质与蛋白质之间的相互 作用，而是连接支持介质(如琼脂糖)上 的疏水基团与蛋白质表面上暴露的疏水 基团结合。
由于疏水作用层析要求盐析化合物 如硫酸铵的存在以促进蛋白质分子表面 的疏水区暴露。为使吸附达到最大，可
电泳法原理
2、离子交换层析法
蛋白质对离子交换剂的结合力取 决于彼此间相反电荷基团的静电吸引， 而这和溶液的pH有关，离子交换剂有阳 离子交换剂 （羧甲基纤维素 ）和阴离子 交换剂（二乙氨基乙基纤维素 ），当被 分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱 时，带有与离子交换剂相反电荷的蛋白 质被吸附在离子交换剂上，随后用改变 pH或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱 下来。
（2）pH值带净电荷越多，它的溶解度就越大。改 变pH值可改变蛋白质的带电性质，因而就改 变了蛋白质的溶解度。远离等电点处溶解度 大，在等电点处溶解度小，因此用中性盐沉淀 蛋白质时，pH值常选在该蛋白质的等电点附 近。用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱 而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致 蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋 白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用 偏碱性的提取液。
超滤技术的应用 有很好的前景，应引 起足够的重视。
2、密度梯度（区带）离心
蛋白质沉降不仅决定于它的大小，而且也 取决于它的密度。蛋白质颗粒在具有密度梯度 的介质中离心时，质量和密度大的颗粒比质量 和密度小的颗粒沉降的快，并且每种蛋白质颗 粒沉降到与自身密度相等的介质密度梯度时， 即停止不前，前后各种蛋白质在离心管中被分 离成各自独立的区带。
蛋白质分离纯化原理
蛋白质分离纯化原理
蛋白质分离纯化的原理主要基于其在溶液中的物理化学性质的差异。
以下是几种常见的蛋白质分离纯化方法及其原理：
1. 溶液pH调节：许多蛋白质在不同pH值下的带电性质不同，可以利用溶液pH的调节来使具有不同电荷的蛋白质发生电离，从而实现分离纯化。
例如，利用离子交换层析法，可以根据蛋白质的带电性质来选择性地吸附和洗脱目标蛋白质。
2. 亲和层析法：某些蛋白质具有与特定小分子结合的能力，可以利用这种亲和性质来实现蛋白质的分离纯化。
常见的亲和层析包括亲和吸附、亲和洗脱和竞争洗脱等步骤。
例如，利用亲和层析柱上特异性结合靶蛋白质的配体，可以选择性地富集和纯化目标蛋白质。
3. 分子量筛选：利用蛋白质的分子量差异进行分离纯化。
常见的方法包括凝胶过滤层析（Gel filtration chromatography）和凝胶电泳（Gel electrophoresis）。
在凝胶过滤层析中，根据蛋白
质的分子量大小，通过孔径大小不同的凝胶来分离不同大小的蛋白质。
而在凝胶电泳中，蛋白质会受到电场的作用而迁移，根据蛋白质在凝胶中的迁移速率和电荷大小来分离不同的蛋白质。
4. 溶剂萃取：利用不同溶剂对蛋白质的亲水性和亲油性差异进行分离的方法。
例如，利用氯仿和甲醇的溶解性差异，可以将蛋白质从溶液中提取至有机相中。
5. 冷沉淀：利用低温和高盐浓度的方法使蛋白质从溶液中沉淀出来。
具有固定温度和浓度阈值的蛋白质会在特定条件下沉淀而分离纯化。
生物化学 第7章 蛋白质理化性质及其分离纯化
蛋白质的沉淀可分为
不变性沉淀∶用于分离活性的天然蛋白质产品。 如：酶、抗体等。
变性沉淀∶用于生物制品中除去蛋白质。
变性后的蛋白质由于 疏水基团的暴露而易 于沉淀，但沉淀的蛋 白质不一定都是变性 后的蛋白质。
变性不一定沉淀，沉淀也不一定变性
使蛋白质沉淀的方法
1. 等电点沉淀 2. 盐析 3. 有机溶剂沉淀 4. 重金属盐沉淀 5. 生物碱试剂沉淀 6. 热变性沉淀
去除尿素 β-巯基乙醇
有活性
无活性
/biochemistry/gif/1.jpg
P300
四、蛋白质的沉淀
当破坏了维持蛋白质胶体稳定的水化膜和表面
电荷，蛋白质胶体失去稳定性，从溶液中析出，这 种现象称为蛋白质的沉淀（precipitation）。
应用:
（1）蛋白质分离纯化 （2）解毒 （3）临床检验 （4）低温贮存
根据蛋白质电离性质，可利用电泳的实 验方法，将蛋白质进行分离、纯化和鉴 定。
电泳（electrophosesis) 带电粒子在电场中向电性相反的电
极移动的现象。
蛋白质在等电点pH条件下，不发生电泳 现象。
电泳（electrophosesis)
二、蛋白质的胶体性质
真溶液的溶质分子的颗粒大小<1nm； 胶体溶液中溶质分子的颗粒大小在1-100nm； 蛋白质分子的相对分子量在1-100万，其颗粒大
盐析（NH4）2SO4
盐析
向蛋白质溶液中加入大量硫酸铵后蛋白质会 沉淀析出
蛋白质分子表面的疏水区域，聚集了许多水分子，高 盐浓度使水化层被破坏，暴露出的疏水区域，它们发 生相互作用而沉淀
蛋白质是两性电解质。在溶液中的带 电状况主要取决于溶液的pH值。
蛋白质的理化性质及分离分析
生产生活中有利的一面：
食品加工，消毒灭菌等； 非蛋白生物物质提取纯化，终止酶促反应；
生产生活中不利的一面：
活性蛋白制品（酶、抗体）的分离提取和保存；
四、蛋白质的沉淀作用
1. What’s precipitation of protein?
外加一些因素去除蛋白质胶体的稳定因素后，使蛋 白质分子相互聚集而从溶液中析出的现象称为沉淀 （precipitation）。 变性后的蛋白质由于疏水 基团的暴露而易于沉淀， 但沉淀的蛋白质不一定都 是变性后的蛋白质。
蛋白质仍能保持生物活性的沉淀方法
（1）盐析—中性盐沉淀
What’s salt precipitation of protein?
盐溶作用 盐析作用
蛋白质仍能保持生物活性的沉淀方法
（1）盐析—中性盐沉淀
What’s salt precipitation of protein? 定义：在蛋白质溶液中加入大量中性盐，以 破坏蛋白质的胶体性质，使蛋白质从溶液中 沉淀析出，称为盐析（salt precipitation）。 作用机制: 中和电荷的同时破坏水化膜;
蛋白质的理化性质 及分离分析
蛋白质的理化性质
一、两性性质及等电点 二、胶体性质 三、变性与复性作用 四、蛋白质的沉淀作用 五、沉降作用 六、蛋白质的颜色反应 七、蛋白质的紫外吸收性质
一、蛋白质的两性解离与等电点
蛋白质分子中氨基酸残基的侧链上存在游离的 氨基和羧基，因此蛋白质与氨基酸一样具有两 性解离性质，具有特定的等电点（pI）。
沉降速度法测定分子量的原理； 梯度离心分离蛋白质（氯化铯）；
六、蛋白质的颜色反应
1. 双缩脲反应 2. 茚三酮反应 3. 考马斯亮蓝G250 4. 福林酚试剂反应 5. 黄色反应--芳香族氨基酸的特有反应 6. 米伦氏反应—酪氨酸的特有反应 7. 乙醛酸反应—色氨酸的特有反应 8. 坂口反应—精氨酸特有的反应
食品加工，消毒灭菌等； 非蛋白生物物质提取纯化，终止酶促反应；
生产生活中不利的一面：
活性蛋白制品（酶、抗体）的分离提取和保存；
四、蛋白质的沉淀作用
1. What’s precipitation of protein?
外加一些因素去除蛋白质胶体的稳定因素后，使蛋 白质分子相互聚集而从溶液中析出的现象称为沉淀 （precipitation）。 变性后的蛋白质由于疏水 基团的暴露而易于沉淀， 但沉淀的蛋白质不一定都 是变性后的蛋白质。
蛋白质仍能保持生物活性的沉淀方法
（1）盐析—中性盐沉淀
What’s salt precipitation of protein?
盐溶作用 盐析作用
蛋白质仍能保持生物活性的沉淀方法
（1）盐析—中性盐沉淀
What’s salt precipitation of protein? 定义：在蛋白质溶液中加入大量中性盐，以 破坏蛋白质的胶体性质，使蛋白质从溶液中 沉淀析出，称为盐析（salt precipitation）。 作用机制: 中和电荷的同时破坏水化膜;
蛋白质的理化性质 及分离分析
蛋白质的理化性质
一、两性性质及等电点 二、胶体性质 三、变性与复性作用 四、蛋白质的沉淀作用 五、沉降作用 六、蛋白质的颜色反应 七、蛋白质的紫外吸收性质
一、蛋白质的两性解离与等电点
蛋白质分子中氨基酸残基的侧链上存在游离的 氨基和羧基，因此蛋白质与氨基酸一样具有两 性解离性质，具有特定的等电点（pI）。
沉降速度法测定分子量的原理； 梯度离心分离蛋白质（氯化铯）；
六、蛋白质的颜色反应
1. 双缩脲反应 2. 茚三酮反应 3. 考马斯亮蓝G250 4. 福林酚试剂反应 5. 黄色反应--芳香族氨基酸的特有反应 6. 米伦氏反应—酪氨酸的特有反应 7. 乙醛酸反应—色氨酸的特有反应 8. 坂口反应—精氨酸特有的反应
蛋白质分离纯化的技术
蛋白质分离纯化的技术前言蛋白质是生物体内非常重要的大分子有机物质，具有各种生物学功能，如结构支持、催化反应、传递信息、运输物质及免疫防御。
而蛋白质的研究和应用，早已成为生命科学的热门领域。
然而，大多数生物体中的蛋白质都混杂着众多的其他大分子物质，为了研究或应用某种特定蛋白质，就需要将它从其它物质中分离纯化出来。
今天我们就要来讲一讲蛋白质分离纯化的技术。
一、蛋白质分离的基本原理蛋白质分离的基本原理是利用不同的性质来分离具有不同特性的蛋白质。
蛋白质的各种性质包括分子大小、分子形状、电荷、亲疏水性、氨基酸序列等。
根据这些不同的性质，分别选择不同的分离纯化方法，可以实现不同程度的分离纯化效果。
二、蛋白质分离纯化技术的分类根据分离方式的不同，蛋白质分离纯化技术可以分为以下几类：1. 分子筛层析：分子筛层析是根据蛋白质的分子大小、形状来进行分离，其原理是在一定的缓冲液中，将特定孔径大小的陶瓷或聚合物微球填充进层析柱，根据蛋白质的分子大小，从层析柱中流出不同的蛋白质。
这种方法可以使蛋白质得到较好的分离纯化，但需要考虑蛋白质的保护。
2. 表面等电聚焦（IEF）：表面等电聚焦是根据蛋白质的等电点来进行分离，其原理是在聚丙烯酰胺凝胶电泳板上加上一组垂直于电泳方向的电场，在酸性一端放置一种酸性缓冲液，碱性一端放置一种碱性缓冲液，中间分别加入样品，蛋白质会在等电点处停留，使得不同等电点的蛋白质得到了分离和收获。
这种方法可以进行多品种、高分辨率的蛋白质分离。
3. 亲和层析：亲和层析是根据蛋白质与其他化合物的特异性相互作用进行分离，其原理是特定的化合物置于层析柱中，当特定的蛋白质与化合物结合时，蛋白质就可以纯化出来。
如在层析柱中放入钙离子，就可以纯化出骨钙蛋白，并且可以通过控制钙离子浓度来实现蛋白质的分离。
4. 透析：透析是将样品分子分离于透析膜之内或之外的方法。
通常将混合物放置于透析袋内，在培养基、缓冲液等适当环境中，透析袋内的小分子会从透析膜渗透出去，而较大的蛋白质则被留在透析袋内。
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原则
生物 化学
1 理化性质
分离纯化
(1) (2)
第四节 蛋白质的理化性质 及其分离纯化
蛋白质电泳 蛋白质电泳 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 在等电点偏碱性溶液中，蛋白质粒子 在等电点偏碱性溶液中，(SDS蛋白质电泳 使用含有一种去污剂十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) (PAGE)是一种利 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)是一种利 带负电荷，在电场中向正极移动； 带负电荷，在电场中向正极移动；在等
生物 西北农林科技大学 化学
动物科技学院生物化学课程组
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生物 化学
1 理化性质
(1) (2) (3) (4) (5) (6)
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
第四节 蛋白质的理化性质 及其分离纯化
蛋白质的酸碱性质和等电点
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酸碱性质
分子量 胶体性质 紫外吸收 变性作用 化学反应
分离纯化 分析鉴定
生物 化学
第四节 蛋白质的理化性质 及其分离纯化
选择性沉淀蛋白质的方法 ： 1 理化性质 ①盐析法: 大量的中性盐[(NH4)2SO4、Na2SO4、 NaCl]，使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。 (1) 酸碱性质 蛋白质的胶体性质与蛋白质沉淀 ②有机溶剂沉淀法： 破坏水化膜，降低介电常数， (2) 分子量 蛋白质分子直径在1 100nm 之间， nm之间 蛋白质分子直径在 1-100nm 之间 ， 在水溶液 PEG、丙酮、乙醇等 (3) 胶体性质 中具有胶体溶液的通性（布朗运动，丁达耳现象， 中具有胶体溶液的通性（布朗运动，丁达耳现象， ③重金属盐沉淀：pH＞pI时带负电荷，与重金属 pH pI (4) 紫外吸收 不能通过半透膜） 不能通过半透膜） 离子（Hg2+、Pb2+、Cu2+ 等）结成不溶性沉淀 稳定蛋白质胶体溶液的主要因素有： 稳定蛋白质胶体溶液的主要因素有： (5) 变性作用 水化膜； 同种电荷的互相排斥； ①水化膜； ②同种电荷的互相排斥； ③布郎 ④生物碱试剂和某些酸类沉淀法：pH小于等电时， (6) 化学反应 运动 蛋白质带正电荷，易与生物碱试剂和酸类的负离 分离纯化 蛋白质的沉淀作用是指改变溶液的条件， 蛋白质的沉淀作用是指改变溶液的条件，影 子生成不溶性沉淀。生物碱试剂：单宁酸、苦味 响蛋白质的溶解性，使其从溶液中沉淀出来。 响蛋白质的溶解性，使其从溶液中沉淀出来。 分析鉴定 酸、钨酸。酸类：三氯乙酸、磺基水杨酸。 ⑤加热变性沉淀。 ⑥等电点沉淀法
酸碱性质 分子量 胶体性质
紫外吸收
变性作用 化学反应
分离纯化 分析鉴定
生物 化学
1 理化性质
(1) (2) (3) (4) (5) (6)
第四节 蛋白质的理化性质 及其分离纯化
蛋白质变性、 蛋白质变性、沉淀与凝固 蛋白质的变性作用(denaturation) 变性后的蛋白质由于疏水基团 某些物理或化学因素，： 某些物理或化学因素，破坏蛋白质的结构 变性蛋白质的性质改变： 变性蛋白质的性质改变 状态， 状态，引起蛋白质理化性质改变并导致其生 的暴露而易于沉淀， ，溶解度下降 物理性质：旋光性改变， ①的暴露而易于沉淀，但沉淀的蛋白 ， 物理性质：旋光性改变 溶解度下降， 理活性丧失，称为蛋白质的变性。 理活性丧失，称为蛋白质的变性。 沉降率升高，粘度升高，光吸收度增加等； 沉降率升高，粘度升高，光吸收度增加等； 质不一定都是变性后的蛋白质。 质不一定都是变性后的蛋白质。 蛋白质变性的实质是次级键的断裂和重排， 蛋白质变性的实质是次级键的断裂和重排， 化学性质：官能团反应性增加， ② 化学性质：官能团反应性增加，易被 有些变性蛋白质在一定条件下还 不涉及肽键的断裂。 不涉及肽键的断裂。 蛋白酶水解。 蛋白酶水解。 引起蛋白质变性的因素 。 可以复性，是可逆变性。 生物学性质：原有生物学活性丧失， ③可以复性，是可逆变性 生物学性质：原有生物学活性丧失， 物理因素： ① 物理因素：高温、高压、紫外线、电离 抗原性改变。 抗原性改变。 高温、高压、紫外线、 加热使蛋白质变性并凝聚成块状 辐射、超声波、机械剪切等； 辐射、超声波、机械剪切等； 称为凝固。因此， 强碱、有机溶剂 化学因素：强酸、 ② 称为凝固。因此，凡凝固的蛋白质 、重 化学因素：强酸、强碱、有机溶剂、 金属盐等。 金属盐等。 一定发生变性。 一定发生变性。
生物 化学
1 理化性质
(1) (2) (3) (4) (5) (6)
第四节 蛋白质的理化性质 及其分离纯化
酸碱性质
分子量
胶体性质 紫外吸收 变性作用 化学反应
分离纯化 分析鉴定
RT Mr = lim π c→0 c
蛋白质的分子量
化学组成法 SDS-PAGE法 SDS-PAGE法 凝胶过滤法 渗透压法 沉降系数法和沉降平衡法
生物 化学
1 理化性质
(1) (2) (3) (4) (5) (6)
第四节 蛋白质的理化性质 及其分离纯化
蛋白质紫外吸收
大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙 氨酸、酪氨酸和色氨酸。 氨酸、酪氨酸和色氨酸。 这三种氨基酸的在280nm 这三种氨基酸的在280nm 附近有最大 吸收，使得大多数蛋白质在280nm 吸收，使得大多数蛋白质在280nm 附近 显示强的吸收。 显示强的吸收。 利用这个性质， 利用这个性质，可以对蛋白质进行定 性鉴定。 性鉴定。
酸碱性质 分子量 胶体性质 紫外吸收 变性作用
化学反应
分离纯化 分析鉴定
生物 化学
1 理化性质
分离纯化
(1) (2)
第四节 蛋白质的理化性质 及其分离纯化
生物组织 前 4、浓缩与保存 1、前处理： 2、粗分级溶 解、差速离心 、 粗分级： 处 前处理： 破碎、 破碎、 ： 浓缩方法： 浓缩方法： 理 ①将组织和细胞破碎 细分级： 3、细分级： 一般用选择性沉淀法。 保存方法： 一般用选择性沉淀法。 保存方法： 无细胞提取液 动物组织和细胞：NH4） 电动捣碎机、匀浆器、 动物组织和细胞（NH4）2SO4分级沉淀法、超 ：电动捣碎机、匀浆器 粗 透析除盐 ① ① 晶体保存： ①晶体保存： 声波处理植物组织和细胞：石英砂+提取液 声波处理植物组织和细胞：石英砂 提取液， 分 分离纯化蛋白质的一般原则 提取液， 盐析） （盐析） 选择性沉淀法 G-25凝胶过滤除盐 ②sephdex G-25凝胶过滤除盐 结晶过程本身也伴随着一定程度的提纯。 结晶过程本身也伴随着一定程度的提纯。能否 离 研磨、 研磨、 纤维素酶处理 ②等电点选择性沉淀法 分离和纯化蛋白质就是要增加制品的 层析法：凝胶过滤层析、离子交换层析、 层析法：凝胶过滤层析、离子交换层析、吸 结晶不仅是纯度的一个指标， 结晶不仅是纯度的一个指标，也是判断制品是 细菌：超声波震荡、与砂研磨、高压挤压、 细菌：超声波震荡、与砂研磨、高压挤压、 ③有机溶剂分级沉淀法 纯度或比活性。 纯度或比活性。 附层析、亲和层析、 附层析、亲和层析、疏水层析 否有活性的指标。纯度越高，溶液越浓， 否有活性的指标。纯度越高，溶液越浓，越容 溶菌酶处理（分解肽聚糖） 粗分级、细分吸附 分解肽聚糖） 亲和 、 溶菌酶处理（离子交 前处理、粗分级疏水 电泳 自由界面电泳、区带电泳（ 一般流程为： 凝胶 区带电泳（凝胶 一般流程为：前处理、 电泳法： ④热处理选择性沉淀法 电泳法 易结晶。 易结晶。：自由界面电泳、 换层析 层析 ②差速离心法收集细胞的某一组分 层析 层析 过滤 电泳、滤纸和薄膜电泳、粉末电泳、。 电泳、滤纸和薄膜电泳、粉末电泳、 结晶方法：使溶液略处于过饱和状态。降低温 结晶方法：使溶液略处于过饱和状态细丝电 细 级、浓缩与保存 ⑤生物碱或三氯乙酸选择性 在不同离心力下沉降的细胞组分 分 盐析、加有机溶剂、调节、双向电泳 。 沉淀法 泳等）、盘状电泳、等电聚焦、 ）、盘状电泳 泳等）、盘状电泳、等电聚焦pH 接入晶种。 pH、 度、盐析、加有机溶剂、调节pH、接入晶种 离如果提取膜蛋白： ③如果提取膜蛋白： 离心法： 离心法：密度梯度离心 冻干粉保存： ②冻干粉保存： 超声波或去污剂使膜解聚， 超声波或去污剂使膜解聚，然后用适当的介 精制后蛋白质保存 溶液保存： ③溶液保存： 质提取。 质提取。 加入抗冻剂（50%甘油 甘油） 20～ 70℃保存 保存。 加入抗冻剂（50%甘油）后-20～-70℃保存。
原则
方法
分析鉴定
生物 化学
1 理化性质
分离纯化
(1) (2)
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蛋白质分离纯化常用方法的依据
根据蛋白质的溶解度分离 根据电荷差异分离 根据分子大小分离 根据配体特性异性分离 选择性吸附分离（物理吸附） 选择性吸附分离（物理吸附） 根据疏水性的差异
原则
方法
①利用差异 ② ③ ④ ⑤
酸碱性质 分子量 胶体性质 紫外吸收
变性作用
化学反应
分离纯化 分析鉴定
生物 化学
1 理化性质
(1) (2) (3) (4) (5) (6)
第四节 蛋白质的理化性质 及其分离纯化
化学反应
黄色反应，由硝酸与氨基酸的苯基（酪 黄色反应， 由硝酸与氨基酸的苯基（ 氨酸和苯丙氨酸） 氨酸和苯丙氨酸 ） 反应生成二硝基苯衍生 物而显黄色。 物而显黄色。 多肽的双缩脲反应：双缩脲是两分子的尿 素经加热失去一分子NH3而得到的产物。双 双 缩脲能够与碱性硫酸铜作用， 缩脲能够与碱性硫酸铜作用 ， 产生兰色的 双缩脲络合物， 称为双缩脲反应。 铜 - 双缩脲络合物 ， 称为双缩脲反应 。 含 有两个以上肽键的多肽， 有两个以上肽键的多肽 ， 具有与双缩脲相 似的结构特点，也能发生双缩脲反应，生 似的结构特点， 也能发生双缩脲反应， 成紫红色或蓝紫色络合物。 成紫红色或蓝紫色络合物 。 这是多肽定量 测定的重要反应。
沉淀 电泳 层析 离心
⑥ 膜分离
分析鉴定
生物 化学
1 理化性质
分离纯化
(1) (2)
第四节 蛋白质的理化性质 及其分离纯化
蛋白质电泳 蛋白质电泳 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 在等电点偏碱性溶液中，蛋白质粒子 在等电点偏碱性溶液中，(SDS蛋白质电泳 使用含有一种去污剂十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) (PAGE)是一种利 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)是一种利 带负电荷，在电场中向正极移动； 带负电荷，在电场中向正极移动；在等
生物 西北农林科技大学 化学
动物科技学院生物化学课程组
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1 理化性质
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第四节 蛋白质的理化性质 及其分离纯化
蛋白质的酸碱性质和等电点
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酸碱性质
分子量 胶体性质 紫外吸收 变性作用 化学反应
分离纯化 分析鉴定
生物 化学
第四节 蛋白质的理化性质 及其分离纯化
选择性沉淀蛋白质的方法 ： 1 理化性质 ①盐析法: 大量的中性盐[(NH4)2SO4、Na2SO4、 NaCl]，使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。 (1) 酸碱性质 蛋白质的胶体性质与蛋白质沉淀 ②有机溶剂沉淀法： 破坏水化膜，降低介电常数， (2) 分子量 蛋白质分子直径在1 100nm 之间， nm之间 蛋白质分子直径在 1-100nm 之间 ， 在水溶液 PEG、丙酮、乙醇等 (3) 胶体性质 中具有胶体溶液的通性（布朗运动，丁达耳现象， 中具有胶体溶液的通性（布朗运动，丁达耳现象， ③重金属盐沉淀：pH＞pI时带负电荷，与重金属 pH pI (4) 紫外吸收 不能通过半透膜） 不能通过半透膜） 离子（Hg2+、Pb2+、Cu2+ 等）结成不溶性沉淀 稳定蛋白质胶体溶液的主要因素有： 稳定蛋白质胶体溶液的主要因素有： (5) 变性作用 水化膜； 同种电荷的互相排斥； ①水化膜； ②同种电荷的互相排斥； ③布郎 ④生物碱试剂和某些酸类沉淀法：pH小于等电时， (6) 化学反应 运动 蛋白质带正电荷，易与生物碱试剂和酸类的负离 分离纯化 蛋白质的沉淀作用是指改变溶液的条件， 蛋白质的沉淀作用是指改变溶液的条件，影 子生成不溶性沉淀。生物碱试剂：单宁酸、苦味 响蛋白质的溶解性，使其从溶液中沉淀出来。 响蛋白质的溶解性，使其从溶液中沉淀出来。 分析鉴定 酸、钨酸。酸类：三氯乙酸、磺基水杨酸。 ⑤加热变性沉淀。 ⑥等电点沉淀法
酸碱性质 分子量 胶体性质
紫外吸收
变性作用 化学反应
分离纯化 分析鉴定
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(1) (2) (3) (4) (5) (6)
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蛋白质变性、 蛋白质变性、沉淀与凝固 蛋白质的变性作用(denaturation) 变性后的蛋白质由于疏水基团 某些物理或化学因素，： 某些物理或化学因素，破坏蛋白质的结构 变性蛋白质的性质改变： 变性蛋白质的性质改变 状态， 状态，引起蛋白质理化性质改变并导致其生 的暴露而易于沉淀， ，溶解度下降 物理性质：旋光性改变， ①的暴露而易于沉淀，但沉淀的蛋白 ， 物理性质：旋光性改变 溶解度下降， 理活性丧失，称为蛋白质的变性。 理活性丧失，称为蛋白质的变性。 沉降率升高，粘度升高，光吸收度增加等； 沉降率升高，粘度升高，光吸收度增加等； 质不一定都是变性后的蛋白质。 质不一定都是变性后的蛋白质。 蛋白质变性的实质是次级键的断裂和重排， 蛋白质变性的实质是次级键的断裂和重排， 化学性质：官能团反应性增加， ② 化学性质：官能团反应性增加，易被 有些变性蛋白质在一定条件下还 不涉及肽键的断裂。 不涉及肽键的断裂。 蛋白酶水解。 蛋白酶水解。 引起蛋白质变性的因素 。 可以复性，是可逆变性。 生物学性质：原有生物学活性丧失， ③可以复性，是可逆变性 生物学性质：原有生物学活性丧失， 物理因素： ① 物理因素：高温、高压、紫外线、电离 抗原性改变。 抗原性改变。 高温、高压、紫外线、 加热使蛋白质变性并凝聚成块状 辐射、超声波、机械剪切等； 辐射、超声波、机械剪切等； 称为凝固。因此， 强碱、有机溶剂 化学因素：强酸、 ② 称为凝固。因此，凡凝固的蛋白质 、重 化学因素：强酸、强碱、有机溶剂、 金属盐等。 金属盐等。 一定发生变性。 一定发生变性。
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1 理化性质
(1) (2) (3) (4) (5) (6)
第四节 蛋白质的理化性质 及其分离纯化
酸碱性质
分子量
胶体性质 紫外吸收 变性作用 化学反应
分离纯化 分析鉴定
RT Mr = lim π c→0 c
蛋白质的分子量
化学组成法 SDS-PAGE法 SDS-PAGE法 凝胶过滤法 渗透压法 沉降系数法和沉降平衡法
生物 化学
1 理化性质
(1) (2) (3) (4) (5) (6)
第四节 蛋白质的理化性质 及其分离纯化
蛋白质紫外吸收
大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙 氨酸、酪氨酸和色氨酸。 氨酸、酪氨酸和色氨酸。 这三种氨基酸的在280nm 这三种氨基酸的在280nm 附近有最大 吸收，使得大多数蛋白质在280nm 吸收，使得大多数蛋白质在280nm 附近 显示强的吸收。 显示强的吸收。 利用这个性质， 利用这个性质，可以对蛋白质进行定 性鉴定。 性鉴定。
酸碱性质 分子量 胶体性质 紫外吸收 变性作用
化学反应
分离纯化 分析鉴定
生物 化学
1 理化性质
分离纯化
(1) (2)
第四节 蛋白质的理化性质 及其分离纯化
生物组织 前 4、浓缩与保存 1、前处理： 2、粗分级溶 解、差速离心 、 粗分级： 处 前处理： 破碎、 破碎、 ： 浓缩方法： 浓缩方法： 理 ①将组织和细胞破碎 细分级： 3、细分级： 一般用选择性沉淀法。 保存方法： 一般用选择性沉淀法。 保存方法： 无细胞提取液 动物组织和细胞：NH4） 电动捣碎机、匀浆器、 动物组织和细胞（NH4）2SO4分级沉淀法、超 ：电动捣碎机、匀浆器 粗 透析除盐 ① ① 晶体保存： ①晶体保存： 声波处理植物组织和细胞：石英砂+提取液 声波处理植物组织和细胞：石英砂 提取液， 分 分离纯化蛋白质的一般原则 提取液， 盐析） （盐析） 选择性沉淀法 G-25凝胶过滤除盐 ②sephdex G-25凝胶过滤除盐 结晶过程本身也伴随着一定程度的提纯。 结晶过程本身也伴随着一定程度的提纯。能否 离 研磨、 研磨、 纤维素酶处理 ②等电点选择性沉淀法 分离和纯化蛋白质就是要增加制品的 层析法：凝胶过滤层析、离子交换层析、 层析法：凝胶过滤层析、离子交换层析、吸 结晶不仅是纯度的一个指标， 结晶不仅是纯度的一个指标，也是判断制品是 细菌：超声波震荡、与砂研磨、高压挤压、 细菌：超声波震荡、与砂研磨、高压挤压、 ③有机溶剂分级沉淀法 纯度或比活性。 纯度或比活性。 附层析、亲和层析、 附层析、亲和层析、疏水层析 否有活性的指标。纯度越高，溶液越浓， 否有活性的指标。纯度越高，溶液越浓，越容 溶菌酶处理（分解肽聚糖） 粗分级、细分吸附 分解肽聚糖） 亲和 、 溶菌酶处理（离子交 前处理、粗分级疏水 电泳 自由界面电泳、区带电泳（ 一般流程为： 凝胶 区带电泳（凝胶 一般流程为：前处理、 电泳法： ④热处理选择性沉淀法 电泳法 易结晶。 易结晶。：自由界面电泳、 换层析 层析 ②差速离心法收集细胞的某一组分 层析 层析 过滤 电泳、滤纸和薄膜电泳、粉末电泳、。 电泳、滤纸和薄膜电泳、粉末电泳、 结晶方法：使溶液略处于过饱和状态。降低温 结晶方法：使溶液略处于过饱和状态细丝电 细 级、浓缩与保存 ⑤生物碱或三氯乙酸选择性 在不同离心力下沉降的细胞组分 分 盐析、加有机溶剂、调节、双向电泳 。 沉淀法 泳等）、盘状电泳、等电聚焦、 ）、盘状电泳 泳等）、盘状电泳、等电聚焦pH 接入晶种。 pH、 度、盐析、加有机溶剂、调节pH、接入晶种 离如果提取膜蛋白： ③如果提取膜蛋白： 离心法： 离心法：密度梯度离心 冻干粉保存： ②冻干粉保存： 超声波或去污剂使膜解聚， 超声波或去污剂使膜解聚，然后用适当的介 精制后蛋白质保存 溶液保存： ③溶液保存： 质提取。 质提取。 加入抗冻剂（50%甘油 甘油） 20～ 70℃保存 保存。 加入抗冻剂（50%甘油）后-20～-70℃保存。
原则
方法
分析鉴定
生物 化学
1 理化性质
分离纯化
(1) (2)
第四节 蛋白质的理化性质 及其分离纯化
蛋白质分离纯化常用方法的依据
根据蛋白质的溶解度分离 根据电荷差异分离 根据分子大小分离 根据配体特性异性分离 选择性吸附分离（物理吸附） 选择性吸附分离（物理吸附） 根据疏水性的差异
原则
方法
①利用差异 ② ③ ④ ⑤
酸碱性质 分子量 胶体性质 紫外吸收
变性作用
化学反应
分离纯化 分析鉴定
生物 化学
1 理化性质
(1) (2) (3) (4) (5) (6)
第四节 蛋白质的理化性质 及其分离纯化
化学反应
黄色反应，由硝酸与氨基酸的苯基（酪 黄色反应， 由硝酸与氨基酸的苯基（ 氨酸和苯丙氨酸） 氨酸和苯丙氨酸 ） 反应生成二硝基苯衍生 物而显黄色。 物而显黄色。 多肽的双缩脲反应：双缩脲是两分子的尿 素经加热失去一分子NH3而得到的产物。双 双 缩脲能够与碱性硫酸铜作用， 缩脲能够与碱性硫酸铜作用 ， 产生兰色的 双缩脲络合物， 称为双缩脲反应。 铜 - 双缩脲络合物 ， 称为双缩脲反应 。 含 有两个以上肽键的多肽， 有两个以上肽键的多肽 ， 具有与双缩脲相 似的结构特点，也能发生双缩脲反应，生 似的结构特点， 也能发生双缩脲反应， 成紫红色或蓝紫色络合物。 成紫红色或蓝紫色络合物 。 这是多肽定量 测定的重要反应。
沉淀 电泳 层析 离心
⑥ 膜分离
分析鉴定