Proximity Ligation Assay (PLA)简介
蛋白检测新标准
Human Molecular Genetics, 2009, 18(15):2802.
Faseb Journal, 2009, 23(5):1490-1502.
微量细胞中蛋白微弱相互作用---蛋白相互作用原位可视化检测
背景：DYX1C1是阅读障碍疾病的易感基因，其功能可能与神经元 迁移有关，敲除DYX1C1会使神经元迁移障碍，其在阅读功能障碍 信号通路里与谁相互作用未知。已知DYX1C1与CHIP相互作用， 参与雌激素受体的降解，雌激素参与调控人类认知。 DYX1C1会不会也与雌激素调控相关？
Massinen et al. Hum Mol Genet. 18(15):2802–2812 (2009) Leuchowius, et al., Cytometry A. 75, 833–839 (2009). L Boussemart et al., Nature，513:105-109 (2014).
意义：鉴定VE-PTP在血管生成中具有重要的功能，通 过VEGF的刺激，调节 VEGFR2 活性.
➢ PLA技术原理，不同种属一抗与VEGFR2或VE-PTP细胞内成分结合. Cy3探针标记寡核苷酸偶联 二抗进行滚环扩增。
➢ VEGF刺激前后不同时间，原位检测内皮细胞中VE-PTP与VEGFR2复合物互作(红点)
结果无说服力，补充实验数据？
Duolink® PLA® 技术 –
可视化原位定量检测细胞生理水平的蛋白互作和修饰
dna和蛋白互作的研究方法
dna和蛋白互作的研究方法DNA和蛋白质是生物体内最重要的分子之一，它们的相互作用在细胞的正常功能和疾病发生中起着重要作用。
为了深入理解它们之间的相互作用机制，科学家们开展了各种研究方法。
本篇文章将介绍几种常用的DNA和蛋白质互作研究方法。
1. 免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation）免疫共沉淀是一种用于检测蛋白质-蛋白质和蛋白质-DNA相互作用的方法。
该方法基于抗体的特异性识别能力，将目标蛋白质结合在免疫球蛋白上，然后通过洗涤步骤来去除未结合的蛋白质。
最后，通过对共沉淀复合物进行Western blot或质谱分析来确定与目标蛋白质相互作用的其他蛋白质或DNA。
2. 酵母双杂交实验（Yeast Two-Hybrid）酵母双杂交实验是一种常用的研究蛋白质相互作用的方法。
该方法利用酵母细胞质外部分和细胞核内部分蛋白质相互作用的特性。
通过构建适当的融合蛋白，例如，将目标蛋白质与激活因子结合，将库蛋白质与DNA结合，形成功能性的转录激活复合物，从而检测蛋白质相互作用。
3. 荧光共聚焦显微镜（Fluorescence confocal microscopy）荧光共聚焦显微镜是一种用于研究DNA和蛋白质互作的分子显微镜技术。
该技术基于荧光标记的DNA或蛋白质，能够直接观察其在细胞内的相互作用。
通过激发特定的荧光标记来可视化相互作用的位置和动力学。
此外，使用荧光共聚焦显微镜还可以研究DNA和蛋白质在细胞周期、发育和转录调控等过程中的互作。
4. 原位免疫共沉淀（In Situ Proximity Ligation Assay）原位免疫共沉淀是一种用于检测细胞内DNA和蛋白质之间相互作用的方法。
该方法主要通过荧光和免疫组织化学方法来标记和检测位于亲近的蛋白质和DNA的抗体-抗原复合物。
这种方法具有高度的特异性和灵敏性，可以在单个细胞水平上研究DNA和蛋白质之间的互作。
5. 电子显微镜（Electron microscopy）电子显微镜是一种高分辨率显微镜技术，可用于研究DNA和蛋白质的互作。
研究蛋白质相互作用的九种方法，写标书用得上
研究蛋白质相互作用的九种方法，写标书用得上寒风凛冽，又到了一年一度写标书的季节，你开始准备了么？在分子机制的研究中，蛋白和蛋白之间的互作研究可以说是非常经典了，研究蛋白互作的方法有很多，今天我们来介绍九种。
1、免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CoIP）CoIP其实就是两个蛋白相互的IP（免疫沉淀反应）实验，在已知蛋白B和C之间有相互作用的前提下，这种前提一般需要有一个酵母双杂实验或者Pulldown实验来作为支持。
IP就是用来验证蛋白C和蛋白B之间相互作用的。
如果在Agarose珠上的Protean A/G所结合的抗体，可以结合并拉下蛋白B，那用Western Blot即可检测出蛋白C的表达，反之亦然，通过这种相互间免疫共沉淀的实验，就可以明确地验证出，B与C之间的相互作用了。
比如这份标书：PYK2促进肝癌细胞迁移的一个新的分子机制研究：结合并磷酸化E-cadherin？（百度检索题目可查到全文）2、Pull-down实验这个实验跟免疫共沉淀实验很像，不同的是免疫共沉淀是在细胞里进行的，在众多的蛋白里，拉住A蛋白的同时,把B蛋白也给拉出来了，这还不能证明是直接的结合，很有可能是A 拉住了C，而C拉住了B，这样拉住A蛋白的同时也能把B蛋白也给拉出来。
要证明直接的结合就是Pull-down实验。
提纯所要研究的两个蛋白（一般是在BL21等菌种表达提纯），这两个蛋白带上不同的标签（提纯蛋白一般带GST或者HIIS标签），然后将他们放在同一个体系里，使用GST-beads或者NI-beads,把其中一个蛋白拉下来，用WB检测另一个蛋白的存在。
比如这份标书：恶性肿瘤的发生、发展的细胞表观遗传学机制。
（同样可以百度检索到全文）3、免疫荧光（Immunofluorescence，IF）——共定位将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。
由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，从而可对抗原进行细胞定位。
基于PCR信号放大的微量蛋白检测技术-邻位连接延伸分析
PLA国内外研究现状
国外：Olink公司在PLA方面做了较多基础研究，并对PLA技术申请了专利。 相关产品：Dolink®（13000RMB）该技术平台于2015年12月被sigma-Aldrich 公司收购，目前该产品正是该公司网站上的主推产品。
国内：目前处于实验室研究阶段，无相关产品 从2010年到2014年邻位连接技术的文献引用次数从41次到156次，到2015年关 于PLA技术的报道为55篇。
PLA技术检测蛋白的核心
邻位探针：不同的DNA单链与一对蛋白识别分子相结合形成，使其通过免
疫吸附的方式结合到待测蛋白上。 为什么说PLA的核心是一对邻位探针？ 1.DNA与蛋白结合效率低。 2.通过筛选（指数富集配体系统进化技术SELEX）技术，难以得到与蛋白 分子高特异性、高亲和力的核酸适体。 3.核酸适体的种类有限，难以满足PLA实验要求。 以上三个原因，限制了PLA的发展应用
PLA的应用举例
2.检测蛋白的翻译后修饰 传统分析方法需要：凝胶电泳、质谱、高效液相色谱法和免疫组 化结合。
Fig. 2 EGF（表皮细胞生长因子）刺激前后，用免疫荧光染色和PLA方法检 测U343细胞中EGFR磷酸化水平的变化。PLA方法可以检测到EGFR的激活， 而IF方法则不能。红色：磷酸化的EGFR蛋白；蓝色：细胞核
4.数字化定量
在定量过程中，可以对细胞和组织的图像进行分析。通过细胞核的 自动检测，以及细胞质大小的估算，研究者能够对组织或细胞群中的 蛋白质表达水平进行单细胞统计学分析。
Stadler, Charlotte, et al. (2012) Immunofluorescence and fluorescent-protein tagging show high correlation for protein localization in mammalian cells. Nature. doi:10.1038/nmeth.2377
蛋白检测方法验证
蛋白检测方法验证Protein detection is a crucial step in many research and diagnostic procedures. It plays a vital role in understanding various biological processes, disease mechanisms, and drug development. There are several methods available for detecting proteins, each with its own advantages and limitations.蛋白检测在许多研究和诊断程序中是一个至关重要的步骤。
它在理解各种生物过程、疾病机制和药物开发中扮演着至关重要的角色。
有几种方法可用于检测蛋白质，每种方法都有其自身的优点和局限性。
One commonly used method for protein detection is the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). This technique relies on the specific binding of an antibody to the protein of interest, followed by the detection of an enzyme that produces a measurable signal. ELISA is highly sensitive and can detect proteins at very low concentrations, making it a popular choice for many researchers.一种常用于蛋白检测的方法是酶联免疫吸附实验（ELISA）。
这种技术依赖于抗体与感兴趣蛋白的特异性结合，然后检测产生可测量信号的酶。
tbk-1翻译
TBK-1 associates with Rab8b and colocalizes with Rab8b on autophagic organelles自噬细胞器中的TBK-1因子与Rab8b因子共存且相互关联。
We next turned to the mechanisms of how TBK-1 affects autophagy.接下来我们转而研究TBK-1影响细胞自噬的机制。
If Rab8b and TBK-1 cooperate in the control of the autophagic pathway, we reasoned that they might associate.如果Rab8b和TBK-1共同作用于自噬途径的控制，我们推测，他们可能是相关联的。
This was examined first in co-immunoprecipitation experiments with GFP-Rab8b (Fig. 3A).这是GFP-Rab8b在第一次免疫共沉淀实验的检查结果（图3A）。
The interaction between Rab8b and TBK-1 was tested further using an independent method,termed proximity ligation in situ assay (P-LISA), designed to detect endogenous protein-protein interactions in whole cells (Soderberg et al., 2006).我们进一步用一个独立的方法测试Rab8b和TBK-1之间的相互作用，该方法被称为邻位连接测定法（P-LISA），其设计用于检测整个细胞中内源性蛋白质- 蛋白质之间的相互作用（Soderberg et al，2006）。
(2021年整理)Epigeneticsglossary表观遗传名词解释
Epigeneticsglossary表观遗传名词解释
编辑整理：
尊敬的读者朋友们：
这里是精品文档编辑中心，本文档内容是由我和我的同事精心编辑整理后发布的，发布之前我们对文中内容进行仔细校对，但是难免会有疏漏的地方，但是任然希望（Epigeneticsglossary表观遗传名词解释）的内容能够给您的工作和学习带来便利。
同时也真诚的希望收到您的建议和反馈，这将是我们进步的源泉，前进的动力。
本文可编辑可修改，如果觉得对您有帮助请收藏以便随时查阅，最后祝您生活愉快业绩进步，以下为Epigeneticsglossary表观遗传名词解释的全部内容。
Epigenetics glossary
Discover our epigenetics glossary with definitions covering the。
duolink pla荧光实验方案
duolink pla荧光实验方案Duolink PLA (Proximity Ligation Assay)是一种用于检测蛋白质互作的荧光实验技术。
该技术使用特定的荧光标记探针来检测两个靠近的蛋白质分子之间的相互作用。
实验步骤如下：1. 细胞处理：首先，处理您要研究的细胞。
您可以使用适用于您研究的细胞类型的特定处理方法。
这可能包括对细胞进行激活、转染或处理以诱导互作事件。
2. 固定和渗透化细胞：使用适当的固定和渗透化方法来固定和渗透化细胞。
这将确保适当的抗体和探针渗透到细胞内部。
3. 选择并添加第一抗体：根据您研究的蛋白质，选择适当的第一抗体，并将其添加到细胞中。
第一抗体将与其中一个蛋白质结合。
4. 添加PLA探针：准备好PLA探针，在适当的条件下将其添加到细胞中。
PLA探针包含两个适当的DNA连接片段以及与您选择的第一抗体结合的识别序列。
5. 配对接连连接：添加嵌合连接剂，使与第一抗体和PLA探针结合的靠近细胞蛋白质分子之间的DNA连接。
6. 添加PCR引物：在适当的条件下，添加PLA反应所需的PCR引物。
这些引物将与连接的DNA片段结合并引起PCR扩增。
7. 扩增PCR产物：进行PCR反应来扩增PCR引物和连接的DNA片段。
这将产生足够的扩增产物供进一步分析。
8. 检测荧光信号：使用适当的荧光探针检测PCR产物中的荧光信号。
荧光信号将在靠近的蛋白质分子之间发生互作时被检测到。
9. 分析和解释结果：根据荧光信号的强度和位置来分析和解释结果。
强荧光信号表示互作事件的发生，而弱或无信号表示蛋白质之间没有互作。
请注意，为了确保实验结果的准确性，可能需要进行一些控制实验和优化步骤。
此外，具体实验条件可能因研究的具体蛋白质而异，因此建议参考相关文献和技术手册以获取更详细的信息。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
Proximity Ligation Assay (PLA)简介
1, 什么是PLA技术?
PLA技术全称为Proximity Ligation Assay，国内翻译为邻位连接或者邻近连接技术。
PLA技术是一种特殊的免疫分析方法，可用于检测目标蛋白，蛋白相互作用等等。
该方法通过一对标记有一段寡聚脱氧核苷酸(单链DNA)的单克隆或者多克隆抗体（）的探针，即PLA probe（PLA探针），识别目的蛋白，当这两个探针识别同一个蛋白时，两个探针之间的距离靠近，产生了所谓的邻近效应（proximity）。
此时，通过加入一段分别与连接在抗体上的DNA互补的连接寡聚脱氧核苷酸（connector oligonucleotides），PLA probe上的DNA就会通过配对互补作用，与该段DNA互补，然后在连接酶的作用下，PLA probe 上的连段DNA被连接在一起形成一条新的DNA片段。
通过荧光PCR可以扩增并对该新的DNA片段进行定量，从而对应的定量目标蛋白。
2. PLA的几种形式
1）Solution phase PLA （液相PLA）这是PLA最初应用的形式。
Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays，Nature Biotechnology 20, 473 - 477 (2002)
2）Solid phase PLA （固相PLA）在液相PLA的基础上引入了一个捕获抗体，该捕获抗体被固定在固相载体上（磁珠、微孔板等），当目标蛋白被捕获后，通过Proximity Probe 进行识别和定量。
Detection of Individual Microbial Pathogens by Proximity Ligation，Clinical Chemistry 52: 1152-1160, 2006
3. PLA的应用
1）蛋白检测
参考文献同上
2）蛋白质相互作用（如In situ PLA）
Söderberg O, Gullberg M, Jarvius M, Ridderstråle K, Leuchowius KJ, Jarvius J, Wester K, Hydbring P, Bahram F, Larsson LG, Landegren U. Direct observation in situ of individual endogenous protein complexes. Nature Methods 3: 995-1000 (2006)
公司：瑞典的Olink Bioscience为PLA技术专利持有人，该公司生产了大量基于PLA技术的产品。
该公司网址：。