实验愈伤组织的继代与分化培养
实验四、愈伤组织的继代与分化培养
一、实验目的
学习愈伤组织的继代培养方法；巩固无菌操作技术；观察愈伤或培养物的再生情况及其形态特点。
二、实验原理
愈伤在生长一段时间后，由于营养、水分减少和代谢物等积累，使其生长减缓甚至变褐衰亡，须转接到新鲜培养基上进行继代培养或分化培养。
通常，生长素/细胞分裂素比值低利于芽的分化，高则利于根的分化。
将外植体或愈伤接种到激素配比适宜的培养基上培养，可以通过器官发生或体胚发生途径获得再生植株。
三、实验用品
器皿与设备同前；用实验三培养的甜瓜/烟草愈伤或子叶外植体，分化培养基（老师准备，同实验三）。
四、实验内容及操作方法
注意：四人一组，每组2-3瓶培养基；挑选培养物量大或者培养基少的优先转接。
1）超净工作台等准备工作：同前。
2）将三角瓶用75%酒精喷雾后放入超净工作台中，在酒精灯火焰前取下封口膜，用镊子将培养物夹取、转接到装有新鲜培养基的三角瓶中。
如果愈伤或子叶较大，或分化出根，则用镊子或剪刀将根切除，并将愈伤切割成0.5 cm见方的小块（在培养皿中进行），然后再进行转接。
3）封好瓶口，标好姓名和接种日期。
4）将接种后的三角瓶置于25℃、每天16 h光照和8 h黑暗条件下培养。
五、观察记载内容与实验报告
1、观察记载内容
每人接种数，4人小组接种总数；外植体/培养物的变化及其形态特征，再生情况；污染情况等。
每隔3天观察一次。
2、实验报告
1）实验目的 2）实验原理 3）实验方法：可用流程图表示 4）实验结果与分析
A. 描述培养物的变化及其形态特征；
B. 统计再生率与污染率，并对结果进行分析。
再生率=分化绿芽（不定根/小植株/胚状体）的愈伤或外植体数/接种总数×100%。
说明：实验报告每人一份，实验结果与分析如有抄袭，涉者均按不及格论处。
组织培养第三章 愈伤组织培养资料
2、操作程序
获取外植体材料－消毒处理－修整除去 坏死组织－切成5mm的圆柱形或方形小块－ 直放或倒放到培养基上－每9cm培养基接种5 －6块外植体－培养。 选用较大组织做材料时，可用打孔器 从块茎和块根中钻取一批圆柱型组织，切 成相同厚度的小圆片进行培养。
采用圆形的原因：
能得到外形简单结构相同的材料
第一节 愈伤组织的培养
愈伤组织培养是指将母体植株上的各个 部分切下，形成外植体，接种到无菌的培养 基上，进行愈伤组织诱导、生长和发育的一 门技术。 一般情况下，植物组织均能诱发形成愈 伤组织，由外植体形成愈伤组织，标志着植 物离体培养的开始。
一、愈伤组织的诱导 （一）诱导原理 1、细胞全能性 植物每一细胞具有全套遗传信息，在 特定环境下能进行表达，而产生一个独立 完整的个体。
（二）在园艺植物育种中的应用： 1、加快园艺植物新品种和良种繁育速度， 迅速高效低成本 2、培养无病毒苗木 3、获得倍性不同植株，易染色体核内加 倍育种有利用价值 4、克服远缘杂交困难 5、利于种质资源长期保存 6、提供育种中间材料 7、诱发和离体筛选突变体 8、制造人工种子
植物离体培养中的器官发生类型： 不定芽型—诱导顶端分生组织产生不定 芽，再生成植株的方式。顶芽、腋芽培养。 多数植物培养采用。
圆形的表面积大
圆柱形的外植体有利于组织块与外界进 行物质和气体交换；也使外植体表面促进愈 伤组织形成的分泌物较多，诱导率增高。
培养基
MS培养基 激素 IAA、NAA、2,4-D、BA 椰子汁、番茄汁、酵母提取物。
二、愈伤组织细胞的分化
单个细胞或一块外植体形成典型的愈伤 组织，大致经历三个时期，这三个时期中细 胞代谢、细胞数目、细胞形态均有明显差别。
细胞分化——持续细胞分裂增殖——原胚期— —球形胚——心形胚——鱼雷形胚——子叶期
草莓茎尖愈伤组织的诱导与增殖培养实验报告册
草莓茎尖愈伤组织的诱导与增殖培养实验报告册1、培养程序和培养基5--6月于晴天的下午在健壮、无病的草莓刚抽出的匍匐茎上取茎尖，大小为0.3--0.4mm，作为组织培养的外植体。
用于草莓茎尖培养诱导芽分化的基本培养基为MS，附加6-BA 0.5mg/L，NAA 0.2mg/L，蔗糖30g/L，琼脂粉6.5g/L，pH 值调至5.8--6.0。
在草莓茎尖的扩大繁殖阶段，采用MS 培养基附加6-BA 0.5mg/L 、NAA0.01mg/L。
扩大繁殖主要是将丛生苗分块即每5--7株切成一块，转入继代培养基。
在转苗过程中，去掉原生叶片有利于新苗分化，在扩大繁殖中随时清除愈伤组织，有利于新苗增殖和生长。
诱导生根培养基用1/2MS 附加。
经查文献得知0.1mg/L浓度的IBA处理的生根率最高，为100%，平均根条数为2.4条。
不加TBA及IBA浓度超过0.2mg/L，多数苗都是先于苗基切口处产生愈伤组织，随后在愈伤组织上分化生根，致使成活率大大降低。
2、操作技术要点及培养条件⑴)灭菌与接种预处理―为了灭菌彻底，常把接种材料先进行湿润处理，采用的是75%的酒精，湿润的时间为半分钟至1分钟。
灭菌处理在草莓组织培养中常用灭菌剂的种类很多。
我们曾用过次氯酸钠10%水溶液(含有效氯0.4--0.5%)，浸泡接种材料10--15分钟;次氯酸钙(漂白粉)，用其饱和上清液，浸泡接种材料15--30分钟;过氧化氢10--12%水溶液浸泡10--20 分钟;新洁尔灭5--10%水溶液，浸泡10--15分钟;升汞0. 1%水溶液，浸泡8--10分钟。
其中前4种灭菌剂对接种材料比较安全，但因灭菌时间较长，常常使接种材料的外层氧化变褐，以致影响培养效果。
升汞有很强的杀菌能力，但浸泡时间稍长会造成接种材料中毒。
因此，在草莓组织培养中，如把握好时间，升汞是应用较多的灭菌剂。
灭菌后的接种材料，要用无菌水充分清洗，通常要换水 3--5次。
接种以培养无病毒苗为主要目的的草莓组织培养，所接种的茎尖材料很小，在接种时首先要求准确熟练地剥取茎尖生长点，并使用固体培养基比较适宜，接种时应注意不能将整个茎尖埋入培养基中。
愈伤组织培养-3
一 、 Definition of callus
Callus consists of an amorphous (无 定形) mass of loosely arranged thinwalled (parenchyma 薄壁) cells
Wound callus on the stem of an Erythrina tree 刺桐树
等。这样才能得到足够数量的、无菌的、一致的、 适合于培养的外植体。
具体的操作过程： 无菌的块茎或块根，用钻孔器钻出一批同一类薄 壁组织圆柱形的组织，平行排列好。多把刀片等 距离地固定在一组金属片之间，一次切下去得到
许多个长短一致的圆柱形的外植体。
圆柱形大量地、准确地得到外形相同的外植体。 圆柱体的表面积大，利于组织块和外界气体和营 养物的交换。 外植体的损伤表面分泌物，具有促进愈伤组织形
1/0.25%=400支，即接种800块材料，能得2块无菌材
料。 若按3块/支接种，需做8000支试管培养基，接入2.4万块 材料，才能有1支试管的（得3块）无菌材料。
六、外植体的褐变及其防止措施
褐变
• 褐变是指外植体在培养过程中体内的 多酚氧化酶被激后活，使细胞内的酚类 物质氧化成棕褐色醌类物质，这种致死 性的褐化物不但向外扩散致使培养基逐 渐变成褐色，而且还会抑制其他酶的活 性，严重影响外植体的脱分化和器官分 化，最后变褐而死亡的现象
三、激素对愈伤组织分化的影响
植物生长调节物质在分化过程中的作用是极为 明显的，合适的植物生长物质配比在器官分化 中起着重要的作用。 如仙人掌科的金牛掌茎段培养中，当6-BA加倍 时，茎段的愈伤组织可以再分化出仔球，而6BA浓度过高(150倍)或过低(10倍)则无仔球形成。
器官分化的植物激素控制理论
愈伤组织的继代培养
实验
实验七七愈伤组织的继代培养
【目的要求】：1、掌握愈伤组织的继代培养方法
2、学习接种操作技术规范。
【实验内容】：1、70%乙醇喷洒净化工作台并擦洗干净，将接种所用的工具等放入工作台。
打开紫外灯，15分钟后关闭紫外灯开始方可操作。
打开风机吹风15分钟，
备用。
2、挑选生长旺盛的苜蓿愈伤组织（此类愈伤组织多呈白色或淡黄色，有光泽），
将其分割成直径约为0.5cm的小块。
3、将分割好的愈伤组织小块接种到新鲜的原培养基上，摆放均匀
4、培养：将培养瓶用封口纸包好，用记号笔写上姓名和接种日期,放在培养
室内25±2℃条件下暗培养。
【实验结果】：观察愈伤组织在继代培养基上的生长情况。
思考题：1．为什么要进行继代培养？
2．在进行愈伤组织继代培养中应注意的问题是什么？。
植物生物技术 愈伤组织的诱导继代及分化
⑶先芽后根： 愈伤组织中产生多个分生细胞形成分生中心，从中仅分化出芽，一般情况下待芽 长到一定大小时，切下移入生根培养基中，在其基部即可分化出根。有些植物在分 化芽的培养基上同时在芽器官基部分化出根，形成完整的植株。大多数植物均属这 类正常的分化途径，这类苗移栽较易成活。 ⑷先根后芽： 有些植物外植体脱分化后在愈伤组织上先分化出根，而后在靠近愈伤组织的根部 上再分化出芽，有的将根切下放入分化培养基，再于根上分化出芽器官，甚至在根 端也能分化出芽。
长素降低些，尤其是使用2，4-D时。 一般地，经过继代培养的愈伤组织在稳定生长1～2代后，具有S型生长曲线。开 始一周生长缓慢，中间3周生长很快，4周以后生长又变迟缓。
第二节 悬浮培养
悬浮培养:一般是把一些小块生长旺盛的愈伤组织
放入液体培养基中，进行振荡培养，从而使愈伤 组织块变成良好分散性的细胞和小的细胞聚集体。 愈伤组织通过悬浮培养能产生大量的比较均一 的细胞，而且细胞增殖速度快，适宜进行大规模
（1）三角烧瓶容纳的培养基占总容积的20%～30%，培养基含量可随培养物量的减 少而减少； （2）转速一般为80～100 r/min； （3）细胞或愈伤组织的生长呈典型的S型曲线，即延滞期（lag phase），对数生长 期（log phase），然后逐渐减慢，直至停止。
3、愈伤组织的生长特性
一般情况下，25℃下培养的愈伤组织需要每4~6周继代一次。大多数研究工作表
官。可以把愈伤组织分化出芽、根器官概括为以下几种方式：
⑴单极分化： 愈伤组织中的分生中心在刺激物质的影响下向着一极分化，形成有根无芽或 者有芽无根的现象。 ⑵双极分化： 愈伤组织中随着细胞分裂出现两个或两个以上分生中心，其中有的分化芽， 有的分化根，根芽之间并无输导等组织沟通，在培养瓶内靠愈伤组织提供养料， 这种以愈伤组织隔离着的芽和根的苗，常常不能移栽成活。
3 愈伤组织的培养
第三节愈伤组织的形态发生
一、不定芽方式（adventitious bud）
外植体 脱分化 愈伤组织 高生长素(1,2-D)
再分化
芽
低(生长素/细胞分裂素)
高(生长素/细胞分裂素)
根
再生植株
第三节愈伤组织的形态发生
愈伤组织的器官发生顺序有四种情况：
（ 1）愈伤组织仅有根或芽器官的分别形成，即 无根的芽或无芽的根； （2）先长芽，后长根，多数情况； （ 3）先长根，再从根的基部长芽。这种情况较 难诱导芽的形成，尤其对于单子叶植物； （ 4）先在愈伤组织的邻近不同部位分别形成芽 和根，然后两者结合起来形成一株植株。
从外表均一的外植体长出的愈伤组织，在开始阶 段是相当一致的，而从茎、根等器官切段上长出 的则是一个混杂的愈伤组织。
不同颜色的愈伤
第二节 愈伤组织的继代培养
1、定义：培养物在培养基上生长一段时间以后， 由于营养物质枯竭，水分散失，以及代谢产 物的积累，必须转移到新鲜培养基上培养,这 个过程叫做继代培养。
第二节愈伤组织的继代培养
2、愈伤组织培养的调控因素：
外植体 培养基 培养环境
第二节愈伤组织的继代培养
（一）材料本身
Photo indicating where the callus (c) arises from
第一节愈伤组织的诱导和分化
Wound callus on the stem of an Erythrina tree 刺桐树
二．愈伤组织的分化
• 从外植体脱分化形成 典型的愈伤组织大致 愈伤组织分化 可分为三个时期： 诱导期 分裂期 分化期
附：第五节 组织培养成苗
指把外植体放在培养室（有光照、 温度条件）里，成再生植株的过程。 外植体：1、带芽外植体
实验2-4胡萝卜愈伤组织的继代培养
及时继代
愈伤组织在培养过程中会逐渐老化， 为保证实验的准确性，应及时进行继 代培养。
03
实验结果与分析
实验结果
实验观察记录
在继代培养过程中，胡萝卜愈伤组织表现出良好的生长状态，细 胞分裂活跃，质地松软，颜色鲜艳。
显微镜观察
通过显微镜观察，发现细胞分裂旺盛，细胞排列紧密，呈现出典型 的愈伤组织结构。
在未来的实验中，我们可以尝试优化 培养条件，如温度、光照、湿度等， 以提高愈伤组织的生长速度和质量。
此外，我们还可以进一步研究愈伤组织在继 代培养过程中的基因表达和分子机制，为植 物组织培养和基因工程领域的发展做出贡献 。
我们可以通过添加植物激素或其他生 长因子来调节愈伤组织的生长和分化， 以实现更好的实验效果。
2. 制备培养基
按照MS培养基配方，添加适量的植物生长调节剂和糖， 搅拌均匀后倒入培养容器中，待培养基凝固。
3. 接种外植体
将准备好的外植体放置在培养基上，确保外植体与培养 基接触良好。
4. 培养条件
将培养容器放置在恒温、恒湿、无菌的环境中，保持适 宜的温度和光照条件。
5. 继代培养
经过一段时间的培养后，观察愈伤组织的生长情况，当 愈伤组织长满培养基时，将其切割成小块，重新接种到 新的培养基上，进行继代培养。
薄壁细胞团。
通过将愈伤组织进行继代培养， 可以保持其生长和分化能力，并 对其进行遗传转化、次生代谢产
物生产等方面的研究。
实验采用的培养基通常含有植物 生长调节剂、无机盐、维生素等 成分，以促进愈伤组织的生长和
分化。
实验背景
植物细胞培养技术是近年来发展迅速的生物技术领域之一，在农业生产、生物医药、 工业生产等方面具有广泛的应用前景。
胡萝卜愈伤组织的诱导与继代培养实验报告
本科学生综合性实验报告
学号姓名
学院生命科学学院专业、班级
实验小组及成员
实验课程名称植物组织培养实验
教师及职称龙维彪（讲师）
开课学期2011 至2012 学年下学期填报时间2012 年 6 月 1 日
云南师范大学教务处编印
一．实验设计方案
二．实验报告
1．实验现象与结果
A实验结果记录表：
愈伤组织诱导结果：
总接种瓶数5瓶总接种块数15块
污染瓶数4瓶污染块数11块
未污染瓶数1瓶未污染块数4块
未污染块中愈伤组织发生块数3块
愈伤组织发生率75%
愈伤组织发生情况记录愈伤组织的色泽较新鲜，但比较少
污染情况及原因分析污染瓶中，有1 瓶是霉菌污染，3瓶细菌污染。
可能是接种过程中接种器械消毒不够，掀开封口
膜时碰到了封口膜里面，也可能是封口膜没绑好。
愈伤组织继代培养结果：
继代培养没有受到污染，愈伤组织增殖情况较好，呈现不规则状。
颜色浅黄，注意看会有一些小黑点，愈伤组织开始老化，部分开始分化。
B实验结果图片。
胡萝卜愈伤组织培养及继代培养(实验报告)
本科学生综合性实验报告
学号：094120275 姓名：陈小华
学院：生命科学学院专业、班级：09应用生物教育B班实验课程名称：胡萝卜的愈伤组织诱导培养及继代培养
教师：杨世忠
开课学期：2011 至2012 学年第二学期填报时间：2012 年 5 月18 日
云南师范大学教务处编印
）无菌操作流程：
二．实验报告
图1胡萝卜愈伤组织诱导培养结果
2号瓶内的胡萝卜愈伤组织长势良好，1、3和4号瓶内胡萝卜均被
图2 胡萝卜愈伤组织继代培养结果
具体说明如表2：
表2 胡萝卜愈伤组织继代结果统计
2 存活瓶数 2
1号瓶内愈伤组织为Ⅱ型愈伤组织，其结构松脆，生长旺盛，
鲜艳，增值很快，称为亢进分裂型。
2号瓶内愈伤组织为Ⅰ型愈伤
组织，其结构致密，生长较慢，容易分化成苗，称为保守分裂型。
胡萝卜愈伤组织培养实验报告
植物细胞工程-胡萝卜的组织培养姓名：物理数学狂班级：生物技术综合班学号：2019004284【实验计划】1.MS培养基母液的配置与保存、MS固体培养基的配置（准备实验）2.外植体胡萝卜愈伤组织的诱导培养（2018.10.18）3.胡萝卜愈伤组织的继代培养（2018.11.8）4.胡萝卜愈伤组织悬浮培养（2018.11.22）5.胡萝卜愈伤组织诱导生根（2018.12.1）6.观察实验结果（2018.12.13）【实验时间】2018年10月18日-2018年12月13日实验（一）MS 培养基母液的配制与保存一、实验目的1.通过MS 培养基母液的配制，掌握配制培养基母液的基本技能；2.掌握培养基各种母液的保存方法。
二、实验原理1.MS 培养基的特点：①无机盐浓度高；②高含量的氮、钾，尤其是硝酸盐；③含有一定的铵盐，营养丰富；④不需要添加更多的有机附加物。
MS 按照营养水平划分为基本培养基。
2.培养基是植物离体培养组织和细胞赖以生存的营养物质，配置培养基时，为了减少试剂称取时的工作量出现的误差，以及多种营养成分混合导致沉淀产生或相互反应而失去培养效果，需要预先将各种营养成分配置为一定倍数的培养基母液，待使用时稀释到适合的浓度。
母液的浓度为培养基浓度的10倍、20倍、50倍、100倍等或更高。
3.需要时将配置好的母液按一定比例稀释到培养基指定浓度，再加入琼脂、蔗糖、生长调解物质等，制成符合要求的培养基。
三、器材与试剂1.器材：各类天平、磁力搅拌器、冰箱、烧杯、量筒、玻璃棒、试剂瓶、标签；2.试剂：95%酒精，0.1-1N NaOH ，0.1-1N HCl ，配制MS 培养基所需的各种无机物、有机物，蒸馏水。
四、方法步骤（一）母液的配制母液是欲配制培养基的浓缩液，一般配成比所需浓度高10—100倍。
优点：（1）保证各物质成分的准确性；（2）便于配置时快速移取；（3）便于低温保藏。
1.MS 大量元素母液（10×）称10升量溶解在1升蒸馏水中。