第四章 外植体的选择、消毒和接种
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植物组织培养：第4章 外植体的选择、灭菌及培养
由于在消毒后的环境里和物品上没有活着的微生物， 所以通过严格消毒灭菌的操作空间(接种室、超净台、 等)和使用的器皿，以及操作者的衣着和手都不带任何 活着的微生物。在这样的条件下进行的操作，就叫做无 菌操作。
一 常用的灭菌方法 物理方法
化学方法
湿热灭菌(常压或高压蒸煮) 干热灭菌(烘烧和灼烧) 射线处理(紫外线、超声波、微波) 过滤除菌 大量无菌水冲洗
注意：完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气， 灭菌才能彻底。
在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷 空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀 压大于水蒸汽的膨胀压，所以，当水蒸汽中含有 空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于 饱和蒸汽的温度。
高压灭菌放气有几种不同的做法，但目的 都是要排净空气，使锅内均匀升温，保证灭菌 彻底。常用方法是：关闭放气阀，通电后，待 压力上升到0.05MPa时，打开放气阀，放出空 气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀。关 阀再通电后，压力表上升达到0.1MPa时或压力 为0.1-0.15MPa，15-20min。
因此，植物材料必须经严格的表面灭菌处理， 再经无菌操作接到培养基上，这一过程叫做接种。
第一步:自来水冲洗
将采来的植物材料除去不用的部分，将需要的部分仔 细洗干净，如用适当的刷子等刷洗。把材料切割成适当大 小，即灭菌容器能放入为宜。
置自来水龙头下流水冲洗几分钟至数小时，易漂浮或 细小的材料，可装入纱布袋内冲洗。流水冲洗在污染严重 时特别有用。洗时可加入洗衣粉清洗，然后再用自来水冲 净洗衣粉水。洗衣粉可除去轻度附着在植物表面的污物， 除去脂质性的物质，便于灭菌液的直接接触。
(3)配制培养基时应注意成分的适当分组与加入的顺序。 如将磷、钙和铁放在最后加入。
(4)注意高压灭菌后培养基pH值的变化及回复动态。如 高压灭菌后的pH值常由5.80升高至6.48。而96h后又 回降至5.8左右。这样在实验中就可以根据这一规律 加以掌握。
一 常用的灭菌方法 物理方法
化学方法
湿热灭菌(常压或高压蒸煮) 干热灭菌(烘烧和灼烧) 射线处理(紫外线、超声波、微波) 过滤除菌 大量无菌水冲洗
注意：完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气， 灭菌才能彻底。
在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷 空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀 压大于水蒸汽的膨胀压，所以，当水蒸汽中含有 空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于 饱和蒸汽的温度。
高压灭菌放气有几种不同的做法，但目的 都是要排净空气，使锅内均匀升温，保证灭菌 彻底。常用方法是：关闭放气阀，通电后，待 压力上升到0.05MPa时，打开放气阀，放出空 气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀。关 阀再通电后，压力表上升达到0.1MPa时或压力 为0.1-0.15MPa，15-20min。
因此，植物材料必须经严格的表面灭菌处理， 再经无菌操作接到培养基上，这一过程叫做接种。
第一步:自来水冲洗
将采来的植物材料除去不用的部分，将需要的部分仔 细洗干净，如用适当的刷子等刷洗。把材料切割成适当大 小，即灭菌容器能放入为宜。
置自来水龙头下流水冲洗几分钟至数小时，易漂浮或 细小的材料，可装入纱布袋内冲洗。流水冲洗在污染严重 时特别有用。洗时可加入洗衣粉清洗，然后再用自来水冲 净洗衣粉水。洗衣粉可除去轻度附着在植物表面的污物， 除去脂质性的物质，便于灭菌液的直接接触。
(3)配制培养基时应注意成分的适当分组与加入的顺序。 如将磷、钙和铁放在最后加入。
(4)注意高压灭菌后培养基pH值的变化及回复动态。如 高压灭菌后的pH值常由5.80升高至6.48。而96h后又 回降至5.8左右。这样在实验中就可以根据这一规律 加以掌握。
最新组培实验外植体选择处理及接种培养知识讲解
超净工作台的过滤装置失效 培养用器皿的口径过大 为了减少损失，提高工作效率，必须在每个操作环节注意防 止污染的发生。
• 2.污染的预防措施
• 发现污染的材料应及时处理，否则将导致培养室环境污染。 对一些特别宝贵的材料，可以取出再次进行更为严格的灭 菌，然后接入新鲜的培养基中重新培养。要处理的污染培 养瓶最好在打开瓶盖前，先集中进行高压灭菌，再清除污 染物，然后洗净备用。现就根据污染途径，阐述污染的几 种预防措施。
常规的表面灭菌处理方法 ①把材料放进75%的酒精中约30～ 60s。 ②用2.5%的CaCl0（次氯酸钙）溶液浸泡15～20min。 ③无菌蒸馏水冲洗3～5次。 ④灭菌时进行摇动，使植物材料与灭菌剂有良好的接触。 ⑤在灭菌剂里滴入数滴0.1%的Tween20（吐温）或Tween80湿润 剂，能增强灭菌效果。
尔敏或75%的酒精擦洗，然后用紫外灯照射约20min。使 用前用75%的酒精喷雾，使空间灰尘落下。一年中要定 期一、二次用甲醛和高锰酸钾熏蒸。 • （7）操作人员在接种时一定要严格按照无菌操作的程 序进行
二、外植体的接种和培养 （一）外植体的接种 （二）外植体的培养
（一）外植体的接种
外植体的接种——是把经过表面消毒后的植物材料切碎 或分离出器官、组织、细胞，并将它们转放到无菌培养 基上的全部操作过程。整个接种过程均须无菌操作。操 作过程中引起的污染，主要由空气中的细菌和工作人员 本身引起的。因此除接种室空气消毒外，应特别注意防 止工作人员本身引起的污染。
常用灭菌药剂的使用和效果
灭菌剂
次氯酸钠 次氯酸钙 漂白粉 氯化汞 酒精 过氧化氢 溴水 硝酸银 抗菌素
使用浓度（%）
2—3 2
饱和浓度 0.1—1 70—75 10—12 1—2
• 2.污染的预防措施
• 发现污染的材料应及时处理，否则将导致培养室环境污染。 对一些特别宝贵的材料，可以取出再次进行更为严格的灭 菌，然后接入新鲜的培养基中重新培养。要处理的污染培 养瓶最好在打开瓶盖前，先集中进行高压灭菌，再清除污 染物，然后洗净备用。现就根据污染途径，阐述污染的几 种预防措施。
常规的表面灭菌处理方法 ①把材料放进75%的酒精中约30～ 60s。 ②用2.5%的CaCl0（次氯酸钙）溶液浸泡15～20min。 ③无菌蒸馏水冲洗3～5次。 ④灭菌时进行摇动，使植物材料与灭菌剂有良好的接触。 ⑤在灭菌剂里滴入数滴0.1%的Tween20（吐温）或Tween80湿润 剂，能增强灭菌效果。
尔敏或75%的酒精擦洗，然后用紫外灯照射约20min。使 用前用75%的酒精喷雾，使空间灰尘落下。一年中要定 期一、二次用甲醛和高锰酸钾熏蒸。 • （7）操作人员在接种时一定要严格按照无菌操作的程 序进行
二、外植体的接种和培养 （一）外植体的接种 （二）外植体的培养
（一）外植体的接种
外植体的接种——是把经过表面消毒后的植物材料切碎 或分离出器官、组织、细胞，并将它们转放到无菌培养 基上的全部操作过程。整个接种过程均须无菌操作。操 作过程中引起的污染，主要由空气中的细菌和工作人员 本身引起的。因此除接种室空气消毒外，应特别注意防 止工作人员本身引起的污染。
常用灭菌药剂的使用和效果
灭菌剂
次氯酸钠 次氯酸钙 漂白粉 氯化汞 酒精 过氧化氢 溴水 硝酸银 抗菌素
使用浓度（%）
2—3 2
饱和浓度 0.1—1 70—75 10—12 1—2
羌活外植体的选择和消毒处理
⑴外植体的选择和消毒处理：以羌活的幼叶为外植体，经流水冲洗10~20 分钟，再用体积浓度为75% 的酒精浸泡灭菌15~30 秒，然后以无菌去离子水冲洗2~3 次，再将冲洗后的外植体置于质量浓度为0.1%~0.2% 的升汞中，浸泡灭菌5~8 分钟，并用无菌去离子水冲洗3~6次，即得消毒后的外植体；⑵外植体接种：将所述消毒后的外植体切成0.1~0.5cm2 的小块，接种在愈伤组织诱导培养基上，其中每25ml 所述愈伤组织诱导培养基中接种3 小块所述消毒后的外植体；在温度为20℃±2℃、光源为日光灯、光强为30~60 umol . m-2. s-1、光照时间为12 h .d-1 的条件下培养10~25 天，在幼叶切口处膨大形成愈伤组织；⑶愈伤组织增殖：将所述愈伤组织接种到愈伤组织增殖培养基上，其中每25ml 所述愈伤组织增殖培养基中接种2 块所述愈伤组织；在温度为20℃±2℃、光源为日光灯、光强为30~60 umol . m-2. s-1、光照时间为12 h .d-1 的条件下愈伤组织增殖20~35 天，长出乳白色、颗粒状致密性的愈伤组织；⑷愈伤组织的芽诱导：将所述步骤⑶所得到的愈伤组织接种到诱芽培养基上，其中每25ml 所述诱芽培养基中接种2 块所述愈伤组织；在温度为20℃±2℃、光源为日光灯、光强为30~60 umol . m-2. s-1、光照时间为12 h .d-1 的条件下培养30~35 天，形成丛生羌活苗；⑸生根诱导：将所述丛生羌活苗分株后转入生根培养基中，其中每25ml 所述生根培养基中接种1 棵所述丛生羌活苗；在温度为20℃±2℃、光源为日光灯、光强为30~60 umol .m-2. s-1、光照时间为12 h .d-1 的条件下培养20~30 天后，小苗基部出现白色、粗壮短根，并长出完整根系，即得完整再生小苗；⑹育苗基质消毒：将育苗基质在115~121℃温度下进行高温消毒，15~20min 后即得消毒后的育苗基质；所述育苗基质是指腐殖质与珍珠岩按2 ：1 重量比混合而成的混合基质；⑺植株移栽：将所述完整再生小苗直接移栽到所述消毒后的育苗基质中，炼苗后即长成正常羌活植株；所述一棵完整再生小苗种植在所述消毒后的育苗基质10cm2 的范围内。
第四节 植物组织培养快速繁殖技术
讲课教师：郭广领
植物组织培养快速繁殖技术
（七）试管苗驯化与移栽
1.试管苗生存环境与自然环境的差异 2.试管苗的特点 3.试管苗的驯化 4.试管苗的移栽 5.苗期管理
讲课教师：郭广领
植物组织培养快速繁殖技术
1.试管苗生存环境与自然环境的差异
（1）高温且恒温：温度控制在25±2℃ 。 （2）高湿：瓶内相对湿度接近于100% 。 （3）弱光：组织培养中的光强与太阳光相比 一般很弱，故幼苗生长也较弱，2000～3000 Lx
讲课教师：郭广领
植物组织培养快速繁殖技术
课后热身
1、怎样选择和处理外植体？ 2、怎样进行外植体的表面灭菌与接种？
3、外植体发育的方式有哪些？ 4、试管苗的主要特点有哪些？怎样进行试管苗 的移栽？怎么对驯化的试管苗进行管理？
讲课教师：郭广领
讲课教师：郭广领
思考一下： 提高生根率的措施有哪些？
植物组织培养快速繁殖技术
（1）培养基内矿物元素浓度高时有利于发生茎叶，而 较低时有利于生根。(培养基采用1/2MS或1/2大量元 素培养基) （２）培养基中去掉细胞分裂素，加入适量的生长素。 （CTK/IAA比值低时有利于生根）
（３）生根培养基的蔗糖用量可适当减少，用1.5%～ 2%的浓度，以减少试管苗对异养条件的依赖。 (4）提高光照强度，促进光合作用。
讲课教师：郭广领
植物组织培养快速繁殖技术
（四）外植体的接种
1. 打开已准备好的培养基瓶盖或封口膜，将三 角瓶倾斜拿在手中，使瓶口靠近酒精灯火焰，并 将瓶口在火焰上方转动灼烧数秒钟。 2. 用镊子夹取一块切好的外植体送入瓶内，轻 轻插在培养基上。 3. 将叶片背面接触培养基，茎尖、茎段要按其 生长极性的上下端，正放在培养基上。外植体接 种以每瓶放一枚组块为宜。 4. 接完种后，将瓶口在火焰上再灼烧数秒钟， 盖上瓶盖或封口膜。然后再接下一瓶，直到全部 接种完毕。 5. 做好记录，注明处理材料的物种名称、处理 方法、接种日期等。
植物组织培养快速繁殖技术
（七）试管苗驯化与移栽
1.试管苗生存环境与自然环境的差异 2.试管苗的特点 3.试管苗的驯化 4.试管苗的移栽 5.苗期管理
讲课教师：郭广领
植物组织培养快速繁殖技术
1.试管苗生存环境与自然环境的差异
（1）高温且恒温：温度控制在25±2℃ 。 （2）高湿：瓶内相对湿度接近于100% 。 （3）弱光：组织培养中的光强与太阳光相比 一般很弱，故幼苗生长也较弱，2000～3000 Lx
讲课教师：郭广领
植物组织培养快速繁殖技术
课后热身
1、怎样选择和处理外植体？ 2、怎样进行外植体的表面灭菌与接种？
3、外植体发育的方式有哪些？ 4、试管苗的主要特点有哪些？怎样进行试管苗 的移栽？怎么对驯化的试管苗进行管理？
讲课教师：郭广领
讲课教师：郭广领
思考一下： 提高生根率的措施有哪些？
植物组织培养快速繁殖技术
（1）培养基内矿物元素浓度高时有利于发生茎叶，而 较低时有利于生根。(培养基采用1/2MS或1/2大量元 素培养基) （２）培养基中去掉细胞分裂素，加入适量的生长素。 （CTK/IAA比值低时有利于生根）
（３）生根培养基的蔗糖用量可适当减少，用1.5%～ 2%的浓度，以减少试管苗对异养条件的依赖。 (4）提高光照强度，促进光合作用。
讲课教师：郭广领
植物组织培养快速繁殖技术
（四）外植体的接种
1. 打开已准备好的培养基瓶盖或封口膜，将三 角瓶倾斜拿在手中，使瓶口靠近酒精灯火焰，并 将瓶口在火焰上方转动灼烧数秒钟。 2. 用镊子夹取一块切好的外植体送入瓶内，轻 轻插在培养基上。 3. 将叶片背面接触培养基，茎尖、茎段要按其 生长极性的上下端，正放在培养基上。外植体接 种以每瓶放一枚组块为宜。 4. 接完种后，将瓶口在火焰上再灼烧数秒钟， 盖上瓶盖或封口膜。然后再接下一瓶，直到全部 接种完毕。 5. 做好记录，注明处理材料的物种名称、处理 方法、接种日期等。
组培苗生产技术—外植体的选择、处理与接种(植物组织培养课件)
（2）在无病虫害的田块，连续晴天3～4d时选取生长健壮、新萌发且未着地 的匍匐茎段3cm长作外植体。
3、蔬菜（龙牙百合） 龙牙百合特征:鳞茎，无皮，广卵形，外部鳞片长,将整个鳞茎 包裹，直径5~15厘米，白色，茎高90厘米左右，直立茎上叶 多而散生，披针形，叶色从浓绿，光滑。花单生茎顶。花朵 呈喇叭状长筒形，白色，有清香。
不能损伤组织材料，保持外植体的生活力，使外 植体在良好的培养条件下很快恢复生机，正常 生长和繁殖.
• 消毒剂的要求 • 要求：具有良好的消毒作用，既不会杀死植物的
组织细胞，又易被无菌水冲洗掉，不影响消毒后 外植体的生长和分化.
常用灭菌药剂的使用和效果
灭菌剂 使用浓度（%） 清除的难易 消毒时间 效 果
2、茎段（采用嫩茎的切段促进腋芽萌发，取材容易） 3、叶（幼嫩叶片组织通过愈伤组织或不定芽分化产生植株，
取材容易，操作方便，但易发生变异）； 4、花球和花蕾 5、种子、根、块根、块茎、花瓣等。
（二）实例分析 1、花卉（非洲菊） • 常用茎尖、嫩叶、花托进行非洲菊的组织培养，也有利用
种子进行组织培养的。 • 茎尖培养操作麻烦，但对于脱毒苗的生产是最有效的。 • 花托培养可直接成苗， 既可保持种性，又易行、 耗时短，是首选的外植体。
• 首先要选择花大、花色艳丽、市场流行的品种，然后再选 择无病虫害、植株生长健壮、花色纯正的优良品种单株进 行取材。
• 一旦选出优株后，应进行挂牌标记，并一直在其上采取花 蕾。作为外植体的花蕾要选取直径在1㎝左右，而且未露 心的小花蕾，太大或是太小的花蕾均不能获得满意的效果 。
2、水果（草莓）
（1）选择结果性优良的草莓母株上新抽出的匍匐茎作外植体，以每年6～7 月份最为适宜。
龙牙百合的许多器官、组织都可作为外植体， 如鳞片、花梗、叶片、茎尖、腋芽、花瓣、花托 、花丝、花药、胚、子房、根尖等，其中采用鳞 片作外植体的较多。
3、蔬菜（龙牙百合） 龙牙百合特征:鳞茎，无皮，广卵形，外部鳞片长,将整个鳞茎 包裹，直径5~15厘米，白色，茎高90厘米左右，直立茎上叶 多而散生，披针形，叶色从浓绿，光滑。花单生茎顶。花朵 呈喇叭状长筒形，白色，有清香。
不能损伤组织材料，保持外植体的生活力，使外 植体在良好的培养条件下很快恢复生机，正常 生长和繁殖.
• 消毒剂的要求 • 要求：具有良好的消毒作用，既不会杀死植物的
组织细胞，又易被无菌水冲洗掉，不影响消毒后 外植体的生长和分化.
常用灭菌药剂的使用和效果
灭菌剂 使用浓度（%） 清除的难易 消毒时间 效 果
2、茎段（采用嫩茎的切段促进腋芽萌发，取材容易） 3、叶（幼嫩叶片组织通过愈伤组织或不定芽分化产生植株，
取材容易，操作方便，但易发生变异）； 4、花球和花蕾 5、种子、根、块根、块茎、花瓣等。
（二）实例分析 1、花卉（非洲菊） • 常用茎尖、嫩叶、花托进行非洲菊的组织培养，也有利用
种子进行组织培养的。 • 茎尖培养操作麻烦，但对于脱毒苗的生产是最有效的。 • 花托培养可直接成苗， 既可保持种性，又易行、 耗时短，是首选的外植体。
• 首先要选择花大、花色艳丽、市场流行的品种，然后再选 择无病虫害、植株生长健壮、花色纯正的优良品种单株进 行取材。
• 一旦选出优株后，应进行挂牌标记，并一直在其上采取花 蕾。作为外植体的花蕾要选取直径在1㎝左右，而且未露 心的小花蕾，太大或是太小的花蕾均不能获得满意的效果 。
2、水果（草莓）
（1）选择结果性优良的草莓母株上新抽出的匍匐茎作外植体，以每年6～7 月份最为适宜。
龙牙百合的许多器官、组织都可作为外植体， 如鳞片、花梗、叶片、茎尖、腋芽、花瓣、花托 、花丝、花药、胚、子房、根尖等，其中采用鳞 片作外植体的较多。
简述外植体的采集与处理操作流程
简述外植体的采集与处理操作流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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外植体的选择和灭菌ppt课件
6
资金是运动的价值，资金的价值是随 时间变 化而变 化的， 是时间 的函数 ，随时 间的推 移而增 值，其 增值的 这部分 资金就 是原有 资金的 时间价 值
吐温的使用：0.1%，表面活性剂，浸润作用 无菌水:在用灭菌剂之前和之后均需用无菌水冲 洗数遍.
7
资金是运动的价值，资金的价值是随 时间变 化而变 化的， 是时间 的函数 ，随时 间的推 移而增 值，其 增值的 这部分 资金就 是原有 资金的 时间价 值
资金是运动的价值，资金的价值是随 时间变 化而变 化的， 是时间 的函数 ，随时 间的推 移而增 值，其 增值的 这部分 资金就 是原有 资金的 时间价 值
第一部分
组织培养技术
第四章 外植体的选择和灭菌
外植体（explant）：从植物体上分离的用于离体培养的植 物体部分。
第一节 外植体的选择
一、外植体的部位：根、茎、叶、花、果等 二、其它：如季节、生理状态和发育年龄等 三、外植体的大小
三、培养条件
温度：25±2℃； 光照：包括光照、光质和光周期； 培养基的pH:5.6-6.0;但若培养基中含有铁 离子， pH应在5.2以下. 湿度:培养容器的湿度常保持在100%; 培养 室的湿度70-80%. 气体:氧;二氧化碳;乙烯等.
10
资金是运动的价值，资金的价值是随 时间变 化而变 化的， 是时间 的函数 ，随时 间的推 移而增 值，其 增值的 这部分 资金就 是原有 资金的 时间价 值
3
资金是运动的价值，资金的价值是随 时间变 化而变 化的， 是时间 的函数 ，随时 间的推 移而增 值，其 增值的 这部分 资金就 是原有 资金的 时间价 值
取材季节
一般取母株生长旺盛的季节的材料
外植体的大小
资金是运动的价值，资金的价值是随 时间变 化而变 化的， 是时间 的函数 ，随时 间的推 移而增 值，其 增值的 这部分 资金就 是原有 资金的 时间价 值
吐温的使用：0.1%，表面活性剂，浸润作用 无菌水:在用灭菌剂之前和之后均需用无菌水冲 洗数遍.
7
资金是运动的价值，资金的价值是随 时间变 化而变 化的， 是时间 的函数 ，随时 间的推 移而增 值，其 增值的 这部分 资金就 是原有 资金的 时间价 值
资金是运动的价值，资金的价值是随 时间变 化而变 化的， 是时间 的函数 ，随时 间的推 移而增 值，其 增值的 这部分 资金就 是原有 资金的 时间价 值
第一部分
组织培养技术
第四章 外植体的选择和灭菌
外植体（explant）：从植物体上分离的用于离体培养的植 物体部分。
第一节 外植体的选择
一、外植体的部位：根、茎、叶、花、果等 二、其它：如季节、生理状态和发育年龄等 三、外植体的大小
三、培养条件
温度：25±2℃； 光照：包括光照、光质和光周期； 培养基的pH:5.6-6.0;但若培养基中含有铁 离子， pH应在5.2以下. 湿度:培养容器的湿度常保持在100%; 培养 室的湿度70-80%. 气体:氧;二氧化碳;乙烯等.
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资金是运动的价值，资金的价值是随 时间变 化而变 化的， 是时间 的函数 ，随时 间的推 移而增 值，其 增值的 这部分 资金就 是原有 资金的 时间价 值
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资金是运动的价值，资金的价值是随 时间变 化而变 化的， 是时间 的函数 ，随时 间的推 移而增 值，其 增值的 这部分 资金就 是原有 资金的 时间价 值
取材季节
一般取母株生长旺盛的季节的材料
外植体的大小
植物组织培养 组培苗生产技术外植体的选择处理与接种护理课件
ห้องสมุดไป่ตู้湿度
保持培养环境湿度适宜， 以防止培养基干燥和外植 体失水。
培养过程中的观察与记录
定期观察外植体的生长状 况，包括颜色、质地、生 长速度等，并记录观察结 果。
观察外植体是否有异常表 现，如病变、死亡或生长 异常等，及时采取相应措 施。
记录外植体的生长曲线， 以便了解其生长动态和规 律。
培养过程中的问题处理
污染问题
如发现外植体受到微生物污染， 应及时采取措施，如更换培养基、
增加消毒频率等。
褐化问题
外植体褐化是常见的现象，可以通 过添加抗氧化剂、调整培养基成分 等方法减轻褐化程度。
玻璃化现象
玻璃化是指培养中的植物组织出现 半透明状的现象，可以通过降低激 素浓度、增加培养基湿度等方法进 行改善。
外植体的繁殖与移栽
生根过程
无根苗在生根培养基上生长，经过细胞分裂和分 化形成根原基，进而发育成完整的根系。
移栽前的准备
在生根培养过程中，需要对外植体进行适当的炼 苗处理，以适应外界环境，提高移栽成活率。
移栽与驯化
移栽是将培养好的组培苗从培养 容器中取出，移植到自然环境中 的过程。
移栽后的管理：保持适宜的光照、 温度、湿度和水分条件，及时除 草、防治病虫害，促进组培苗健 康生长。
外植体的接种
无菌操作技 术
操作前准备
在操作前，需要对外植体进行彻底清洗，去除表面的污垢 和微生物。同时，操作人员需要对手部进行消毒，确保无 菌操作。
灭菌处理 外植体需要进行严格的灭菌处理，以消除附着在表面上的 微生物。常用的灭菌方法包括使用酒精、次氯酸钠或氯化 汞等消毒剂。
接种环境
接种环境需要保持无菌状态，通常在超净工作台或无菌室 内进行。同时，接种工具也需要进行消毒处理，避免交叉 污染。
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3.易漂浮或细小的材料，可装 入纱布袋内冲洗。 4.洗衣粉、吐温可除去轻度附 着在植物表面的污物，除去脂 质性的物质。
接种材料预处理:
(1)接种材料预培养 (2)就地套袋 (3)接种材料修整 (4)冲洗
接种前准备:
1
2
3
456外植体 Nhomakorabea毒:外植体剪切:
1.叶片0.5cm×0.5cm 2.微茎尖0.2-0.5mm 3.带节茎段0.5-1.0cm 4.芽丛分离
六、外植体的褐变及其防止措施
褐变
• 褐变是指外植体在培养过程中体内的多 酚氧化酶被激后活，使细胞内的酚类物质 氧化成棕褐色醌类物质，这种致死性的褐 化物不但向外扩散致使培养基逐渐变成褐 色，而且还会抑制其他酶的活性，严重影 响外植体的脱分化和器官分化，最后变褐 而死亡的现象
影响褐变的因素
• 植物种类：一般木本植物，单宁、色素含量 高的植物易发生褐变 。
(6)接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和 咳嗽等；
(7)接种完毕后要清理干净工作台，可用紫外灯灭菌30min。 若连续接种，每5天要大强度灭菌一次。
接种前外植体消毒顺序:
第三节 培养条件
在植物组织培养中温度、光照、湿度等各种环境条 件，培养基组成、ＰＨ值、渗透压等各种化学环境条件 都会影响组培苗的生长和发育。
污染的原因及其预防措施
1、污染：植物组织培养 过程中培养基和培养材 料滋生杂菌，导致培养 失败的现象
2、污染的原因 • 一是病原菌污染（细菌、
真菌） • 二是外植体、培养基、
培养器皿带菌 • 三是操作人员未遵守操
作规程。
真菌污染
污染的预防措施
组织培养中降低污染率是工厂化生产中不可忽 视的技术环节。预防措施有： • 防止材料带菌------选择取材时间、材料与培养、 外植体灭菌等措施； • 防止用具带菌------器皿与金属器械灭菌； • 操作室要处于无菌状态------工作室、培养室灭菌 等； • 操作人员要按照操作程序进行。 • 在培养基中加入抗菌素 • 分散接种
一、温度
温度是组织培养过程中的重要因素。 组织培养在最适温 度下生长分化表现良好， 大多数组织培养都是在23～27℃之 间进行，很多研究者采用了25±２℃的恒温条件。低于15℃ 时培养，组织会表现生长停止，高于35℃时对生长不利。
不同植物培养的适温不同。百合的最适温度是20℃、月 季是25～27℃、番茄是28℃。 温度不仅影响组培苗的生长速 度， 也影响其分化增殖以及器官建成等发育进程。如烟草芽 的形成28℃为最好， 在12℃以下，33℃以上形成率皆最低。
3．光周期 试管苗培养时要选用一定的光暗周期来进行组织培养，
最常用的周期是16小时的光照， ８小时的黑暗，研究表明， 对短日照敏感的品种的器官组织， 在短日照下易分化，而在 长日照下产生愈伤组织，有时需要暗培养， 尤其是一些植物
的愈伤组织在暗下比在光下更好。如红花、乌桕树的愈伤组 织。
三、湿度
湿度的影响包括培养容器和环境的湿度条件。
第四，取材季节合理；
对于大多数植物而言，应在其生长的季节开始采 样。在生长末期或已进入休眠期时取样，外植体可能 对诱导反应迟钝或无反应，较难成活。
第五，考虑器官的生理状态和发育年龄；
一般认为，沿着植物的主轴，越 向上的部分所形成的器官的生长时间 越短，其生理年龄也相应越老，越接 近发育上的成熟，越易形成花器官。 反之，越向基部，其生理年龄越小。
容器内主要受培养基水分含量和封口材料的影响。 前者 又受琼脂含量的影响。在冬季应适当减少琼脂用量， 否则， 将使培养基干硬，不利于外植体接触或插进培养基， 导致生 长发育受阻。封口材料直接影响容器内湿度情况，封闭度较高 的封口材料易引起通透性受阻，也导致生长发育受影响。
环境的相对湿度可以影响培养基的水分蒸发， 一般要求 ７０～８０％的相对湿度， 常用加湿器或经常洒水的方法来 调节湿度。湿度过低会使培养基丧失大量水分，导致培养基 各种成分浓度的改变和渗透压的升高，进而影响组织培养的 正常进行；湿度过高时，易引起棉塞长霉，造成污染。
不同培养目标采用的培养温度也不同，百合鳞片在30℃ 下再生的小鳞茎的发叶速度和百分率都比在25℃下的高。 桃 胚在2～5℃条件进行一定时间的低温处理， 有利于提高胚培 养成活率。用35℃处理草莓的茎尖分生组织3～5天，可得到 无病毒苗。
二、光照
组织培养中光照也是重要的条件之一。
1．光照强度 从目前的研究情况看，光照强度对外植体、 细胞的最初分裂增殖和器官的分化有重要影响。 一般来说， 光照强度较强，幼苗生长的粗壮，而光照强度较弱幼苗容 易徒长。 2．光质 光质对愈伤组织诱导、培养组织的增殖以及器 官的分化都有明显的影响。 如百合珠芽在红光下培养，８ 周后，分化出愈伤组织。但在蓝光下， 几周后才出现愈伤 组织，而唐菖蒲子球块接种15天后，在蓝光下培养首先出 现芽，形成的幼苗生长旺盛，而白光下幼苗纤细。
接种操作:
横插法与竖插法:
接种室要严格消毒
接种时有一个敞口的过程，是极易引起污染的时期，主要 由空气中的细菌和工作人员本身引起，因此，接种室要严格进 行空间消毒。接种室内保持定期用1％~3％的高锰酸钾溶液对 设备、墙壁、地板等进行擦洗。除了使用前用紫外线和甲醛灭 菌外，还可在使用期间用70％的酒精或3％的来苏儿喷雾，使 空气中灰尘颗粒沉降下来。
• 基因型： • 外植体的生理状态：一般幼龄材料，幼嫩器
官和组织，春季取外植体，褐变发生较轻 。 • 培养基的成分：培养基中6－BA或KT能促进褐
变发生，而生长素类如IAA可减轻褐变发生。 • 材料转移时间：
褐变的防止措施
• 选择适宜的外植体及最佳培养基：适当 降低培养基无机盐浓度，降低PH值，降 低细胞分裂素水平等，可显著减轻培养 物褐变
玻璃化现象的预防措施
• 适当控制培养基中无机盐浓度 • 适当控制培养基中蔗糖和琼脂浓度 • 适当降低细胞分裂素和赤霉素浓度 • 增加自然光照，控制光照时间 • 控制好温度 • 改善培养皿的气体交换状况 • 在培养基中添加其他物质
培养阶段易出现的其他问题
白花苗
文献资料:
1.苹果无融合生殖矮生砧木的组织培养 2.矮牵牛花药培养及植株再生研究 3.水稻花药组织培养中绿苗率的提高 4.分蘖洋葱的组织培养与快速繁殖 5.半夏组织培养快繁技术研究 6.月季的茎段培养与快繁 7.樱桃番茄的组织培养与快速繁殖 8.哈密瓜组织培养和离体快繁 9.羽扇豆的组织培养 10.花烛的组织培养与快速繁殖 11.柿树的叶片培养和快速繁殖 12.菊苣花瓣的组织培养
假设污染率为95%： 100块材料，接种于100支试管，即1块/支。
得率为：P=（1-95%）100=5块无菌材料 ❖ 200块材料，接种于100支试管，即2块/支。
P1（2污）=95% 95%=90.25% P2（1污1得或1得1污）=2 95%5%=9.5% P3（2得）=5% 5%=0.25% 若得到1支试管的无菌材料，至少要接种： 1/0.25%=400支，即接种800块材料，能得2块无菌 材料。 若按3块/支接种，需做8000支试管培养基，接入2.4万 块材料，才能有1支试管的（得3块）无菌材料。
pＨ值大小调整可用０.１Ｍ的ＮaＯＨ和０.１Ｍ的ＨＣl 来调整。１ml的ＮaＯＨ可使pＨ值升高０.２单位，１ml的 HCL可使值降低０.２单位。调节时一定要充分搅拌均匀。
六、气体
氧气是组织培养中必需的因素。 瓶盖封闭时要考虑通气问题，可用附有滤气膜的封口材 料。 通气最好的是棉塞封闭瓶口，但棉塞易使培养基干燥， 夏季易引起污染。固体培养基可加进活性炭来增加通气度,以 利于发根。 培养室要经常换气，改善室内的通气状况。 液体振荡培养时，要考虑振荡的次数、振幅等，同时要 考虑容器的类型、培养基等。
无论是离体培养繁殖种苗，还是进行生物技术研究，培 养材料的选择都要从主要的植物入手，选取性状优良的种质 或特殊的基因型。对材料的选择要有明确的目的，具有一定 的代表性，以提高成功的几率，增加其实用价值。
第二，选择健壮的植株；
组织培养用的材料，最好从生长健壮的无病虫的植株 上，选取发育正常的器官或组织。因为这些器官或组织代 谢旺盛，再生能力强，培养后比较容易成功。此现象可能 是由于外植体内部的植物激素水平能够在接种后得以维持 所致。
无菌操作可按以下步骤进行：
(1)在接种4h前用甲醛熏蒸接种室，并打开其内紫外灯进行灭菌； (2)在接种前20min，打开超净工作台的风机以及台上的紫外灯； (3)接种员先洗净双手，在缓冲间换好专用实验服，并换穿托鞋等； (4)上工作台后，用酒精棉球擦拭双手，特别是指甲处。然后擦拭 工作台面；
(5)先用酒精棉球擦拭接种工具，再将镊子和剪子从头至尾过 火一遍，然后反复过火尖端处，对培养皿要过火烤干；
第三，选择合适的部位；
植物组织培养几乎在植物体的各个部位都获得了成功， 这些部位包括：茎尖、茎段、皮层及维管组织、髓细胞、表 皮、块茎的储藏薄壁细胞、花瓣、根、茎、子叶、鳞茎、胚 珠和花药等。
但是不同种类的植物以及同一植物的不同器官对诱导条 件反应是不一致的，有的部位诱导分化率高，有的部位很难 脱分化，或者在分化频率很低。
第二节 外植体的消毒、接种
从外界或室内选取的植物材料，都不同程度地 带有各种微生物。这些污染源一旦带入培养基，便 会造成培养基污染。因此，植物材料必须经严格的 表面灭菌处理。
已消毒的外植体经无菌操作，接到培养基上， 这一过程叫做接种。
外植体接种的一般步骤：
外植体的修剪 流水冲洗 浸润灭菌 接种
完玻无菌1可2自至去..成璃菌将把操用来数不要需材，棒水已适水小作将用在要料当龙时准、、消，采的的切超的头。备手7毒接来部割0部刷下净好表的％到分成的子流分台消等外酒培仔适刷水植。或毒。植细当精养洗冲物接洗大的体。洗、基材种干小几烧经消上料净。箱分杯无毒。除，置钟内、液、
第四章 外植体的选择、消毒和接种
接种材料预处理:
(1)接种材料预培养 (2)就地套袋 (3)接种材料修整 (4)冲洗
接种前准备:
1
2
3
456外植体 Nhomakorabea毒:外植体剪切:
1.叶片0.5cm×0.5cm 2.微茎尖0.2-0.5mm 3.带节茎段0.5-1.0cm 4.芽丛分离
六、外植体的褐变及其防止措施
褐变
• 褐变是指外植体在培养过程中体内的多 酚氧化酶被激后活，使细胞内的酚类物质 氧化成棕褐色醌类物质，这种致死性的褐 化物不但向外扩散致使培养基逐渐变成褐 色，而且还会抑制其他酶的活性，严重影 响外植体的脱分化和器官分化，最后变褐 而死亡的现象
影响褐变的因素
• 植物种类：一般木本植物，单宁、色素含量 高的植物易发生褐变 。
(6)接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和 咳嗽等；
(7)接种完毕后要清理干净工作台，可用紫外灯灭菌30min。 若连续接种，每5天要大强度灭菌一次。
接种前外植体消毒顺序:
第三节 培养条件
在植物组织培养中温度、光照、湿度等各种环境条 件，培养基组成、ＰＨ值、渗透压等各种化学环境条件 都会影响组培苗的生长和发育。
污染的原因及其预防措施
1、污染：植物组织培养 过程中培养基和培养材 料滋生杂菌，导致培养 失败的现象
2、污染的原因 • 一是病原菌污染（细菌、
真菌） • 二是外植体、培养基、
培养器皿带菌 • 三是操作人员未遵守操
作规程。
真菌污染
污染的预防措施
组织培养中降低污染率是工厂化生产中不可忽 视的技术环节。预防措施有： • 防止材料带菌------选择取材时间、材料与培养、 外植体灭菌等措施； • 防止用具带菌------器皿与金属器械灭菌； • 操作室要处于无菌状态------工作室、培养室灭菌 等； • 操作人员要按照操作程序进行。 • 在培养基中加入抗菌素 • 分散接种
一、温度
温度是组织培养过程中的重要因素。 组织培养在最适温 度下生长分化表现良好， 大多数组织培养都是在23～27℃之 间进行，很多研究者采用了25±２℃的恒温条件。低于15℃ 时培养，组织会表现生长停止，高于35℃时对生长不利。
不同植物培养的适温不同。百合的最适温度是20℃、月 季是25～27℃、番茄是28℃。 温度不仅影响组培苗的生长速 度， 也影响其分化增殖以及器官建成等发育进程。如烟草芽 的形成28℃为最好， 在12℃以下，33℃以上形成率皆最低。
3．光周期 试管苗培养时要选用一定的光暗周期来进行组织培养，
最常用的周期是16小时的光照， ８小时的黑暗，研究表明， 对短日照敏感的品种的器官组织， 在短日照下易分化，而在 长日照下产生愈伤组织，有时需要暗培养， 尤其是一些植物
的愈伤组织在暗下比在光下更好。如红花、乌桕树的愈伤组 织。
三、湿度
湿度的影响包括培养容器和环境的湿度条件。
第四，取材季节合理；
对于大多数植物而言，应在其生长的季节开始采 样。在生长末期或已进入休眠期时取样，外植体可能 对诱导反应迟钝或无反应，较难成活。
第五，考虑器官的生理状态和发育年龄；
一般认为，沿着植物的主轴，越 向上的部分所形成的器官的生长时间 越短，其生理年龄也相应越老，越接 近发育上的成熟，越易形成花器官。 反之，越向基部，其生理年龄越小。
容器内主要受培养基水分含量和封口材料的影响。 前者 又受琼脂含量的影响。在冬季应适当减少琼脂用量， 否则， 将使培养基干硬，不利于外植体接触或插进培养基， 导致生 长发育受阻。封口材料直接影响容器内湿度情况，封闭度较高 的封口材料易引起通透性受阻，也导致生长发育受影响。
环境的相对湿度可以影响培养基的水分蒸发， 一般要求 ７０～８０％的相对湿度， 常用加湿器或经常洒水的方法来 调节湿度。湿度过低会使培养基丧失大量水分，导致培养基 各种成分浓度的改变和渗透压的升高，进而影响组织培养的 正常进行；湿度过高时，易引起棉塞长霉，造成污染。
不同培养目标采用的培养温度也不同，百合鳞片在30℃ 下再生的小鳞茎的发叶速度和百分率都比在25℃下的高。 桃 胚在2～5℃条件进行一定时间的低温处理， 有利于提高胚培 养成活率。用35℃处理草莓的茎尖分生组织3～5天，可得到 无病毒苗。
二、光照
组织培养中光照也是重要的条件之一。
1．光照强度 从目前的研究情况看，光照强度对外植体、 细胞的最初分裂增殖和器官的分化有重要影响。 一般来说， 光照强度较强，幼苗生长的粗壮，而光照强度较弱幼苗容 易徒长。 2．光质 光质对愈伤组织诱导、培养组织的增殖以及器 官的分化都有明显的影响。 如百合珠芽在红光下培养，８ 周后，分化出愈伤组织。但在蓝光下， 几周后才出现愈伤 组织，而唐菖蒲子球块接种15天后，在蓝光下培养首先出 现芽，形成的幼苗生长旺盛，而白光下幼苗纤细。
接种操作:
横插法与竖插法:
接种室要严格消毒
接种时有一个敞口的过程，是极易引起污染的时期，主要 由空气中的细菌和工作人员本身引起，因此，接种室要严格进 行空间消毒。接种室内保持定期用1％~3％的高锰酸钾溶液对 设备、墙壁、地板等进行擦洗。除了使用前用紫外线和甲醛灭 菌外，还可在使用期间用70％的酒精或3％的来苏儿喷雾，使 空气中灰尘颗粒沉降下来。
• 基因型： • 外植体的生理状态：一般幼龄材料，幼嫩器
官和组织，春季取外植体，褐变发生较轻 。 • 培养基的成分：培养基中6－BA或KT能促进褐
变发生，而生长素类如IAA可减轻褐变发生。 • 材料转移时间：
褐变的防止措施
• 选择适宜的外植体及最佳培养基：适当 降低培养基无机盐浓度，降低PH值，降 低细胞分裂素水平等，可显著减轻培养 物褐变
玻璃化现象的预防措施
• 适当控制培养基中无机盐浓度 • 适当控制培养基中蔗糖和琼脂浓度 • 适当降低细胞分裂素和赤霉素浓度 • 增加自然光照，控制光照时间 • 控制好温度 • 改善培养皿的气体交换状况 • 在培养基中添加其他物质
培养阶段易出现的其他问题
白花苗
文献资料:
1.苹果无融合生殖矮生砧木的组织培养 2.矮牵牛花药培养及植株再生研究 3.水稻花药组织培养中绿苗率的提高 4.分蘖洋葱的组织培养与快速繁殖 5.半夏组织培养快繁技术研究 6.月季的茎段培养与快繁 7.樱桃番茄的组织培养与快速繁殖 8.哈密瓜组织培养和离体快繁 9.羽扇豆的组织培养 10.花烛的组织培养与快速繁殖 11.柿树的叶片培养和快速繁殖 12.菊苣花瓣的组织培养
假设污染率为95%： 100块材料，接种于100支试管，即1块/支。
得率为：P=（1-95%）100=5块无菌材料 ❖ 200块材料，接种于100支试管，即2块/支。
P1（2污）=95% 95%=90.25% P2（1污1得或1得1污）=2 95%5%=9.5% P3（2得）=5% 5%=0.25% 若得到1支试管的无菌材料，至少要接种： 1/0.25%=400支，即接种800块材料，能得2块无菌 材料。 若按3块/支接种，需做8000支试管培养基，接入2.4万 块材料，才能有1支试管的（得3块）无菌材料。
pＨ值大小调整可用０.１Ｍ的ＮaＯＨ和０.１Ｍ的ＨＣl 来调整。１ml的ＮaＯＨ可使pＨ值升高０.２单位，１ml的 HCL可使值降低０.２单位。调节时一定要充分搅拌均匀。
六、气体
氧气是组织培养中必需的因素。 瓶盖封闭时要考虑通气问题，可用附有滤气膜的封口材 料。 通气最好的是棉塞封闭瓶口，但棉塞易使培养基干燥， 夏季易引起污染。固体培养基可加进活性炭来增加通气度,以 利于发根。 培养室要经常换气，改善室内的通气状况。 液体振荡培养时，要考虑振荡的次数、振幅等，同时要 考虑容器的类型、培养基等。
无论是离体培养繁殖种苗，还是进行生物技术研究，培 养材料的选择都要从主要的植物入手，选取性状优良的种质 或特殊的基因型。对材料的选择要有明确的目的，具有一定 的代表性，以提高成功的几率，增加其实用价值。
第二，选择健壮的植株；
组织培养用的材料，最好从生长健壮的无病虫的植株 上，选取发育正常的器官或组织。因为这些器官或组织代 谢旺盛，再生能力强，培养后比较容易成功。此现象可能 是由于外植体内部的植物激素水平能够在接种后得以维持 所致。
无菌操作可按以下步骤进行：
(1)在接种4h前用甲醛熏蒸接种室，并打开其内紫外灯进行灭菌； (2)在接种前20min，打开超净工作台的风机以及台上的紫外灯； (3)接种员先洗净双手，在缓冲间换好专用实验服，并换穿托鞋等； (4)上工作台后，用酒精棉球擦拭双手，特别是指甲处。然后擦拭 工作台面；
(5)先用酒精棉球擦拭接种工具，再将镊子和剪子从头至尾过 火一遍，然后反复过火尖端处，对培养皿要过火烤干；
第三，选择合适的部位；
植物组织培养几乎在植物体的各个部位都获得了成功， 这些部位包括：茎尖、茎段、皮层及维管组织、髓细胞、表 皮、块茎的储藏薄壁细胞、花瓣、根、茎、子叶、鳞茎、胚 珠和花药等。
但是不同种类的植物以及同一植物的不同器官对诱导条 件反应是不一致的，有的部位诱导分化率高，有的部位很难 脱分化，或者在分化频率很低。
第二节 外植体的消毒、接种
从外界或室内选取的植物材料，都不同程度地 带有各种微生物。这些污染源一旦带入培养基，便 会造成培养基污染。因此，植物材料必须经严格的 表面灭菌处理。
已消毒的外植体经无菌操作，接到培养基上， 这一过程叫做接种。
外植体接种的一般步骤：
外植体的修剪 流水冲洗 浸润灭菌 接种
完玻无菌1可2自至去..成璃菌将把操用来数不要需材，棒水已适水小作将用在要料当龙时准、、消，采的的切超的头。备手7毒接来部割0部刷下净好表的％到分成的子流分台消等外酒培仔适刷水植。或毒。植细当精养洗冲物接洗大的体。洗、基材种干小几烧经消上料净。箱分杯无毒。除，置钟内、液、
第四章 外植体的选择、消毒和接种