高效液相色谱法检测水产品中三种喹诺酮类药物残留量方法研究
液相色谱串联质谱法对水产品中喹诺酮类药物的测定
试点论坛shi dian lun tan407液相色谱串联质谱法对水产品中喹诺酮类药物的测定◎李新摘要：目的 使用液相色谱串联质谱法对水产品中环丙沙星、氧氟沙星、洛美沙星、诺氟沙星、培氟沙星、恩诺沙星6种喹诺酮类药物残留情况，以建立喹诺酮类药物水产品液相色谱串联质法测定方案。
方法 采用乙腈提取样品，后将提取液进行正己烷液液分配脱脂后，使用强阳离子固相萃取小柱净化的方式，对样品进行液相色谱串联质谱法测定。
在检测中对液相色谱串联质法测定全过程进行适当优化，并分析优化后6种喹诺酮类药物残留检测回收率等。
结果 0～40μg/L 范围内测定6种喹诺酮类药物的线性关系良好，且相关系数均在0.9924～0.9986之间，回收率高达80.36%～92.65%。
结论 对液相色谱串联质法测定全过程进行适当优化，使用强阳离子固相萃取小柱净化方式，可以满足水产品喹诺酮类药物检测的要求，值得深入研究与应用。
关键词：水产品；液相色谱串联质谱法；喹诺酮水产品属于生活中较为常见的食材，尤其是鱼、虾等产品更是由于口感细腻鲜美，深受大众喜爱，但水产品在养殖过程中可能存在一些药物残留的情况，这些药物残留达到一定水平会对食用的大众健康构成严重威胁。
喹诺酮类属于水产品中易于超标的药物残留之一，此类药物属于广谱性的抗菌剂，由于其在革兰仕菌、球菌、杆菌等防治上效果好，所需成本低，使得这类药物成为水产品养殖中不可或缺的药物之一，但过量的药物残留会影响水产品的品质[1]。
而想要真正确保水产品安全，则需要强化对喹诺酮类药物残留的检测质量。
液相色谱串联质谱法属于近些年在药物残留等检测中应用较为广泛的技术，研究在此种检测法基础上进行优化的水产品喹诺酮类药物检测方案，对于提高水产品喹诺酮类药物检测质量，确保水产品安全具有重要意义[2]。
一、实验材料与方法（1）实验材料。
实验器材：实验中所用的仪器为液相色谱仪（Thermo Fisher U3000）、串联质谱仪（TSQ Quantum Access Max）配ESI 离子源、离心机。
液相色谱检测水产品中喹诺酮类药物的方法改进研究
液相色谱检测水产品中喹诺酮类药物的方法改进研究王丽娟;张骊;钱卓真;汤水粉;叶玫;吴成业【摘要】Orthogonal test was employed to investigate the factors affecting retention time shift of quinolones in liquid chromatography. Retentiontime drift rate of norfloxacin, ciprofloxacin and enrofloxacin was used as evaluation criteria, and species of mobile phase, pretreatment conditions, sample types were investigated. It was shown that species of mobile phase was the main factor which affected retention time strongly. Retention time shift rate had obvious difference for norfloxacin, ciprofloxacin and enrofloxacin before and after adding the buffer salt mobile phase and optimizing the pretreatment conditions. The improved retention time drift rate reduced by 9.11%, 7. 74% and 7. 97% respectively. Through this experiment, stable retention time of norfloxacin, ciprofloxacin and enrofloxacin by liquid chromatography was obtained, and the best detection method was attained.%采用正交试验法考察液相色谱法检测喹诺酮类药物保留时间漂移现象的主要影响因素。
高效液相色谱法检测多种动物组织中氟喹诺酮类药物残留量的研究
高效液相色谱法检测多种动物组织中氟喹诺酮类药物残留量的研究张玉洁;李倩;汪霞;王鹤佳;薛毅;仲锋【摘要】建立了猪、牛、羊、鸡、兔的肌肉、脂肪、肝脏和肾脏四种组织中环丙沙星、达氟沙星、恩诺沙星、沙拉沙星和二氟沙星残留量检测的高效液相色谱法。
试样经磷酸盐溶液提取，C18固相萃取柱浓缩净化后，用高效液相色谱分析，荧光检测器检测，外标法定量c-5种药物在0．1～100μg／L浓度范围内线性关系良好。
环丙沙星、恩诺沙星、沙拉沙星和二氟沙星在五种动物肌肉、脂肪组织中的定量限为5μg/kg，在肝脏、肾脏组织中的定量限为10μg／kg；达氟沙星在肌肉、脂肪组织中的定量限为1μg／kg，在肝脏、肾脏组织中的定量限为2μg／kg。
在指定的三个浓度添加水平下，5种药物在各组织中的平均回收率为62％～103％；批内变异系数为0．30％-18％，批间变异系数为1．0％-17％。
该方法操作简单，准确度和精密度好，动物品种及动物组织覆盖范围广，可以很好地满足实际检测工作的需要。
%An HPLC method for the determination of ciprofloxacin, danofloxacin, enrofloxacin, sarafloxacin and difloxacin in muscle, fat, liver and kidney of swine, chicken, cattle, sheep and rabbit been developed. The analytes were extracted with phosphate solution and the supernatant ofthe extract was applied onto a C18 solid phase extraction column for clean -up. The separation was achieved by HPLC, and the detection was performed with a fluorescence detector. The calibration curves showed nearly perfect linearity between the peak areas and concentrations of fluoroquinolones in range from 0. 1 to 100 μg/L. The limit of quantification （LOQ） was 5 μg/kg for ciprofloxacin, enrofloxacin, sarafloxacin anddifloxacin in muscle and fat and 10 μg/kg in liver and kidney. As for danofloxacin, the LOQ was 1μg/kg in muscle and fat and 2 μg/kg in liver and kidney. The average recoveries at the three assigned concentrations were 62 % - 103 %, intra - and inter - batch variation coefficients were0.30 % - 18 % and 1.0 % - 17 %. This simple, fast HPLC method with high accuracy and precision can be applied in detection of FQs in diverse animal tissues from various animal species, which is considered sufficient for routine analysis.【期刊名称】《中国兽药杂志》【年(卷),期】2012(046)007【总页数】5页(P18-22)【关键词】氟喹诺酮类药物;残留;动物组织;高效液相色谱法【作者】张玉洁;李倩;汪霞;王鹤佳;薛毅;仲锋【作者单位】中国兽医药品监察所,北京100081;中国兽医药品监察所,北京100081;中国兽医药品监察所,北京100081;中国兽医药品监察所,北京100081;中国动物疫病预防控制中心,北京100026;中国兽医药品监察所,北京100081【正文语种】中文【中图分类】S859.84氟喹诺酮类药物(FQs)自20世纪80年代初问世以来，相继被合成了许多广谱、高效、低毒的广谱杀菌性抗菌药，主要的药物有诺氟沙星、二氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星、达氟沙星等。
三种喹诺酮类药物在鸡蛋中残留消除规律的研究
三种喹诺酮类药物在鸡蛋中残留消除规律的研究章敏;宁军;余军军;韦田;邰镝【摘要】建立了一种检测三种喹诺酮类药物在鸡蛋中残留的高效液相色谱-荧光检测法。
利用建立的方法对三种喹诺酮类药物在产蛋期蛋鸡用药后鸡蛋中的浓度进行了测定，并根据测定值研究了鸡蛋中药物的残留消除规律。
400 kg水中分别添加不同含量的诺氟沙星、氧氟沙星、恩诺沙星，连续给药3 d，使用高效液相色谱法对鸡蛋中三种喹诺酮类药物残留进行分析。
结果表明，停药8 d时，鸡蛋中检出的诺氟沙星和氧氟沙星的浓度均低于10μg／kg；停药12 d时，鸡蛋中检出的恩诺沙星的浓度低于10μg／kg。
建议诺氟沙星和氧氟沙星在临床上蛋鸡产蛋前10 d左右停用，恩诺沙星在临床上蛋鸡产蛋前14 d左右停用。
%A method for determination of quinolones residues in eggs by HPLC with fluorescence detector detection was established, and this method for determination the concentration in the laying hens, the elimination of quinolones residues in eggs was studied. Different content of norfloxacin,ofloxacin,enrofloxacin were added in the water for 3 days, the residues of quinolones were determined by HPLC. The results showed that the residues of norfloxacinand and ofloxacin in eggs were less than 10μg/kg at 8th withdrawal day;the residues of enrofloxacin in eggs was less than 10 μg/kg at 12th withdrawal day. So, the withdrawal period of norfloxacin, ofloxacin, enrofloxacin were found to be 10 d,10 d,14 d in clinical before the age at first egg, respectively.【期刊名称】《中国兽药杂志》【年(卷),期】2014(000)003【总页数】4页(P55-58)【关键词】喹诺酮类;鸡蛋;残留;消除规律【作者】章敏;宁军;余军军;韦田;邰镝【作者单位】广东温氏食品集团股份有限公司，广东省畜禽健康养殖与环境控制企业重点实验室，广东新兴527439;广东温氏食品集团股份有限公司，广东省畜禽健康养殖与环境控制企业重点实验室，广东新兴527439;广东温氏食品集团股份有限公司，广东省畜禽健康养殖与环境控制企业重点实验室，广东新兴527439;广东温氏食品集团股份有限公司，广东省畜禽健康养殖与环境控制企业重点实验室，广东新兴527439;广东温氏食品集团股份有限公司，广东省畜禽健康养殖与环境控制企业重点实验室，广东新兴527439【正文语种】中文【中图分类】S859.84诺氟沙星(norfloxacin，NOR)、氧氟沙星(ofloxacin，OFL)、恩诺沙星(enrofloxacin，ENR)均属于喹诺酮类药物(quinolones，QNs)，该类药物是一类新型、高效、广谱、低毒的人工合成抗菌药，在畜牧养殖中广泛用于预防与治疗动物疾病，对革兰氏阳性菌特别是绿脓杆菌，以及革兰氏阴性菌有效，对支原体、衣原体也有良好抗菌作用。
高效液相色谱法测定淡水渔业用水中诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星残留
高效液相色谱法测定淡水渔业用水中诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星残留孟丽华;史艳伟;时彦民;简康;刘方;邓晨曦【摘要】该文采用高效液相色谱—荧光法检测淡水渔业用水中诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星3种喹诺酮类抗生素药物的残留,建立了检测淡水渔业用水中喹诺酮类抗生素药物的方法.结果显示,诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星的检出限(按S/N=3计)分别为2.5、1.0、2.5 μg/L,定量限(按S/N=10计)分别为5、1、5μg/L.按1倍、5倍、10倍定量限进行加标回收,3种抗生素的平均回收率为76.6％～89.9％,相对标准偏差(RSD)在1.72％～8.43％.【期刊名称】《水产养殖》【年(卷),期】2019(040)001【总页数】5页(P5-9)【关键词】喹诺酮类药物残留;高效液相色谱;固相萃取;渔业用水【作者】孟丽华;史艳伟;时彦民;简康;刘方;邓晨曦【作者单位】济宁市渔业监测站,山东济宁272000;济宁市渔业监测站,山东济宁272000;济宁市渔业监测站,山东济宁272000;济宁市渔业监测站,山东济宁272000;济宁市渔业监测站,山东济宁272000;济宁市渔业监测站,山东济宁272000【正文语种】中文【中图分类】S948诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星3种喹诺酮类抗生素药物具有广谱、高效的特点,被广泛应用到水产养殖业中，起到了良好的效果[1-2]。
但是调查发现在渔业养殖中使用的抗生素仅有小部分被鱼类吸收利用，还有大部分没有被食用或被食用后因没有被吸收以排泄物的方式排到水体中，在养殖水体中的大量残留，污染养殖环境的同时，对养殖渔业的健康发展也产生了不良影响[3-5]。
因此，喹诺酮类抗生素药物的使用和监测应得到广泛的关注和高度的重视。
但是，到目前为止对喹诺酮类药物残留的检测主要集中在水产品和海水养殖环境中，检测方法主要有液-质联用法[6-7]、高效液相色谱法[8-9]、酶联免疫法和荧光光度法等[10-11]，国内外针对淡水渔业用水中的检测方法比较少见，对淡水渔业用水中的喹诺酮类抗生素药物的含量没有相关的限制值[12]，也没有相关的国标、行标、地标，存在一定的监管盲区。
高效液相色谱法检测海水养殖环境中喹诺酮类药物残留
高效液相色谱法检测海水养殖环境中喹诺酮类药物残留摘要：建立了一种养殖海水中诺氟沙星、环丙沙星争恩诺沙星3种喹诺酮类抗生素残留量的高效液相色谱一荧光测定方法。
水样经稀盐酸调PH后经HLB固相萃取柱富集、净化，用外标法定量。
结果表明，诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星检出限分别是2、1和1 gg／L，定量限分别是6．6、3．3和3．3 ug／L，添加浓度为10、20和50 ug／L时，3种物质的回收率为71．9％～85．3％，批内变异系数≤10％，批问变异系数≤7％。
利用该方法对黄海沿岸部分养殖场及近岸海水(北起36。
40．303 7 N，1210 8．939’E；南至35。
39．36’N，119。
52．433’E)进行分析，诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星的检出质量浓度分别为6．20～982、55．2和11．6～55．4 ug／L。
实验结果表明，该方法灵敏度高，重现性好，适用于养殖海水中诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星的检测。
关键词喹诺酮类抗生素高效液相色谱固相萃取海水喹诺酮类(Quinolones，QNs)抗生素是一族人工合成的新型杀菌性抗菌药物，具有抗菌谱广、抗菌活性强、与其他抗菌药物无交叉耐药性以及毒副作用小的特点，主要用于水生动物弧菌病、链球菌病、水霉病和寄生性疾病的防治，其中诺氟沙星(Norfloxacin，NF)、环丙沙星(Ciprofloxacin，CIP)和恩诺沙星(Enrofloxacin，EN)等被广泛应用于水产养殖中。
目前，我国针对这类抗生素的研究主要集中于水产品中检测技术和代谢动力学的研究(方星星等2004；钱云云等2007；曲晓荣等2007；王洪艳等2007；何平等2008；李娜等2009)。
近年来我国水产养殖业发展迅速，产量和规模不断增加，但由于环境恶化和养殖模式的改变，水生动物疾病频发。
为了预防和治疗水生动物疾病，抗生素被广泛应用在水产养殖中。
但研究表明，所使用的抗生素仅20％"-30％被鱼类吸收，大部分进入环境中(Samuelsen 1989)，而这部分抗生素再次进入食物链，可能导致养殖环境中病菌耐药性的产生，导致二次污染(Hamscher et a1． 2002)。
超高效液相色谱法测定水产品中3种喹诺酮类药物残留量
超高效液相色谱法测定水产品中3种喹诺酮类药物残留量金高娃;蔡友琼;于慧娟;惠芸华;徐捷【期刊名称】《理化检验-化学分册》【年(卷),期】2012(048)001【摘要】提出了应用超高效液相色谱法测定水产品中诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星等3种喹诺酮类药物残留量的方法。
样品采用酸化乙腈提取,减压蒸干后用流动相溶解,经正己烷脱脂。
以ACQUITY UPLCTMBEH C18色谱柱为分离柱,以乙腈与甲酸（0.1＋99.9）溶液按体积比10比90混合作为流动相,在激发波长280nm、发射波长450nm的条件下进行荧光光度检测。
3种药物的线性范围均为1.25～500μg.L-1,检出限（3S/N）均为0.1μg.kg-1,测定下限（10S/N）均为0.3μg.kg-1。
以鲳鱼、对虾、河蟹等空白样品为基体做加标回收试验,测得回收率均大于80%。
【总页数】4页(P43-45,48)【作者】金高娃;蔡友琼;于慧娟;惠芸华;徐捷【作者单位】中国水产科学研究院东海水产研究所农业部水产品质量监督检验测试中心（上海）,上海200090／中国科学院大连化学物理研究所,大连116023;中国水产科学研究院东海水产研究所农业部水产品质量监督检验测试中心（上海）,上海200090;中国水产科学研究院东海水产研究所农业部水产品质量监督检验测试中心（上海）,上海200090;中国水产科学研究院东海水产研究所农业部水产品质量监督检验测试中心（上海）,上海200090;中国水产科学研究院东海水产研究所农业部水产品质量监督检验测试中心（上海）,上海200090【正文语种】中文【中图分类】O657.7【相关文献】1.液相色谱-串联质谱法测定水产品中磺胺类及喹诺酮类药物残留量 [J], 李婵君;李柱梅;秦喜玲;董素静;王彦超2.超高效液相色谱-串联质谱内标法快速测定水产品中9种氟喹诺酮类药物残留量[J], 周伟光;伍换;莫喜荣;林宗常;黎天勇3.液质联用法测定水产品中喹诺酮类药物残留量的不确定度评定 [J], 魏博娟;吴成业;钱卓真4.液质联用法测定水产品中喹诺酮类药物残留量的不确定度评定 [J], 魏博娟;吴成业;钱卓真5.高效液相色谱-串联质谱法测定水产品中19种喹诺酮类药物残留量 [J], 钱卓真;朱世超;魏博娟;汤水粉;罗方方;吴成业因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
高效液相色谱法测定水产品中诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星的方法优化
高效液相色谱法测定水产品中诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星的方法优化作者：王嘉权，刘成文来源：《现代食品》 2018年第22期摘要：本文采用高效液相色谱法测定水产品中诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星的残留量。
以农业部738号公告-2-2006 检测方法为基础，优化前处理步骤，称5 g 样品，用酸化乙腈提取，正己烷去油，过自制无水硫酸钠柱，提取液50 ℃旋转蒸发至干。
用2 mL 流动相充分溶解定容，移至离心管，10 000 r·min-1 离心5 min，过0.45 μm 滤膜上机测定。
结果表明，诺氟沙星标准曲线的相关系数r=0.999 9，环丙沙星的r=0.999 9，恩诺沙星的r=0.999 8；诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星的回收率在73.0% ～ 87.3%，精密度在4.93% ～7.59%。
试验结果符合标准和体系文件要求。
关键词：水产品；诺氟沙星；环丙沙星；恩诺沙星；高效液相色谱法诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星同属于喹诺酮类抗生素，是一类人畜通用的药物。
其因具有抗菌谱广、抗菌活性强、与其他抗菌药物无交叉耐药性和毒副作用小等特点，被广泛应用于畜牧、水产等养殖业中，包括在鸡、鸭、鹅、猪、牛、羊、鱼、虾和蟹等的养殖中用于疾病防治。
喹诺酮类抗生素具有抗菌谱广、杀菌力强、作用迅速、体内分布广泛及与其他抗生素之间无交叉耐药性等特点，预防和治疗畜禽的细菌性感染及支原体病有良好的效果[1-2]。
该类药物的不良反应主要有：①胃肠道反应。
恶心、呕吐、不适、疼痛等。
②中枢反应。
头痛、头晕、睡眠不良等，并可致精神症状。
③该类药物可抑制γ- 氨基丁酸（GABA）的作用，因此可诱发癫痫，有癫痫病史者慎用。
④影响软骨发育，孕妇、未成年儿童应慎用。
⑤可产生结晶尿，尤其在碱性尿中更易发生。
⑥大剂量或长期应用本类药物易致肝损害。
目前，诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星常用的液相色谱检测方法有农业部783 号公告-2-2006，但该方法的前处理过程繁琐，加标回收率低。
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592018-16本试验改进了农业部783号公告-2-2006水产品中诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星残留量的高效液相色谱法，并对样品的提取条件和色谱方法进行了优化分析，确定使用盐酸酸化乙腈提取，固相萃取小柱净化，高效液相色谱-荧光检测器检测、外标法定量的分析方法。
本方法漂移率小，对三种喹诺酮类药物标准曲线回归系数在0.999以上，线性范围1~1000μg/L，定量限1μg/kg。
对草鱼、对虾样品进行三种喹诺酮类药物加标回收率的验证实验，回收率在79.2%~105.0%之间，相对标准偏差在0.83%~9.85%之间，批次间标准偏差在5.00%~10.57%之间，说明方法前处理提取效率和准确度满足分析要求。
1.材料与方法1.1 仪器、试剂、标准品与耗材试验材料来自历次农业部例行采集样品，品种有草鱼和对虾。
岛津LC-20AD高效液相色谱仪（配荧光检测器RF-20A），LC Solution工作站与Waters e2695高效液相色谱仪（配荧光检测器2475），Empower 3工作站；色谱柱为Thermo Acclaim C18与安捷伦ZORBAX SB-C18，规格均为4.6mm ×250mm，I.D.5μm。
三种沙星标准品均为Dr.Ehrenstorfer。
其中诺氟沙星纯度为99.1%，环丙沙星纯度为95.0%，恩诺沙星纯度为99.0%。
分别称取诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星标准品各0.01g （精确至0.0001g），用色谱纯级甲醇溶解，必要的时候使用超声助融，定容到100mL棕色容量瓶中，4℃冷藏保存，有效期6个月。
试验使用试剂及其他仪器规格如下（表1-表3）：1.2 实验前处理的优化1.2.1 样品的处理方法取鱼、虾肌肉，切成小块，匀浆机打成匀浆后准确称取5.00g （±0.05g）样品，置于50mL离心管中，加入15mL提取剂，盖紧盖两个池塘基本条件相似，饲料和增氧条件不同，虽然池塘1的单产量少于池塘2，但是，由于消费者更喜爱优质水产品，池塘1的鱼产品价格明显高于池塘2，结果是池塘1的单产利润是池塘2的1.425倍，饲料系数是0.67倍，差别极为明显。
另外，池塘1投资少、资源消耗少，污染少、充分利用废弃物变废为宝，更具有明显优势。
利用本地牛粪养殖蚯蚓生产中的废弃蚯蚓，如果按量计值显示池塘1饲料投入高于池塘2，不计值则池塘1的总投入只有1940元，远低于池塘2的13200元。
池塘2养殖污染是其扩大生产的主要限制条件之一，而虽然养殖池塘1的效果明显好于池塘2，但由于蚯蚓生产规模受限，喂食鱼类的洗涤废弃蚯蚓量同样限制了池塘1养殖模式的扩大。
两种模式各有所长，可以科学计划，因地制宜，提高养殖收益。
（通联：053000，河北衡水学院生命科学学院 国有资产管理中心）高效液相色谱法检测水产品中三种喹诺酮类药物残留量方法研究童文羽 朱志强 曾 智602018-16子，置于振荡器上振荡5min，4500r/min离心5min，上清液倒入另外一支50mL离心管中。
1.2.2 提取液的选择和优化根据农业部783、1077号公告，选择酸化乙腈作为提取剂，因为喹诺酮类都是两性化合物，提取时在提取剂中加入酸会提高提取效率。
分组使用100%乙腈、1%甲酸酸化和每2500mL提取剂加入20mL50%盐酸进行酸化的乙腈作为提取剂，每次提取用量15mL。
从表4可以看到，由于这三种喹诺酮类药物都是两性化合物，酸化的提取剂可以大大提高提取回收率，而提取实验也证明了这一点。
其中盐酸酸化的乙腈作为提取剂的回收率最高，原因是盐酸的酸性较甲酸强。
同时，提取3次比2次显著提高回收率。
对提取次数进行进一步优化结果如表5，提取4次后，诺氟沙星回收率有提高，但环丙沙星和恩诺沙星的回收率并没有显著提高，因此采用盐酸酸化的乙腈作为提取剂，提取3次即可。
1.2.3 样品的净化方法的优化提取液及提取操作诺氟沙星环丙沙星恩诺沙星100%乙腈提取2次62.4%76.0%53.6%提取3次76.0%77.6%80.1%1%甲酸提取2次75.2%80.8%77.5%提取3次89.2%84.7%97.1%盐酸酸化提取2次77.6%85.3%80.4%提取3次83.6%90.4%88.7%表4 甲酸酸化和盐酸酸化的乙腈提取的回收率提取液及提取操作诺氟沙星环丙沙星恩诺沙星盐酸酸化乙腈提取3次83.9%88.6%92.5%提取4次95.2%84.8%97.1%表5 提取次数的回收率名称纯度生产商乙酸乙酯分析纯国药集团无水硫酸钠分析纯天津博迪正己烷分析纯天津博迪甲醇色谱纯默克甲醇分析纯国药集团乙腈分析纯国药集团乙腈色谱纯默克四丁基溴化铵分析纯国药集团三乙胺分析纯天津博迪磷酸分析纯国药集团磷酸二氢钾分析纯国药集团氢氧化钠分析纯国药集团表1 试验使用的各试剂品牌个规格小柱类型品牌规格C18Waters Sep-Pak 3mL(500mg)HLB Waters Oasis 3mL(60mg）MCXWaters Oasis3mL(60mg)表2 固相萃取小柱品牌、规格 名称型号规格厂家十万分之一天平XPE205METTLER TOLEDO 旋转蒸发仪RE52CS 上海亚荣pH计FE20METTLER TOLEDO 离心机LXJ-IIB上海飞鸽表3 其他仪器规格型号612018-16喹诺酮类因为是两性化合物，所以在正己烷中的溶解度很差。
因此正己烷在喹诺酮类的前处理过程中常用作去杂试剂。
旋转减压蒸馏或氮吹干提取液后，用2.0mL磷酸二氢钾-甲醇溶液溶解残渣（34.0g磷酸二氢钾溶于230mL水，用25%氢氧化钠调pH至7.0，用该溶液将20mL甲醇稀释至100mL），在提取液中加入2mL正己烷，涡旋，静置后去掉上层的正己烷，正己烷净化操作需要进行2次，如果样品基质特别复杂，净化次数可酌情增加。
根据唐巍、卢艳芬等人报道，水产品中喹诺酮类残留量测定前处理中可使用Waters Oasis HLB固相萃取小柱净化，农业部1025号公告则使用C18小柱，因此将包括这两种小柱在内的一共3种固相萃取小柱以及不使用固相萃取净化分组做对比实验。
所有的萃取小柱在使用前均使用3.0mL甲醇和3.0mL水激活萃取柱，C18、HLB、MCX、PRS小柱激活后加入备用样品过柱，6.0mL纯水淋洗去杂，用6mL的6%氨化甲醇（6mL氨水用甲醇稀释至100mL）洗脱，收集洗脱液，于45℃氮吹至干，1.0mL 流动相溶解残渣，经滤膜过滤，供液相色谱分析使用；小柱种类项目回收率（%）备注C18诺氟沙星63.0杂质较少，干扰较少，但回收率较低环丙沙星56.6恩诺沙星68.8HLB诺氟沙星73.7杂质较少，干扰较少，回收率较高环丙沙星74.9恩诺沙星79.9MCX诺氟沙星89.2杂质较少，干扰较少，回收率是所有使用固相萃取小柱中最高的环丙沙星93.4恩诺沙星91.7不使用固相萃取小柱诺氟沙星93.7杂质较多，干扰较多，但回收率比使用固相萃取小柱要高环丙沙星87.3恩诺沙星99.0表6 3种固相萃取小柱以及不使用小柱的加标回收率名称线性范围（μg/L）线性回归方程相关系数R 2仪器检出限（μg/L）定量限（μg/Kg）诺氟沙星1-1000Y=5.4846×10-5+7.20150.99920.20 1.0环丙沙星1-1000Y=6.7914×10-5+5.65070.99960.30 1.0恩诺沙星1-1000Y=3.7561×10-5+2.69430.99930.451.0表7 方法的线性范围、线性回归方程、相关系数和检测限622018-16不使用固相萃取小柱净化的对照组，在第一次氮吹后直接使用1mL流动相溶解残渣,定容后过滤供液相测定使用。
根据表6的统计，不使用萃取小柱回收率是很高的，缺点是色谱图上的杂质依然较多，而使用固相萃取小柱后，尽管回收率都出现了不同程度的降低，但从仪器图谱上来看，使用固相萃取小柱可以显著的减少杂质峰，减少干扰。
因此使用萃取小柱是有意义的。
1.3 色谱条件农业部783号公告中使用的是乙腈∶四丁基溴化铵-磷酸（pH3.1）=95∶5作为流动相，在实际实验过程中发现以下几个问题：由于喹诺酮类属于两性分子，传统的色谱柱常常会因为残余硅醇基和金属不纯物的存在而导致色谱峰拖尾。
在农业部783号公告的方法中，在流动相中加入四丁基溴化铵试剂（3.22g四丁基溴化铵溶于1000mL水中，磷酸调pH值为3.1），作为离子对试剂降低其极性，从而改善峰形和提高分离度。
但喹诺酮类样品在色谱柱保留时间对ｐＨ 值很敏感，而离子对试剂本身无法起到有效的缓冲作用，可能造成目标物质保留时间的漂移，如图1。
可以看到乙腈-四丁基溴化铵流动相虽然峰型和分离度较好，但出现了在保留时间有漂移。
同时流动相中的四丁基溴化铵很容易产生气泡，即便长时间超声脱气也很难改善，因此参考农业部1025号公告，使用乙腈-磷酸三乙胺（3.4mL浓磷酸溶于1000mL水中，三乙胺调pH值为2.4）作为流动相。
其中乙腈：磷酸-三乙胺缓冲液体积比为18∶82，流速1.0mL/min；使用荧光检测器，激发波长280nm，发射波长450nm；柱温35℃；进样量20μL。
该色谱条件下的标准品叠加如图2，可以看到目标峰的漂移相比乙腈-四丁基溴化铵作为流动相时改善了很多，而且出峰较快，节省了图1 流动相为乙腈：四丁基溴化铵-磷酸缓冲液体积比5∶95的标准品重叠图*环丙沙星的浓度为5μg/L、10μg/L、20μg/L、50μg/L、100μg/L，诺氟沙星与恩诺沙星的浓度为25μg/L、50μg/L、100μg/L、250μg/L、500μg/L。
632018-16时间和流动相。
2.结果与讨论2.1 色谱分离在优化出的色谱条件下，分析得到标准溶液、空白和加标样品的色谱图，见图4。
可以看到，在所使用的色谱条件下，目标峰得到了很好的分离。
2.2 检出限和定量限 取三种喹诺酮类标准储备液，用流动相稀释成标准工作液，在优化出的色谱条件下进样，以各组分质量浓度与色谱峰面积进行线性回归，绘制工作曲线，得到回归方程如表7。
因为实际工作中样品的基质较为复杂，因此，为减少杂峰干扰，故选用了10倍信噪比（S/N）计算仪器检出限，诺氟沙图2 流动相为乙腈∶磷酸-三乙胺缓冲液=18∶82的标准品重叠图图3 3种喹诺酮类标准品色谱图（三种沙星均为5μg/L）*三种沙星浓度均为5μg/L、10μg/L、20μg/L、50μg/L、100μg/L1 检测器A通道1/280nm-450nm检测器A通道1恩诺沙星诺氟沙星环丙沙星642018-16星、恩诺沙星、环丙沙星的仪器检出限为0.20μg/L、0.30μg/L、0.45μg/L。