植物组织培养-外植体的选择与建立
外植体选择的原则
外植体选择的原则外植体选取的原则是什么?1、选择优良的种质无论是离体培养繁殖种苗，还是进行生物技术研究，培养材料的选择都要从主要的植物入手，选取性状优良的种质或特殊的基因型。
对材料的选择要有明确的目的，具有一定的代表性，以提高成功的几率，增加其实用价值。
2、选择健壮的植株选取发育正常的器官或组织，再生能力强，组培易成功。
组织培养用的材料，最好是从生长健壮的无病虫的植株上选取发育正常的器官或组织。
因为这些器官或组织代谢旺盛，再生能力强，培养后比较容易成功。
此现象可能是由于外植体内部的植物激素水平能够在接种后得以维持所致。
3、选择适宜的部位植物组织培养几乎在植物体的各个部位都获得了成功，这些部位包括茎尖、茎段、皮层及维管组织、髓细胞、表皮、块茎的储藏薄壁细胞、花瓣、根、茎、子叶、鳞茎、胚珠和花药等。
但是不同种类的植物以及同一植物的不同器官对诱导条件反应是不一致的，有的部位诱导分化率高，有的部位很难脱分化，或者再分化频率很低。
4、选择适当的时期组织培养选择材料时，要注意植物的生长季节和生长发育阶段，对大多数植物而言，应在其开始生长或生长旺季采样，此时材料内源激素含量高，容易分化，不仅成活率高，而且生长速度快，增殖率高。
若在生长末期或已进入休眠期时采样，则外植体可能对诱导反应迟钝或无反应。
花药培养应在花粉发育到单核靠边期取材，这时比较容易形成愈伤组织。
百合在春夏季采集的鳞茎、片，在不加生长素的培养基中，可自由地生长、分化；而其他季节则不能。
叶子花的腋芽培养，如果在1～2月采集，则腋芽萌发非常迟缓；而在3～8月采集，萌发的数目多，萌发速度快。
对于大多数植物而言，应在其生长季节开始时采样。
在生长末期或已进入休眠期时取样，外植体可能对诱导反应迟钝或无反应，较难成活。
5、考虑器官的生理状态和发育年龄一般认为，生理年龄小的幼嫩组织较生理年龄大的成熟衰老组织具有较高的形态发生能力。
随着组织年龄的增加，器官的再生能力逐渐减弱甚至完全失去再生能力。
植物组织培养技术第四章：植物离体培养体系2
修剪外植体
接种
盖好瓶塞
外植体的灭菌处理
• 外植体灭菌流程 • 常用灭菌剂 • 灭菌关键性问题
– 适当的搭配 – 适当的浓度 – 适当的时间
外植体灭菌流程
材料的预处理 (剪切、清洗)
75%酒精 (20 s)
0.1%升汞 (15 min)
无菌水冲洗 （6次）
沥干
接种
外植体的预处理
对外植体进行修整,去掉不要的部分,在 流水下冲洗干净.
化的方法与技能。
一、外植体的种类与选择
1、外植体的种类
– 外植体是指植物离体培养中的各种接种材料。 包括植物体的各个器官、组织、细胞和原生质 体等。因此，可以作为培养对象的所有植物器 官、组织、细胞、原生质体等均是可选择的对 象。
常见外植体类型
• 茎尖（园艺植物组织培养中应用最多，繁殖率高， 不易发生遗传变异，但取材有限）
消毒注意事项
1、表面消毒剂对植物组织是有害的，应正确选择消毒 剂的浓度和处理时间，以减少组织的死亡。
2、在表面消毒后，必须用无菌水漂洗材料3次以上以 除去残留杀菌剂，但若用酒精消毒，则不必漂洗。
3、与消毒剂接触过的切面在转移到无菌基质前需将其 切除，因为消毒剂会阻碍植物细胞对基质中营养物质 的吸收。
第二节： 无菌外植体的选择与处理
本节主要内容
• 外植体的种类与选择 • 外植体的消毒 • 外植体的接种 • 外植体的初代培养与观察
–培养条件 –外植体的污染及其防治 –外植体的褐化及其防治 • 外植体的继代培养 –培养物的分化诱导培养：愈伤组织的诱导与分化；不
定芽的诱导与分化。 – 试管苗的增殖与生根诱导培养 – 试管苗的玻璃化与防治
4、若外植体污染严重则应先用流水漂洗1小时以上或 先种子培养得到无菌种苗，然后用其各个部分建立组 织培养。
组培苗生产技术—外植体的选择、处理与接种(植物组织培养课件)
3、蔬菜（龙牙百合） 龙牙百合特征:鳞茎，无皮，广卵形，外部鳞片长,将整个鳞茎 包裹，直径5~15厘米，白色，茎高90厘米左右，直立茎上叶 多而散生，披针形，叶色从浓绿，光滑。花单生茎顶。花朵 呈喇叭状长筒形，白色，有清香。
不能损伤组织材料，保持外植体的生活力，使外 植体在良好的培养条件下很快恢复生机，正常 生长和繁殖.
• 消毒剂的要求 • 要求：具有良好的消毒作用，既不会杀死植物的
组织细胞，又易被无菌水冲洗掉，不影响消毒后 外植体的生长和分化.
常用灭菌药剂的使用和效果
灭菌剂 使用浓度（%） 清除的难易 消毒时间 效 果
2、茎段（采用嫩茎的切段促进腋芽萌发，取材容易） 3、叶（幼嫩叶片组织通过愈伤组织或不定芽分化产生植株，
取材容易，操作方便，但易发生变异）； 4、花球和花蕾 5、种子、根、块根、块茎、花瓣等。
（二）实例分析 1、花卉（非洲菊） • 常用茎尖、嫩叶、花托进行非洲菊的组织培养，也有利用
种子进行组织培养的。 • 茎尖培养操作麻烦，但对于脱毒苗的生产是最有效的。 • 花托培养可直接成苗， 既可保持种性，又易行、 耗时短，是首选的外植体。
• 首先要选择花大、花色艳丽、市场流行的品种，然后再选 择无病虫害、植株生长健壮、花色纯正的优良品种单株进 行取材。
• 一旦选出优株后，应进行挂牌标记，并一直在其上采取花 蕾。作为外植体的花蕾要选取直径在1㎝左右，而且未露 心的小花蕾，太大或是太小的花蕾均不能获得满意的效果 。
2、水果（草莓）
（1）选择结果性优良的草莓母株上新抽出的匍匐茎作外植体，以每年6～7 月份最为适宜。
龙牙百合的许多器官、组织都可作为外植体， 如鳞片、花梗、叶片、茎尖、腋芽、花瓣、花托 、花丝、花药、胚、子房、根尖等，其中采用鳞 片作外植体的较多。
植物组织培养的完整过程
植物组织培养的完整过程1.选择适宜的母体植物：选择具有优良性状和抗病虫害能力的母体植物，从中选择健康的叶片、茎段等组织作为外植体。
2.外植体的准备：将母体植物采集的叶片或茎段进行无菌处理，去除表面杂菌和泥沙，然后用75%酒精或漂白粉消毒外表。
3.外植体的切割：将无菌环境下的外植体切割成小片，大小约为0.5-1cm，同时尽量保持外植体的干燥，以防止外植体内部水分过多。
4.外植体的接种：将切好的外植体小片接种在含有植物生长激素的无菌培养基上。
培养基通常由无机盐溶液、有机源、糖和植物生长激素等组成，植物生长激素的种类和浓度会影响到后续培养过程中的分化和增殖。
5.分化：外植体接种到培养基后，会经历分化阶段，外植体的组织逐渐增殖和分化为不同种类的细胞，形成生长点。
6.增殖：通过定期的次级培养，子培养、分生器、病毒消除等手段，将外植体中的细胞不断分化和增殖，以便大量生产幼苗。
7.再分化：经过增殖后的外植体，可以再次进行分化，形成茎尖、腋芽或花蕾等器官，以便进一步培养和繁殖。
8.根的诱导：在合适的培养条件下，外植体可以诱导生成根系，这是为了使外植体脱离体外培养环境，继续生长的必要步骤。
9.移栽：当幼苗的根系已经发达足够，可以将外植体移栽到含有适宜营养成分的固体培养基上或直接移植到土壤中，进行实地管理和生长。
10.过程控制：在整个培养过程中，要控制好环境条件，例如温度、湿度和光照等，以保证培养的成功率。
11.病毒清除：植物组织培养中经常伴随着病毒感染问题，可以通过不同的方法对外植体和培养基进行检测和清除，以保证获得健康的植株。
总的来说，植物组织培养是一个复杂的过程，需要严格的无菌操作和合适的培养条件。
它广泛应用于植物的繁殖、遗传改良、新品种选育以及病毒和细菌的清除工作中，对推动植物学研究和农业生产具有重要的意义。
简述外植体的采集与处理操作流程
简述外植体的采集与处理操作流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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植物组织培养实用技术
3、继代培养
1）分离小鳞茎培养 选择直径达到0.5cm大小的小鳞茎，用镊子将
其轻轻剥离，置于增殖培养基中。
把原来的鳞片重新转到新鲜的诱导培养基上继续诱导 小鳞茎，小鳞茎还会在其他的部位产生，整个生长周 期可以延续5~6个月。
小鳞茎继代培养30天左右可增殖1~2倍。开始是在 鳞茎基部产生小鳞茎，40天左右小鳞茎长大，形成丛鳞 茎。小鳞茎慢慢抽出新芽，然后形成小植株。此时可把 丛芽切割继续培养增殖。
消毒步骤 ①用洗涤灵水溶液洗去材料表面的油质 ②用70％的乙醇浸泡数秒以除去表面的蜡质
③用3％的次氯酸钠溶液 浸泡消毒15～30min，然 后用无菌水冲洗3次
三、外植体的原代培养
把芽放在解剖镜下，无菌条件下，用镊子、刀 片、解剖针等工具把芽外面的幼叶和叶原基除 去，使生长点暴露。用利刀切下含有1～2个叶 原基，大小为０.5mm的生长点。
4、增重培养
直径达到1cm以上即可进行生根培养，对于达不到此 标准的小鳞茎，接种到增重培养基中，在此种培养基 上，小鳞茎较少长叶而明显增重。
如果能采用液体振荡培养，则增重效果更佳。一般转 速设为110r/min。是否可以进行浅层液体静置培养， 尚需试验。
五、试管苗的生根与练苗
将丛生的试管芽切成单株，接种在1/2MS+IBA 0.5mg/L+活性炭0.5%生根培养基上，7天后芽 基部开始形成根尖。慢慢伸长成辐射状白色的小 根。20天后根长达7~10cm，基部稍膨大。温度 设置为25~28℃，光照强度为1500Lx．每天给 予10~12h光照。
40天左右发育成球状的可见鳞片的小鳞茎。
四、龙牙百合的继代培养
大田培植
鳞茎
原代培养 形回顾
原代培养 形成再生芽
植物组织培养 组培苗生产技术外植体的选择处理与接种护理课件
ห้องสมุดไป่ตู้湿度
保持培养环境湿度适宜， 以防止培养基干燥和外植 体失水。
培养过程中的观察与记录
定期观察外植体的生长状 况，包括颜色、质地、生 长速度等，并记录观察结 果。
观察外植体是否有异常表 现，如病变、死亡或生长 异常等，及时采取相应措 施。
记录外植体的生长曲线， 以便了解其生长动态和规 律。
培养过程中的问题处理
污染问题
如发现外植体受到微生物污染， 应及时采取措施，如更换培养基、
增加消毒频率等。
褐化问题
外植体褐化是常见的现象，可以通 过添加抗氧化剂、调整培养基成分 等方法减轻褐化程度。
玻璃化现象
玻璃化是指培养中的植物组织出现 半透明状的现象，可以通过降低激 素浓度、增加培养基湿度等方法进 行改善。
外植体的繁殖与移栽
生根过程
无根苗在生根培养基上生长，经过细胞分裂和分 化形成根原基，进而发育成完整的根系。
移栽前的准备
在生根培养过程中，需要对外植体进行适当的炼 苗处理，以适应外界环境，提高移栽成活率。
移栽与驯化
移栽是将培养好的组培苗从培养 容器中取出，移植到自然环境中 的过程。
移栽后的管理：保持适宜的光照、 温度、湿度和水分条件，及时除 草、防治病虫害，促进组培苗健 康生长。
外植体的接种
无菌操作技 术
操作前准备
在操作前，需要对外植体进行彻底清洗，去除表面的污垢 和微生物。同时，操作人员需要对手部进行消毒，确保无 菌操作。
灭菌处理 外植体需要进行严格的灭菌处理，以消除附着在表面上的 微生物。常用的灭菌方法包括使用酒精、次氯酸钠或氯化 汞等消毒剂。
接种环境
接种环境需要保持无菌状态，通常在超净工作台或无菌室 内进行。同时，接种工具也需要进行消毒处理，避免交叉 污染。
组培实验外植体选择处理及接种培养
2．温度 离体培养中对温度的调控要比光照显得更 为突出。不同的植物有不同的最适生长温度，大多 数植物最适温度在23C-32C之间。培养室一般所 用的温度是25C±2C。低于15C或高于35C，对 生长都是不利的。
3．湿度 组织培养中的湿度影响主要有两个方面，一是培 养容器内的湿度，它的湿度条件常可保证100%。二是培 养室的湿度，它的湿度变化随季节和天气而有很大变动 。湿度过高过低都是不利的，过低会造成培养基失水而 干枯，或渗透压升高，影响培养物的生长和分化；湿度 过高会造成杂菌滋长，导致大量污染。因此，要求室内 保持70%-80%的相对湿度。
3.选择最适的时期 组织培养选择材料时，要注意植物的生长季节和植物 的生长发育阶段。如快速繁殖时应在植株生长的最适时期 取材，这样不仅成活率高，而且生长速度快，增殖率高； 花药培养应在花粉发育到单核期时取材，这时比较容易形 成愈伤组织。
4.选取适宜的大小 建立无菌材料时，取材的大小根据不同植物材料而异 。材料太大易污染，也不需要；材料太小，多形成愈伤组 织，甚至难于成活。一般选取培养材料的大小，在0.5cm-1.0cm。如果是胚胎培养或脱毒培养的材料，则应更小。
4．氧气 植物组织培养中，外植体的呼吸需要氧气。在液 体培养中，振荡培养是解决通气的良好办法。
1. 选择优良的种质 无论是离体培养繁殖种苗，或者是进行生物技术研究， 培养材料的选择都要从主要的植物入手，选取性状优良的 种质，或特殊的基因型。对材料的选择要有明确的目的， 具有一定的代表性，提高成功机率，增加其实用价值。
2. 选择健壮的植株 组织培养用的材料，最好从生长健壮的无病虫的植株 上，选取发育正常的器官或组织。因为这些器官或组织代 谢旺盛，再生能力强，比较容易培养成功。
• （5）布质制品的灭菌 • 湿热灭菌法：工作服、口罩、帽子等布质品均用湿
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第三节 外植体（培养物）的建立
• 抗生素对植物材料的毒性因植物类型不同差异很大，因 此，用植物离体培养进行基本的测试是实验成功的重要 一步。由于植物毒性影响或抗生素渗透性差，在处理污 染实验中，抗生素对分离组织也可能失效。了解抗生素 对细菌和植物二者的效应，是消除污染和保护培养物的 关键。 • 此外，抗生素常作为预防污染作用而加入到培养基中， 或者在已鉴定出细菌污染的情况下，用于抑制细菌生长 或消灭细菌。抗生素的抗菌作用在中性培养基(pH6.5— 7.5)中比常规状态提高许多，而在酸性条件下则失效， 而且抗生素具有热敏感性，不能采用高温高压灭菌，只 能采用过滤灭菌的方法加入培养基。
根据细胞全能性学说，植物体的每一个细胞 都含有全部的遗传信息，都能再生出一个 新植株。但是，要使每个细胞的全能性都 表现出来，在目前还是不易做到的事。因 而，外植体（初始培养物）的选择非常重 要。
第二节 外植体（培养物）的选择
1、基因型：
再生能力 （1）、双子叶>单子叶； （2）、被子植物>裸子植物； （3）、双子叶植物中：茄科（Solanacea）；秋海棠 科（Begoniaceae）；景天科（Crassulaceae）； 苦苣苔科（Gesneriaceae）；十字花科（Cruciferae） 再生力特强；郁金香（Tulip）再生力较弱。 （4）、同一种植物中：活体（in vivo）再生力强者， 离体（in vitro）再生力也强。
3 个材料/容器： 污染率=100-（60%）3=78.4% 污染量=100X78.4%=79 获得量= 100X（60%）3= 21 4 个材料/容器： 获得量= 100X（60%）4=13 5 个材料/容器： 获得量= 100X（60%）5=8 • 防止污染的对策： 小容器、多数量、尽量分散、相 互隔离
第三节 外植体（培养物）的建立
常用如下抗生素： 链霉素(10 mg／L)、青霉素(20mg／L)、地霉素(5mg ／L)、夹竹桃霉素(20mg／L)、杆菌肽(50mg／L)、 新霉素(1mg／L)。 例如：用奥复星（氧氟沙星注射液）40～80 mg／L、 注射用的青霉素96～192 mg／L可有效抑制枣树试 管苗的细菌污染，而链霉素40～800mg／L和硫酸 庆大霉素20～60mg／L抑制枣树细菌效果不明显。
第三节 外植体（培养物）的建立
防止方法： • 在培养基中加入抗 生素。 • 利用茎尖培养。 • 利用无菌材料。
第三节 外植体（培养物）的建立
抗生素防治内源菌： • 外植体顶芽培养发现的污染、不同采收期外植体存 在的污染和表面彻底消毒后的细菌污染都可能是内 生菌造成的。内生菌的污染，无论用何种表面消毒 方法都不能彻底消除，因此，必须使用抗生素进行 间接防治处理。 • 选用适当的抗生素特别重要。理想的抗生素应该具 备以下特性：可溶性、稳定性、不受pH高低和培养 基差异的影响、无边界效应、广谱性、杀菌性、不 产生抗性诱导、既廉价又对人体无害。
第三节 外植体（培养物）的建立
（4）、附生菌控制：
• 采用化学杀菌剂可以有效地杀死附生菌，但是一些较特殊的外植体材料，如密披绒 毛的叶片或幼果、花芽或带苞片的叶芽，附生菌可能潜伏在外植体上，无法彻底清 除。这时，必须采取一些特殊的措施，才能有效控制附生菌。 取材来源： • 从保护条件下生长的植株上取材，可有效地控制微生物污染。保护条件指温室、培 养箱、生长室等。从温室、培养箱里取材，可有效减少附生菌的群体数量。从栽培 于温室中的植株上取材和从露地取材相比，前者污染率更低。 • 所取植株的生长土壤，是组织培养中的一个重要污染源。如果采用温室栽培，事先 应进行土壤灭菌。此外，灌溉水也可能成为污染源。取材于用过滤水和用缄市饮用 水灌溉的植株，前者大大降低了微生物污染.
第三节 外植体（培养物）的建立
（1）、产生污染的因素： ①外植体：通常多年生的木本材料比一二年生的草本材料带菌多； 老的材料比幼嫩的带菌多；田间生长的材料比温室的带菌多； 带泥土的材料比清洁的带菌多。一年中以雨季的材料带菌多， 一天中以中午阳光最强时的材料带菌少。 ②培养基：高压蒸汽灭菌的温度、压力、时间和正确使用情况， 以及过滤灭菌中过滤膜孔径、过滤灭菌器械的灭菌处理、过滤 灭菌操作等均影响培养基的灭菌效果。 ③操作环节：接种室是否清洁、干燥、密闭，是否经常用紫外线 灯照射、甲醛熏蒸、70％酒精喷雾杀菌等，操作是否等熟练。 ④培养环境：培养室要求清洁、密闭。每天用70％酒精喷雾除菌、 降尘，每周用少量甲醛熏蒸灭菌。如有空气过滤装置效果更好。 培养室相对湿度太高时，污染加重。
第三节 外植体（培养物）的建立
（5）、内源菌防治： 植物组织培养中对材料只能进行表面灭菌， 而对材料组织内部所带的细菌往往难 以对付。 1. 表面污染与内源污染的区别：
第三节 外植体（培养物）的建立
• 常见内源菌：芽孢杆菌（rod bacteria）为主，尤其是 Bacilus licheniformis 和B.subtilis （“white ghost”）。 真菌中主要是镰刀菌(Fusarium)、轮枝孢菌(Verticillium)、 瓶霉菌(Phialophora)和丝核菌(Rhizoctonia)。 • 内源菌的检测：通常情况下，通过观察培养瓶就可看到 一些污染的迹象；但是对于生长缓慢的细菌或内生菌来 说，仅靠肉眼观察是不够的，必须通过指示培养，即采 用微生物特别容易生长的培养基和培养条件，让外植体 上的微生物快速生长，然后予以鉴定[培养基中加入蛋白 胨（peptone）、胰蛋白胨（trypone）或酵母汁(YE)]。
• 污染估算：首次接种通常污染 率40—60% 按40%计：接种100个材料 1个材料/容器： 污染量=100X40%=40 获得量=100-40=60。 2个材料/容器： 2污染：1X40%X40%=16% 弃掉 1污染：2X40%X40%=32% 2未污染：60%X60%=36% 污染率=100-36=62% 污染量=100X62%=62 获得量=100-62=48
3、根据时间和季节取材
生 长 物 质 含 量
抑 制 物 质 含 量
时间或季节
时间或季节
第二节 外植体（培养物）的选择
3、根据时间和季节取材
取材时间 取材时间
物 质 含 量
抑制物质
生长物质
时间或季节
第二节 外植体（培养物）的选择
4、根据母株位置选择：
具原基结构的外植体：茎尖、 侧芽、原球茎、鳞芽、分生 组织 不具原基结构的外植体：根、 茎、叶、花、果等器官，需要 脱分化。
4、污染（Infection）
能否有效地控制微生物污染是植物离体培养是否成功的关键技术 之一。对于离体培养的探索性研究实验，污染会导致实验失败； 对于大规模的离体繁殖生产来说，污染使生产成本大大增加。 因此，无论是科研机构还是生产厂家都十分重视微生物污染问 题。 植物离体培养中的污染可分为外植体、培养基、无菌操作和培养 环境四个方面。其中培养基和无菌操作方面的污染，目前已得 到十分有效的控制。外植体方面污染最复杂，也最难控制，其 可能是细菌引起的，也可能是真菌引起的；微生物可能是附生 性的，也可能是内生性的。近年来，国外较重视各种微生物的 鉴定，并根据不同的微生物种类采取相应的控制措施，这方面 的研究进展较快。
第三节 外植体（培养物）的建立
5、褐变（Browning）： （1）、概念：外植体在培养容器中被氧化变褐而死亡 的现象。
第三节 外植体（培养物）的建立
（2）、外植体材料褐化原理：
植物组织的褐化是通过含铜的氧化酶如多酚氧化酶和 酪氨酸酶起作用所致，其作用的底物通常是酪氨酸 和邻位羟酚类化合物如绿原酸等。酶和底物在植物 正常生长的情况下是在组织内的不同部位，当细胞 受伤或组织垂死时，酶和底物就跑到一起发生作用， 当酚被氧化为活性酸化物和环形多聚体氧化蛋白时 便形成深色化合物，这些物质又很快被氧化和变成 复杂的抑制性物质，从而导致外植体材料变褐死亡 并使培养基变褐 。
第三节 外植体（培养物）的建立
（6）、特殊污染源： 污染中特别注意一种呈乳白色的细菌污染，这种 细菌为芽孢杆菌。法国林木育种协会鉴定为迟 缓芽孢杆菌(Bacilluslenlus)，它外被荚膜，耐 高温，一般灭菌剂难以杀死。它可以随培养材 料、用具等传播；它可出现在培养基表面，或 呈滴形云雾状存在于培养基内。 若出现应及时淘汰污染源，并对所用过的器皿和 用具进行严格高温灭菌处理。
第三节 外植体（培养物）的建立
• 与取样外植体年龄有关： 引起褐化程度的轻重常与取 样外植体组织的年龄有关， 通常是幼龄部位产生褐化 较轻，随着组织的老龄化 而褐化加重。因此，在外 植体接种时常需要剥去鳞 片和大叶片，尤其是以切 取幼嫩的芽尖或切取顶芽 分生组织（或带少量叶原 基）接种更为理想 。
2、根据母株的年龄和生长发育阶段选择：
年 龄 或 幼 化 程 度
外 植 体 建 立
阶 段 发 育
外 植 体 建 立
母株年龄和幼化程度与外植体建立
母株阶段发育与外植体建立
第二节 外植体（培养物）的选择
杜鹃花 ‘van Weerden Poelman’
第二节 外植体（培养物）的选择
第二节 外植体（培养物）的选择
第三节 外植体（培养物）的建立
1、主要任务：成功的将外植
体建立在试管中。
2、主要技术环节：
（1）、外植体的选择 （2）、外植体的消毒 （3）、培养基的选择、配制 （4）、外植体消毒与接种
3、关键问题：
（1）、污染（Infection） （2）、褐变（Browning）
第二节 外植体（培养物）的选择
材料预处理： • 在对外植体进行常规化学灭菌之前，对特殊材料进行特殊预处理，可以收到很好的 效果。例如，在对密披绒毛的枇杷幼果进行灭菌之前，先把绒毛刮去，灭菌效果很 好。对于密披绒毛的叶片，可先连枝带叶放在自来水下冲洗，去除污物后，用0.5 ％Tween20浸1h（其间换新鲜液2～3次），然后进行常规灭菌，就可起到彻底杀菌 的作用。对兰花花芽常规灭菌之前，先用10％的杀藻铵（Benzalkonium Chloride） 溶液浸渍材料10min，效果很好。