外植体的选择与培养
外植体选择的原则
外植体选择的原则外植体选取的原则是什么?1、选择优良的种质无论是离体培养繁殖种苗，还是进行生物技术研究，培养材料的选择都要从主要的植物入手，选取性状优良的种质或特殊的基因型。
对材料的选择要有明确的目的，具有一定的代表性，以提高成功的几率，增加其实用价值。
2、选择健壮的植株选取发育正常的器官或组织，再生能力强，组培易成功。
组织培养用的材料，最好是从生长健壮的无病虫的植株上选取发育正常的器官或组织。
因为这些器官或组织代谢旺盛，再生能力强，培养后比较容易成功。
此现象可能是由于外植体内部的植物激素水平能够在接种后得以维持所致。
3、选择适宜的部位植物组织培养几乎在植物体的各个部位都获得了成功，这些部位包括茎尖、茎段、皮层及维管组织、髓细胞、表皮、块茎的储藏薄壁细胞、花瓣、根、茎、子叶、鳞茎、胚珠和花药等。
但是不同种类的植物以及同一植物的不同器官对诱导条件反应是不一致的，有的部位诱导分化率高，有的部位很难脱分化，或者再分化频率很低。
4、选择适当的时期组织培养选择材料时，要注意植物的生长季节和生长发育阶段，对大多数植物而言，应在其开始生长或生长旺季采样，此时材料内源激素含量高，容易分化，不仅成活率高，而且生长速度快，增殖率高。
若在生长末期或已进入休眠期时采样，则外植体可能对诱导反应迟钝或无反应。
花药培养应在花粉发育到单核靠边期取材，这时比较容易形成愈伤组织。
百合在春夏季采集的鳞茎、片，在不加生长素的培养基中，可自由地生长、分化；而其他季节则不能。
叶子花的腋芽培养，如果在1～2月采集，则腋芽萌发非常迟缓；而在3～8月采集，萌发的数目多，萌发速度快。
对于大多数植物而言，应在其生长季节开始时采样。
在生长末期或已进入休眠期时取样，外植体可能对诱导反应迟钝或无反应，较难成活。
5、考虑器官的生理状态和发育年龄一般认为，生理年龄小的幼嫩组织较生理年龄大的成熟衰老组织具有较高的形态发生能力。
随着组织年龄的增加，器官的再生能力逐渐减弱甚至完全失去再生能力。
《植物组织培养技术》 知识清单
《植物组织培养技术》知识清单一、什么是植物组织培养技术植物组织培养技术是一种在无菌条件下，将植物的离体器官、组织或细胞等培养在人工配制的培养基上，使其生长、分化并发育成完整植株的技术。
这项技术的核心在于创造一个适宜的环境，让植物细胞能够像在体内一样进行分裂、生长和分化，从而实现植物的快速繁殖、品种改良以及基因工程等多种应用。
二、植物组织培养技术的基本原理植物细胞的全能性是植物组织培养的理论基础。
这意味着每个植物细胞都包含着该植物的全部遗传信息，在一定条件下具有发育成完整植株的潜力。
细胞分化则是细胞在发育过程中逐渐形成不同形态和功能的过程。
在组织培养中，通过调节培养基的成分和培养条件，可以控制细胞的分化方向，使其按照我们的需求发育成特定的组织或器官。
三、植物组织培养技术的流程1、外植体的选择与消毒外植体是指用于培养的植物器官、组织或细胞。
常见的外植体有茎尖、叶片、花药等。
在选择外植体时，要考虑其来源的植物品种、生长状态和健康程度。
消毒是非常关键的一步，通常使用酒精、升汞等消毒剂对外植体进行处理，以去除表面的微生物，确保培养过程不受污染。
2、培养基的配制培养基是为植物细胞提供营养和生长条件的物质。
它包含大量元素、微量元素、有机成分、植物生长调节剂等。
不同的植物种类和培养目的需要不同的培养基配方。
例如，诱导愈伤组织形成的培养基和诱导芽分化的培养基成分就有所不同。
3、接种在无菌条件下，将消毒后的外植体接种到培养基上。
操作过程要迅速、准确，避免外植体受到污染。
4、培养接种后的外植体需要在适宜的温度、光照和湿度条件下进行培养。
培养过程中要定期观察，及时处理出现的污染、褐化等问题。
5、诱导分化根据培养目的，通过调整培养基成分和培养条件，诱导外植体分化形成芽、根或愈伤组织等。
6、植株再生当分化形成的芽和根发育成熟后，将其转移到生根培养基上，促进根系的生长，最终形成完整的植株。
7、炼苗与移栽再生的植株需要经过一段时间的炼苗，使其逐渐适应外界环境。
外植体及消毒
灭菌(STERILIZATION)
6、培养室灭菌
熏蒸灭菌： 2ml/m3甲醛 + 0.2g/m3 高锰酸钾
新建培养室用前一定要彻底熏蒸1次； 隔2-5天用洗衣粉水或来苏水拖地1次，用高锰
酸钾擦架1次； 喷洒75%酒精灭菌降尘。
消毒(SANITIZATION)
消毒(Sanitization)：杀死、消除或抑制部分微生 物，使之不发生作用。
因此，外植体选择需要具有明确的目的，选择具有一 定代表性的基因型，以提高成功率及实用性。
外植体取材部位
不同种类的植物以及同一植物的不同器官对诱导 条件反应是不一致的，有的部位诱导分化率高，有 的部位很难脱分化，或者再分化频率很低，甚至只 分化出芽不长根或只分化出根而不长芽。 如百合科不同属的植物:风信子、虎眼万年青易于 再生形成小植株、而郁金香较难；同种百合鳞茎的 鳞片外层比内层再生能力强，下段比中上段再生能 力强。 对大多数植物来讲，茎尖是较好的部位，其形态 已基本建成，生长速度快，遗传性稳定，但易受材 料来源的限制。因此，茎段、叶片、花粉、胚珠等 材料也是常用的取材部位。
抗生素（ANTIBIOTIC）
烟草、西番莲的组培中发现，植株下部组织产生营养 芽的比例高，而上部组织产生花器官的比例高；木本 植物幼龄树的春梢嫩枝段或基部的萌条做外植体效果 较好。
外植体大小
外植体的大小，应根据培养目的而定。
如果是胚胎培养或脱毒，则外植体宜小；如果是进行 快速繁殖，外植体宜大。
但外植体过大，杀菌不彻底，易于污染；过小 离体培养难于操作、成活。
一般外植体大小在0.5—1.0cm为宜。具体说叶片、花 瓣等约为5mm2，茎段则长约0.5mm，茎尖分生组织带 一两个叶原基0.2—0.3mm大小等。
4 外植体的选择和灭菌
吐温的使用:0.1%,表面活性剂, 吐温的使用:0.1%,表面活性剂,浸润作用 无菌水: 无菌水:在用灭菌剂之前和之后均需用无菌水冲 洗数遍. 洗数遍.
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二,外植体的灭菌方法
具体的灭菌方法和步骤: 具体的灭菌方法和步骤:依不同的材料而不同
P61:图4-1 P61: 植物外植体消毒的一般程序
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第三节 外植体的接种和培养
二,外植体的接种
擦—冲—开—灭—切— 冲 开 灭 切 烧—取—烧—夹—放—烧—包 取 烧 夹 放 烧 包
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三,培养条件
温度:25±2℃; 温度:25±2℃; 光照:包括光照,光质和光周期; 光照:包括光照,光质和光周期; 培养基的pH:5.6-6.0;但若培养基中含有铁 培养基的pH:5.6-6.0;但若培养基中含有铁 pH:5.6 离子, pH应在5.2以下 应在5.2以下. 离子, pH应在5.2以下. 湿度:培养容器的湿度常保持在100%; 湿度:培养容器的湿度常保持在100%; 培养 室的湿度70 70室的湿度70-80%. 气体: 气体:氧;二氧化碳;乙烯等. 二氧化碳;乙烯等.
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Байду номын сангаас
外植体种类
带芽外植体 胚 分化器官, 分化器官,组织 花粉, 花粉,雌配子体中的单倍体细胞
3
外植体的部位选择
原则上可用植物的任何部位; 原则上可用植物的任何部位 但不同种类植物及同 一植物的不同部位对诱导条件反应不同; 一植物的不同部位对诱导条件反应不同 选择优良种 质,增殖能力强的外植体 外植体应容易得到 应考虑得到无毒苗 注意:外植体的幼化程度,年龄 与着生部位. 注意:外植体的幼化程度, 与着生部位. 易形成花器官. 植物主轴 向上的部分 生理年龄老 易形成花器官 向基部的部分 生理年龄小 易形成根等器官. 易形成根等器官 幼年组织较老年组织具有较高的形态发生能力
植物组织培养的完整过程
植物组织培养的完整过程1.选择适宜的母体植物：选择具有优良性状和抗病虫害能力的母体植物，从中选择健康的叶片、茎段等组织作为外植体。
2.外植体的准备：将母体植物采集的叶片或茎段进行无菌处理，去除表面杂菌和泥沙，然后用75%酒精或漂白粉消毒外表。
3.外植体的切割：将无菌环境下的外植体切割成小片，大小约为0.5-1cm，同时尽量保持外植体的干燥，以防止外植体内部水分过多。
4.外植体的接种：将切好的外植体小片接种在含有植物生长激素的无菌培养基上。
培养基通常由无机盐溶液、有机源、糖和植物生长激素等组成，植物生长激素的种类和浓度会影响到后续培养过程中的分化和增殖。
5.分化：外植体接种到培养基后，会经历分化阶段，外植体的组织逐渐增殖和分化为不同种类的细胞，形成生长点。
6.增殖：通过定期的次级培养，子培养、分生器、病毒消除等手段，将外植体中的细胞不断分化和增殖，以便大量生产幼苗。
7.再分化：经过增殖后的外植体，可以再次进行分化，形成茎尖、腋芽或花蕾等器官，以便进一步培养和繁殖。
8.根的诱导：在合适的培养条件下，外植体可以诱导生成根系，这是为了使外植体脱离体外培养环境，继续生长的必要步骤。
9.移栽：当幼苗的根系已经发达足够，可以将外植体移栽到含有适宜营养成分的固体培养基上或直接移植到土壤中，进行实地管理和生长。
10.过程控制：在整个培养过程中，要控制好环境条件，例如温度、湿度和光照等，以保证培养的成功率。
11.病毒清除：植物组织培养中经常伴随着病毒感染问题，可以通过不同的方法对外植体和培养基进行检测和清除，以保证获得健康的植株。
总的来说，植物组织培养是一个复杂的过程，需要严格的无菌操作和合适的培养条件。
它广泛应用于植物的繁殖、遗传改良、新品种选育以及病毒和细菌的清除工作中，对推动植物学研究和农业生产具有重要的意义。
植物细胞培养的原理
植物细胞培养的原理
植物细胞培养是通过无菌条件下将植物的组织或细胞分离培养在适当的培养基上进行培养的一种方法。
其原理主要包括以下几个方面。
1. 选择合适的外植体：外植体是指从植物体中取出的组织或器官，如茎尖、芽体、种子等。
合适的外植体应具有较高的再生能力和愈伤组织形成能力，能够在培养基中生长和分化。
2. 建立无菌培养条件：植物细胞培养必须在无菌条件下进行，以防止微生物的污染。
通过在实验室中进行严格的无菌操作，如使用无菌器具、灭菌培养基和无菌操作箱等，可以保证培养过程的无菌性。
3. 选择适当的培养基：培养基是植物细胞培养的基础，提供细胞所需的营养物质和生长因子。
根据不同的外植体和培养目的，可以选择不同种类的培养基，如MS培养基、B5培养基等。
培养基中通常含有碳源、氮源、植物生长调节剂等。
4. 调控生长因子的含量：植物细胞培养中的生长因子包括植物激素等，它们可以调控细胞的生长和分化。
通过合理调节生长因子的浓度和比例，可以促进细胞的再生和组织的发育。
5. 培养条件的控制：植物细胞培养需要控制适当的培养温度、光照和湿度等条件，以提供良好的生长环境。
这些条件的变化可以影响细胞的代谢活性和生长速率。
通过以上原理的应用，可以使植物组织或细胞在无菌培养条件下获得新的营养和生长环境，从而实现细胞分裂、再生和分化，为后续的研究和应用提供基础。
草莓组培
9、网纱大棚内繁殖。草莓病毒的传播主要 靠蚜虫、飞虱等虫媒传播。把无病毒苗放入 网纱内繁殖可防止蚜虫等传播病毒。网纱大 棚内土壤要经过严格消毒，并注意定期喷施 杀蚜虫药。网纱大棚内育苗与苗圃育苗大体 一致。
8、病毒鉴定和检验。草莓无病毒苗的鉴定检验 手段是采用小叶嫁接法、蚜虫接种鉴定法和电子 显微镜检测法。利用电子显微镜检测草莓病毒比 前两种更直观，而且速度快。其方法是利用负染 色法及超薄切片法处理待测叶片，然后在电子显 微镜下观察，如果被测叶片中含有较多病毒颗粒 子，可被直接观察到。经检验确认无毒的草莓苗 移入网纱大棚进行繁殖。
4、室内培养。培养室要求干净清洁，室内装有紫外线杀 菌灯，每天要对室内进行消毒，以防污染。培养温度2028℃，最适温度25℃，相对湿度70%，光照强度10002000勒克斯，每日光照10小时左右。
5、继代培养。每培养25-30天，培养瓶内的小植株就会分 出3-5个小植株，把这些小植株分出放于继代培养基内培 养；过20-30天后又会长出小植株，如此反复进行继代培 养，增加繁殖系数。 6、诱导生根。根据生产需要可在1-2月份集中一批苗子 生根。草莓试管苗生根很容易，有的在继代培养基上便 可生根。或者在培养基中加入0.5毫克/升的LBA，经30天 左右便可长出6-10条长约2-3厘米的小根。
7、温室驯化。把生好根的小苗经光照锻炼7-10 天，从试管内取出，洗净根部培养基，移栽入事 先准备好的营养土内，使其逐渐长大发出5-6片新 叶的过程称为驯化。驯化用的营养土要求土质以 疏松的沙土掺入少量有机质。移栽后要浇透水， 支小拱棚覆盖塑料薄膜保湿。驯化温度以15-20℃， 前两周空气相对湿度80-100%，第三周开始短时 间放风，放风强度逐渐加大，至移栽后第四周可 去掉覆盖物。根据情况每天或隔天喷水一次，保 持土壤湿润而不积水为宜。驯化一般需2-3个月即 可移出。经病毒鉴定，确认无毒后放入网纱大棚 内繁殖。
植物组织培养的工作流程
植物组织培养的工作流程
植物组织培养是一种常用的植物繁殖和研究方法，其工作流程包括以下几个主要步骤：
1.材料准备：选择适宜的原植物材料，如茎段、叶片、种子等作为外植体。
确保材料的新鲜性和无病原体污染。
2.表面消毒：将外植体进行表面消毒，以去除表面的微生物和杂质。
这可以通过在消毒剂（如酒精、次氯酸钠等）中浸泡、搅拌等方法进行。
3.分离和切割：根据实验需求，将外植体切割成适当大小的组织片段。
可以使用手工切割、离心分离或显微镜下的操作等方法进行。
4.培养基制备：制备适合植物生长和繁殖的培养基。
培养基通常包括基本盐、有机物、维生素、植物激素和其他添加剂。
根据实验需求可以调整培养基成分。
5.外植体接种：将分离和切割好的外植体进行培养基中的接种。
接种可以通过将外植体直接放置于培养基上或将其插入培养基中的凝胶（如琼脂）中进行。
6.培养条件控制：对培养的温度、光照、湿度和气体条件进行控制。
这些条件可以根据不同植物的生长习性和实验要求进行调整。
7.植物增殖和分化：在培养基中，外植体会通过分裂、再生和分化等过程进行植物增殖和不同类型的器官分化。
植物激素的添加和培养条件的调整可以影响生长和分化的过程。
8.增殖体移栽：将培养的增殖体转移到新的培养基或固体培养基中，以促进继续生长和发育。
9.实验分析：通过观察、记录和分析培养组织的生长情况、形态特征、遗传表达等参数，进行实验结果的分析和研究。
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细胞分裂素浓度较高时； 琼脂浓度低时； 温度低、光照时间长时； 气体交换不良时； 培养基中无机离子种类及比例不当时。
第三节 外植体的选择与培养
3、预防措施：
①适当控制培养基中无机营养成分； ②适当提高培养基中蔗糖和琼脂浓度； ③适当降低细胞分裂素和赤霉素浓度，增加生
长素量； ④增加自然光照，控制光照时间； ⑤降低培养温度，进行变温培养； ⑥增加容器通风，最好进行CO2施肥。
第三节 外植体的选择与培养
表面灭菌剂的种类较多，可选取1—2种使用。
常用灭菌剂使用浓度及效果比较表
灭菌剂 次氯酸钙 次氯酸钠
氯化汞 抗菌素
使用浓度(%)
9~10 2
0.1~1 4~50mg/L
持续时间 （min）
5~30 5~30 2~10 30~60
去除的难易
易 易 较难 中
效果
很好 很好 最好 较好
第1章 植物组织培养实验室 构建及操作技术
第三节 外植体的选择与培养
一、外植体的选择： 种质优良
选材
取材的最适时期
植株健壮 适宜的大小
第三节 外植体的选择与培养
二、外植体灭菌
1：对材料进行预处理 2：材料表面灭菌： 1）水洗,滤纸吸干; 2)70%酒精浸30～60s; 3）用灭菌剂处理; 4）用无菌水冲洗.
小麦试管苗
第四节、试管苗驯化与移栽
二、炼苗（驯化）
驯化的目的： 通过减肥、增光、降温、控水等措施，提高
试管苗对外界环境条件的适应性，提高光合 作用的能力，提高试管苗的移栽成活率。
第四节、试管苗驯化与移栽
三、试管苗的移栽
（一）移栽方法： 1、直接移栽法 2、常规移栽法 3、嫁接移栽法
第四节、试管苗驯化与移栽
第三节 外植体的选择与培养
（二） 外植体培养
外植体培养：指把培养材料放在培养室里，使之 生长，分裂和分化形成愈伤组织或进一步分化 成再生植株的过程。
第三节 外植体的选择与培养
培养的环境条件:
温度
光照
培养室 培养条件
氧气
湿度
第三节 外植体的选择与培养
定义：培养物在培养基上生长一段时间以后，由 于营养物质枯竭，水分散失，以及代谢产物 的积累，必须转移到新鲜培养基上培养,这个 过程叫做继代培养。
组织培养三大难题
玻璃化现象
第三节 外植体的选择与培养
（一）污染
1、污染原因 细菌污染 真菌污染
真菌污染
第三节 外植体的选择与培养
2、污染的预防措施
(1)减少或防止材料带菌 (2)外植体灭菌要彻底 (3)玻璃器皿和金属器皿的灭菌 (4)布质制品的灭菌 (5)无菌室的消毒 (6)操作人员一定要严格按照无菌操作的程序进 行接种。
芽根
试
根芽
管
苗
第三节 外植体的选择与培养
胚状体的产生途径：
(1)、直接从器官上发生 (2)、从愈伤组织发生 (3)、从游离的单细胞发生 (4)、从小孢子发生
诱导胚状体比诱导芽的优点：
(1)数量多 (2)速度快 (3)结构完整
第三节 外植体的选择与培养
五、培养过程中常出现的问题 及解决方法
污染
褐变
本章小结：
的紫外灯； (3)接种员先洗净双手，在缓冲间换好专用实验服，及拖
鞋等； (4)上工作台后，用酒精棉球擦拭双手。然后70%酒精喷
雾降尘，并擦拭工作台面； (5)先用酒精棉球擦拭接种工具，再将镊子和剪子蘸95%
酒精在酒精灯火焰上灼烧，放置冷却。
第三节 外植体的选择与培养
接种时的无菌操作技术：
(1)对接种材料进行消毒； (2)先解开包口纸，将试管等拿成斜角，使试管口在酒
第三节 外植体的选择与培养
四、外植体成苗途径ຫໍສະໝຸດ 1、外植体→愈伤组织→根、芽→试管苗 ①同时长芽和根 ②先长芽，再长根 ③先长根，再长芽 2、外植体→胚状体→试管苗（胚状体途径） 3、外植体→根、芽→试管苗（器官发生途径）
第三节 外植体的选择与培养
外植体成苗途径：
愈伤组织
根、芽
A
外植体 B
C
胚状体 芽、根
精火焰上方转动，灼烧数秒钟； (3)用灼烧过的镊子夹取外植体送入试管内，轻轻插入
或放在培养基表面； (4)接种完后，将管口在火焰上再灼烧数秒钟； (5)接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、
走动和咳嗽等； (6)接种工具随时蘸95%酒精灼烧，避免交叉污染； (7)接种完毕后要清理干净并用70%酒精擦工作台。
第三节 外植体的选择与培养
三、外植体的接种与培养
（一）接种—无菌操作 定义:把经表面灭菌处理后植物材料，切碎或分
离出器官、组织、细胞，再经无菌操作转接到 无菌培养基上，这一过程叫做接种。
第三节 外植体的选择与培养
接种前的准备工作：
(1)在接种前1-2周用甲醛熏蒸接种室； (2)接种前15-20min，打开超净工作台的风机以及台上
第三节 外植体的选择与培养
3、减轻褐变现象发生的措施
①选择合适的外植体： ②合适的培养条件： ③连续转移 ④加抗氧化剂： ⑤加活性炭
第三节 外植体的选择与培养
（三）玻璃化现象
1、定义：在长期的离体培养繁殖时，有些 试管苗的嫩茎、叶片呈现半透明水渍状， 这种现象称为玻璃化。
第三节 外植体的选择与培养
四、提高试管苗移栽成活率的途径
1、试管苗的生理状况：移栽壮苗 2、植物生长调节物质：适当加入生长素，去
除细胞分裂素，有利生根，提高成活率 3、无机盐浓度：适当降低 4、加入少许活性炭 5、控制好移栽前10天的光、温、湿环境因子 6、使试管苗从无菌向有菌逐渐过渡
第1章 植物组织培养实验室 构建及操作技术
第三节 外植体的选择与培养
（二）、外植体的褐变
1、定义： 是指外植体在培养中体内的多酚氧
化酶被激活，使细胞里的酚类物质氧化 成棕褐色的醌类物质，有时使整个培养 基变褐，从而抑制其他酶的活性，影响 材料的培养。
第三节 外植体的选择与培养
2、褐变的主要原因
①植物品种 ②生理状态 ③培养基成分 ④培养条件不当
第1章 植物组织培养实验室 构建及操作技术
第四节、试管苗驯化与移栽
草莓
试管苗
第四节、试管苗驯化与移栽
一、试管苗的特点
1、试管苗的生态环境： 高温且恒温、 高湿、 弱光、 无菌
百合试管苗
第四节、试管苗驯化与移栽
2、特点：(与常规苗相比）
(1)生长细弱； (2)光合作用差 (3)叶片气孔数目少，活性差 (4)根的吸收功能弱 (5)对逆境的适应和抵抗能力差