植物组织培养 第3章 植物组织培养技术愈伤组织的分化与再分化、脱分化及形态发生(2)
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3第三章 植物组织培养简介
dedifferentiation〕 2.脱分化〔dedifferentiation〕:已分化好
的细胞在人工诱导条件下，恢复分生能力， 的细胞在人工诱导条件下，恢复分生能力， 回复到分生组织状态的过程。 回复到分生组织状态的过程。
3.再分化 redifferentiation〕 3.再分化〔redifferentiation〕:
Folke Skoog(1908- )
1955年，Miller从DNA降解物中分离出6－呋喃 1955年 Miller从DNA降解物中分离出6 降解物中分离出 氨基嘌呤（激动素）， ），发现它诱导芽分化的效率比 氨基嘌呤（激动素），发现它诱导芽分化的效率比 腺嘌呤高3万倍。控制器官分化的激素模式变为激动 腺嘌呤高3万倍。控制器官分化的激素模式变为激动 生长素的比例关系 促进组培的发展。 的比例关系。 素／生长素的比例关系。促进组培的发展。
Gottlieb Haberlandt(1854-1946). He was the first to formulate clearly the principles of plant cell culture.
细胞全能性学说： 细胞全能性学说： 植物体中任何生活细胞都具有该 物种的全部遗传信息， 物种的全部遗传信息，具有相同的形态结构和一定的生理 功能。只要条件合适， 功能。只要条件合适，由一个单细胞就可以发育成为一个 新的个体。 新的个体。 该文还报道了几种植物的细胞和组织的培养实验，由 该文还报道了几种植物的细胞和组织的培养实验， 于当时的条件所限，都没有成功. 于当时的条件所限，都没有成功
第三章 植物组织培养 (tissue culture) 概述
第一节
植物组织培养的意义
植物组织培养概念(重点 重点) 一、植物组织培养概念 重点 植物组织培养理论基础(难点 难点) 二、植物组织培养理论基础 难点 植物组织培养类型(难点 难点) 三、植物组织培养类型 难点 植物组织培养特点(重点 重点) 四、植物组织培养特点 重点
的细胞在人工诱导条件下，恢复分生能力， 的细胞在人工诱导条件下，恢复分生能力， 回复到分生组织状态的过程。 回复到分生组织状态的过程。
3.再分化 redifferentiation〕 3.再分化〔redifferentiation〕:
Folke Skoog(1908- )
1955年，Miller从DNA降解物中分离出6－呋喃 1955年 Miller从DNA降解物中分离出6 降解物中分离出 氨基嘌呤（激动素）， ），发现它诱导芽分化的效率比 氨基嘌呤（激动素），发现它诱导芽分化的效率比 腺嘌呤高3万倍。控制器官分化的激素模式变为激动 腺嘌呤高3万倍。控制器官分化的激素模式变为激动 生长素的比例关系 促进组培的发展。 的比例关系。 素／生长素的比例关系。促进组培的发展。
Gottlieb Haberlandt(1854-1946). He was the first to formulate clearly the principles of plant cell culture.
细胞全能性学说： 细胞全能性学说： 植物体中任何生活细胞都具有该 物种的全部遗传信息， 物种的全部遗传信息，具有相同的形态结构和一定的生理 功能。只要条件合适， 功能。只要条件合适，由一个单细胞就可以发育成为一个 新的个体。 新的个体。 该文还报道了几种植物的细胞和组织的培养实验，由 该文还报道了几种植物的细胞和组织的培养实验， 于当时的条件所限，都没有成功. 于当时的条件所限，都没有成功
第三章 植物组织培养 (tissue culture) 概述
第一节
植物组织培养的意义
植物组织培养概念(重点 重点) 一、植物组织培养概念 重点 植物组织培养理论基础(难点 难点) 二、植物组织培养理论基础 难点 植物组织培养类型(难点 难点) 三、植物组织培养类型 难点 植物组织培养特点(重点 重点) 四、植物组织培养特点 重点
组织培养第三章 愈伤组织培养资料
2、操作程序
获取外植体材料－消毒处理－修整除去 坏死组织－切成5mm的圆柱形或方形小块－ 直放或倒放到培养基上－每9cm培养基接种5 －6块外植体－培养。 选用较大组织做材料时，可用打孔器 从块茎和块根中钻取一批圆柱型组织，切 成相同厚度的小圆片进行培养。
采用圆形的原因：
能得到外形简单结构相同的材料
第一节 愈伤组织的培养
愈伤组织培养是指将母体植株上的各个 部分切下，形成外植体，接种到无菌的培养 基上，进行愈伤组织诱导、生长和发育的一 门技术。 一般情况下，植物组织均能诱发形成愈 伤组织，由外植体形成愈伤组织，标志着植 物离体培养的开始。
一、愈伤组织的诱导 （一）诱导原理 1、细胞全能性 植物每一细胞具有全套遗传信息，在 特定环境下能进行表达，而产生一个独立 完整的个体。
（二）在园艺植物育种中的应用： 1、加快园艺植物新品种和良种繁育速度， 迅速高效低成本 2、培养无病毒苗木 3、获得倍性不同植株，易染色体核内加 倍育种有利用价值 4、克服远缘杂交困难 5、利于种质资源长期保存 6、提供育种中间材料 7、诱发和离体筛选突变体 8、制造人工种子
植物离体培养中的器官发生类型： 不定芽型—诱导顶端分生组织产生不定 芽，再生成植株的方式。顶芽、腋芽培养。 多数植物培养采用。
圆形的表面积大
圆柱形的外植体有利于组织块与外界进 行物质和气体交换；也使外植体表面促进愈 伤组织形成的分泌物较多，诱导率增高。
培养基
MS培养基 激素 IAA、NAA、2,4-D、BA 椰子汁、番茄汁、酵母提取物。
二、愈伤组织细胞的分化
单个细胞或一块外植体形成典型的愈伤 组织，大致经历三个时期，这三个时期中细 胞代谢、细胞数目、细胞形态均有明显差别。
细胞分化——持续细胞分裂增殖——原胚期— —球形胚——心形胚——鱼雷形胚——子叶期
植物组织培养技术第三章第四章植物器官的培养
及 取 材 消 毒 材 料 化 处 理 栽 种 养 移 接 培 驯
营养器官的培养——茎尖的培养 营养器官的培养——茎尖的培养
1、 取材 、
取1-2㎝顶梢 ①直接取材：在生长旺盛、枝 直接取材：在生长旺盛、 条健壮、 条健壮、无病的母株上选生 长不久、杂菌污染少的顶梢 长不久、 （1－2cm）（取前可喷杀菌 cm）（取前可喷杀菌 ）（ 药，可顶芽或侧芽）。 可顶芽或侧芽）。 ②从试管苗获取。 从试管苗获取。
第一节 一、离体根的培养 意义： （一） 意义： ①生理代谢研究的优良实验体系 ②研究器官分化形态建成的良好体系 ③建立快速生长的根无性系 ④进行诱变育种 营养器官的培养
营养器官的培养——根的培养 营养器官的培养——根的培养
（二） 培养方法 1. 培养基选择 White培养基；2/3或1/2 MS 和 B5培养基 培养基； 或 培养基 培养基 注：离体根生长要求 提供全部必需元素，蔗糖、硝态氮效果好， 提供全部必需元素，蔗糖、硝态氮效果好，加入 B1、B6最重要 生长素对离体根影响不一致。 最重要， B1、B6最重要，生长素对离体根影响不一致。培养 温度25 27℃，暗光培养。 25－ 温度25－27℃，暗光培养。
离 体 根
脱分化培养基
愈 伤 组 织
再分化培养基
分 化 芽
再 生 植 株
植物器官的培养
二、茎尖的培养
•1.茎尖培养概念及类型 1.茎尖培养概念及类型 1. •2.茎尖培养方法及步骤 2.茎尖培养方法及步骤 2.
营养器官的培养——茎尖的培养 营养器官的培养——茎尖的培养
（一）茎尖培养概念及类型
茎尖培养： 茎尖培养：切取茎的先端部分或茎尖分生组织部分，进行 无菌培养。 茎尖培养根据培养目的和取材大小可分为： 茎尖培养根据培养目的和取材大小可分为： 微茎尖培养: 微茎尖培养 带有1-2个叶原基的生长锥, 其长度不超过0.5mm 普通茎尖培养： 普通茎尖培养：较大的茎尖(如几mm到几十mm)、芽尖及侧芽 这里主要讲普通茎尖培养。这种培养技术简单，操作方便， 茎尖容易成活，成苗所需时间短
营养器官的培养——茎尖的培养 营养器官的培养——茎尖的培养
1、 取材 、
取1-2㎝顶梢 ①直接取材：在生长旺盛、枝 直接取材：在生长旺盛、 条健壮、 条健壮、无病的母株上选生 长不久、杂菌污染少的顶梢 长不久、 （1－2cm）（取前可喷杀菌 cm）（取前可喷杀菌 ）（ 药，可顶芽或侧芽）。 可顶芽或侧芽）。 ②从试管苗获取。 从试管苗获取。
第一节 一、离体根的培养 意义： （一） 意义： ①生理代谢研究的优良实验体系 ②研究器官分化形态建成的良好体系 ③建立快速生长的根无性系 ④进行诱变育种 营养器官的培养
营养器官的培养——根的培养 营养器官的培养——根的培养
（二） 培养方法 1. 培养基选择 White培养基；2/3或1/2 MS 和 B5培养基 培养基； 或 培养基 培养基 注：离体根生长要求 提供全部必需元素，蔗糖、硝态氮效果好， 提供全部必需元素，蔗糖、硝态氮效果好，加入 B1、B6最重要 生长素对离体根影响不一致。 最重要， B1、B6最重要，生长素对离体根影响不一致。培养 温度25 27℃，暗光培养。 25－ 温度25－27℃，暗光培养。
离 体 根
脱分化培养基
愈 伤 组 织
再分化培养基
分 化 芽
再 生 植 株
植物器官的培养
二、茎尖的培养
•1.茎尖培养概念及类型 1.茎尖培养概念及类型 1. •2.茎尖培养方法及步骤 2.茎尖培养方法及步骤 2.
营养器官的培养——茎尖的培养 营养器官的培养——茎尖的培养
（一）茎尖培养概念及类型
茎尖培养： 茎尖培养：切取茎的先端部分或茎尖分生组织部分，进行 无菌培养。 茎尖培养根据培养目的和取材大小可分为： 茎尖培养根据培养目的和取材大小可分为： 微茎尖培养: 微茎尖培养 带有1-2个叶原基的生长锥, 其长度不超过0.5mm 普通茎尖培养： 普通茎尖培养：较大的茎尖(如几mm到几十mm)、芽尖及侧芽 这里主要讲普通茎尖培养。这种培养技术简单，操作方便， 茎尖容易成活，成苗所需时间短
植物组织培养的核心步骤
植物组织培养的核心步骤
植物组织培养的核心步骤主要包括外植体的脱分化和再分化。
1. 外植体的脱分化形成愈伤组织。
在这个过程中，植物细胞会失去原有的组织结构和功能，转变为具有分生能力的细胞，进而形成愈伤组织。
2. 愈伤组织再分化形成胚状体。
在愈伤组织的基础上，通过调节培养基中的激素比例和其他环境因素，可以诱导愈伤组织分化成具有特定形态和功能的胚状体，这是植物组织培养中的关键步骤之一。
此外，植物组织培养还包括固体培养法和液体培养法等不同的培养方法。
固体培养法使用琼脂固化培养基来培养植物材料，而液体培养法则使用不加固化剂的液体培养基。
液体培养法中，通常需要通过搅动或振动培养液以确保氧气的供给。
以上信息仅供参考，如有需要，建议查阅植物组织培养相关文献或咨询植物学家。
植物组织培养技术所有名词解释
植物组织培养复习材料一、名词解释。
1、植物组织培养(plant tissue culture) :植物的离体器官、组织或细胞在人工制备的培养基上进行无菌培养，并在人工控制的环境条件下，使其发育成完整植株的科学技术2、脱分化(dedifferentiation ):指失去分裂能力的细胞回复到分生性状态并进行分裂，形成无分化的细胞即愈伤组织的现象。
3、再分化(redifferentiation ):愈伤组织形成不定芽或不定根或胚状体。
4、外植体(explant):植物组织培养过程中从活体植株上切去下来的用于离体培养的一切材料。
(如器官、组织、细胞、原生质体、种子等)5、愈伤组织(callus):原本指植物在受伤后于其伤口表面形成的一团薄壁细胞。
在组培中，则指人工培养基上由外植体形成的一团无序生长的薄壁细胞。
6、器官发生：胚胎时期由胚层器官原基发育成器官的过程。
包括细胞分化和器官形成。
7、胚状体发生：在植物细胞、组织或器官体外培养过程中，由一个或一些体细胞经过胚胎发生和发育过程，形成的与合子胚相类似的结构。
可进一步发育成植株。
8、细胞全能性(cell totipotency ):指植物的每一个细胞都携带有一完整的基因组, 并具有发育成完整植株的潜在能力。
9、细胞分化：一个尚未特化的细胞发育出特征性结构和功能的过程。
10、极性:细胞(也可指器官或植株)内的一端与另一端在形态结构和生理生化上的差异。
11、试管苗：通过组织培养产生的植株。
12、看护培养:是指用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，使其持续分裂和增殖的一种培养方法。
这块愈伤组织被称为看护组织。
13、固相化培养：将细胞或原生质体固着在琼脂糖、藻（月元）酸盐或多聚赖氨酸中，然后将他们放入液体培养基中震荡培养。
这种培养方法既利用了振荡培养室营养物质和气体易于交换的优点，有利用了固相化使细胞免受振荡时剪切力的作用。
14、悬浮细胞培养:将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增值的技术。
第三章 植物愈伤组织的诱导、继代及分化
⑶先芽后根：愈伤组织中产生多个分生细胞形成分生中心， 从中仅分化出芽，一般情况下待芽长到一定大小时，切下 移入生根培养基中，在其基部即可分化出根。
有些植物在分化芽的培养基上同时在芽器官基部分化出根， 形成完整的植株。大多数植物均属这类正常的分化途径， 这类苗移栽较易成活。
⑷先根后芽：有些植物外植体脱分化后在愈伤组织上先分 化出根，而后在靠近愈伤组织的根部上再分化出芽，有的 将根切下放入分化培养基，再于根上分化出芽器官，甚至 在根端也能分化出芽。
从单个细胞或外植体上脱分化形成典型的愈 伤组织，大致经历三个时期：
起动期：又称为诱导期,
是愈伤组织形成的起点。 外植体已分化的活细胞 在 外源激素的作用下，
通过脱分化起动而进入 分裂状态，并开始形成 愈伤组织。
起动期
分裂期
分裂期：外植体切口边缘开
始膨大，外层细胞通过一分 为二的方式进行分裂，从而 形成一团具有分生组织状态 细胞的过程。
二、从愈伤组织建立悬浮培养体系
多数悬浮培养物（suspension cultures）是将生长快、质地 疏松的愈伤 小块转移到与愈伤诱导含同样成分的液体培养 基里进行振荡培养而获得。
接种时必须有足够多的细胞块，以保证有较合适的细胞密 度。振荡速度一 般为 30-150rpm。
第一次继代时，应去掉开始时接入的大块细胞团——过滤。
第三节 愈伤组织分化与植株再生
体细胞胚胎发生：指从体细胞进行的类胚结构的生产。 体细胞胚是一个二极结构，不物理地附着于原组织，每一 个体细胞胚称为胚状体，它可以同 合子胚一样发育成植株。 器官发生：指从愈伤组织形成芽及根的过程，芽是一个单 极性结构，物理地同母体组织联结着。
细胞分化
无论是在离体还是在活体条件下，植物细胞分化 研究的重点是维管组织的分化，特别是木质部成 分的分化。
植物组织培养
Vc具有很强的还原能力， 常用于防止组织褐变。
（3）肌醇 又叫环己六醇，在糖类的相互转 化中起重要作用。 使用浓度：一般为lOOmg／L。 作用：适当使用肌醇，能促进愈 伤组织的生长以及胚状体和芽的形 成。对组织和细胞的繁殖、分化有 促进作用，对细胞壁的形成也有作 用。
（4）氨基酸 (almino acide） 作用：蛋白质的组成部分，也是一种有机氮化 合物。是很好的有机氮源，可直接被细胞吸收利用。 种类：最常用的是甘氨酸，其他的如精氨酸、 谷氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等 半胱氨酸及多种氨基酸的混合物（水解酪蛋白、水 解乳蛋白）等。
（11）再分化 经脱分化的组织或细胞在一定 的培养条件下可又转变为各种 不同细胞类型的能力。 （12） 分化培养 经过脱分化阶段的外植体（形 成愈伤组织），转移到另一培 养基上分化出芽（或小球茎） 或胚时，则称为分化培养，所 用的培养基为分化培养基。
（13） 增殖培养 已分化芽、小球茎或无性幼胚再继续进行增殖，即
1. 培养条件可人为控制，周年生产
植物组织培养中的植物材料完全是在人为提供的 培养基及小气候环境下生长的，摆脱了大自然中 四季、昼夜气温频繁变化及灾害性气候等外界不 利因素的影响，且条件均一、对植物生长极为有 利。因此植物组织培养不受气候和季节的限制， 可周年进行生产。
2. 生长周期短，繁殖速度快
植物组织培养可根据不同植物、不同器官、不同 组织的不同要求而提供不同的培养条件，满足其 快速生长的要求，缩短培养周期。一般20~30d就 完成一个繁殖周期.每一繁殖周期可增殖几倍到几 十倍,甚至上百倍,植物材料以几何级数增加。
3. 管理方便，可实现工厂化生产
植物组织培养是在人为的提供一定温度、光照、 湿度、营养和植物生长调节剂等条件下进行的， 不受自然界中病、虫、杂草等有害生物危害，生 产微型化、精细化、高度集约化，重复性强，便 于标准化管理和自动化控制，真正实现了种苗的 工厂化生产。与田间栽培、盆栽等相比，省去了 中耕除草、浇水施肥、病虫防治等一系列繁杂劳 动，可大大节省人力、物力及田间种植所需要的 土地。
（3）肌醇 又叫环己六醇，在糖类的相互转 化中起重要作用。 使用浓度：一般为lOOmg／L。 作用：适当使用肌醇，能促进愈 伤组织的生长以及胚状体和芽的形 成。对组织和细胞的繁殖、分化有 促进作用，对细胞壁的形成也有作 用。
（4）氨基酸 (almino acide） 作用：蛋白质的组成部分，也是一种有机氮化 合物。是很好的有机氮源，可直接被细胞吸收利用。 种类：最常用的是甘氨酸，其他的如精氨酸、 谷氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等 半胱氨酸及多种氨基酸的混合物（水解酪蛋白、水 解乳蛋白）等。
（11）再分化 经脱分化的组织或细胞在一定 的培养条件下可又转变为各种 不同细胞类型的能力。 （12） 分化培养 经过脱分化阶段的外植体（形 成愈伤组织），转移到另一培 养基上分化出芽（或小球茎） 或胚时，则称为分化培养，所 用的培养基为分化培养基。
（13） 增殖培养 已分化芽、小球茎或无性幼胚再继续进行增殖，即
1. 培养条件可人为控制，周年生产
植物组织培养中的植物材料完全是在人为提供的 培养基及小气候环境下生长的，摆脱了大自然中 四季、昼夜气温频繁变化及灾害性气候等外界不 利因素的影响，且条件均一、对植物生长极为有 利。因此植物组织培养不受气候和季节的限制， 可周年进行生产。
2. 生长周期短，繁殖速度快
植物组织培养可根据不同植物、不同器官、不同 组织的不同要求而提供不同的培养条件，满足其 快速生长的要求，缩短培养周期。一般20~30d就 完成一个繁殖周期.每一繁殖周期可增殖几倍到几 十倍,甚至上百倍,植物材料以几何级数增加。
3. 管理方便，可实现工厂化生产
植物组织培养是在人为的提供一定温度、光照、 湿度、营养和植物生长调节剂等条件下进行的， 不受自然界中病、虫、杂草等有害生物危害，生 产微型化、精细化、高度集约化，重复性强，便 于标准化管理和自动化控制，真正实现了种苗的 工厂化生产。与田间栽培、盆栽等相比，省去了 中耕除草、浇水施肥、病虫防治等一系列繁杂劳 动，可大大节省人力、物力及田间种植所需要的 土地。
第三章-愈伤组织诱导
第三章愈伤组织的诱导与培养第一节愈伤组织的诱导与继代培养愈伤组织（callus）: 在培养基上，由外植体经脱分化和细胞分裂形成的一团无序生长的薄壁细胞。
大部分外植体细胞须经脱分化形成愈伤，才能再分化成完整植株，只有茎尖等少数细胞只恢复为分生状态但不分裂，直接再分化。
愈伤组织的诱导与分化是植物组培的基本环节。
一、愈伤组织的诱导及其形态特征1、愈伤组织的诱导1）起动期/诱导期（initiation/induction stage, Induction of growth）外植体细胞在外源激素作用下，经脱分化而恢复分裂状态，开始形成愈伤。
细胞外观无明显变化，代谢旺盛，合成加强，为分裂做准备。
持续十几小时~几天。
2）分裂期（divition stage/phase）：外植体切口边缘膨大，外层细胞迅速分裂，体积变小，具分生细胞的特征，细胞数速增。
3）形成期（formation stage/Differentiation phase）：外植体表层细胞分裂减缓，内部细胞开始分裂，大量细胞形成瘤状/泡状或片状结构。
若不及时继代，将分化出拟分生组织瘤状物和维管组织，又称分化期。
2. 愈伤组织的形态特征质地：松脆易碎的颗粒状；紧密坚实的结块状；水渍或浆糊状。
颜色：白色或淡黄色；淡绿色或绿色；黄色至褐色。
一般，淡黄或淡绿/绿色松脆（近圆形）或致密的颗粒状愈伤再生能力较强，白色/灰白色或黄褐色、浆糊状或紧实（香蕉形）的愈伤再生能力差。
3. 影响愈伤诱导的关键因素愈伤的形成是外植体、培养基和培养条件诸因素互作的结果。
迄今，几乎从各种外植体诱导形成愈伤。
其关键主要不在于外植体，而是培养基，尤其是激素的种类和浓度。
生长素为愈伤诱导和增殖所必需，细胞分裂素视外植体来源而异。
二、愈伤组织的继代培养继代培养（subculture）：将原有培养物转移到新鲜培养基上继续培养的过程称为~。
愈伤组织在培养基上生长一段时间后，由于营养枯竭，水分散失，代谢物积累，致使其生长缓慢甚至停止，须进行继代培养。
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在进行器官分化培养时，加入一定量是有益的。
• （二）培养基
4 物理性质：固体或液体状态、渗透压等。
——对形态发生有明显的影响。
培养基状态：
第一阶段诱导形成愈伤组织——固体培养基 第二阶段细胞和胚状体的增殖——液体培养基 第三阶段胚状体发育成可移植植株——固体培养基
培养基渗透压：
对细胞增殖和胚状体的形成都有十分明显的影响。如 油菜花药培养宜先在高糖（9-10%）培养基中培养， 有利于细胞增殖和胚状体的形成。
2．胚状体方式 （somatic embryo） ——指由愈伤组织培养物诱导分 化出的胚芽、胚根、胚轴的胚状 结构，进而长成完整植株的方式。
四．愈伤组织形态发生的调控
愈伤组织的形态发生，主要受三大类 因素的调控：
• 外植体本身 • 培养基 • 培养环境
（一）材料本身
• 1．遗传型
不同植物种类的器官分化能力明显不同， 如烟草、胡萝卜和矮牵年等植物容易诱导器官形成， 而禾谷类、豆类、棉花等就比较困难。 通常同一种植物的不同器官或组 织所形成的愈伤组织，无论在生理上或形态上，其差 别均不大。但是对有些植物而言，确有明显差异。如 油菜的花器官比叶、根易于分化成苗，水稻和小麦幼 穗的苗分化频率也比其他器官为高。
• （三）培养环境条件
1.光周期的影响 ：根据植物种类、培养目的来决定
在愈伤组织诱导阶段：一般采用三种做法：全
暗、周期性光照、散射性光照。 对一些植物三种培养方法结果差异较大。如：石刁柏 全暗——诱导愈伤组织，要比周期性光照下好得多； 大豆散射性光照——愈伤组织诱导比较好。
器官发生阶段：一般给予周期性光照比较好。
• 2．器官和部位
• 3．生长年龄
年龄较幼的外植体，不仅易于诱导 形成愈伤组织，而且也容易诱导分化成植株。如油菜 植株的自下而上的茎段的培养结果表明，下部的器官 形成频率低，愈往上部，苗的分化频率越高。
• （二）培养基 1．生长调节剂：
细胞分裂素/生长素的比例是 控制芽和根形成的重要条件之一。
• 激素控制理论：细胞分裂素/生长素比例高时有利于芽
光周期长短因植物种类而异，多数植物8-10小时黑暗 为宜。也有例外，有些植物如石刁柏需要16小时光照， 12小时黑暗。
• （三）培养环境条件
2、温度
一般为22-25℃的恒温进行培养。
喜温性植物： 26-28℃
禾本科等。
茄科、葫芦科、兰科、
冷凉性植物： 25℃以下 百合科、十字花科、
菊科等。
培养周期中的昼夜温差影响：国内有关小麦、
• 诱导期的长短，因植物种类和外植体的生理状况和外 部因素而异，如胡萝卜的诱导期要好几天，新鲜的菊 芋块茎则只要22h，但菊芋块茎经过5个月的贮藏后， 诱导期则须延长到40h以上。
• 分裂期：细胞从开始分裂到持续分裂的时期
• 分裂期主要特征如下：
1.细胞的数目迅速增加，但平均鲜重下降。 2.细胞体积小，无液泡。如同根尖和茎尖的分生
胚轴的胚状结构。
外植体培养发育方向：
腋芽萌发（定芽）
脱分化后产胚状体（原球茎） 脱分化后直接产生不定器官
☆ 脱分化后形成愈伤组织
直接 离体 繁殖
间接离体繁殖
建立悬浮系或 分化胚状体及 不定芽
总结：From callus to plant
• 愈伤组织培养：
将外植体（explaut）在无菌条件下接种到培 养基上，进行愈伤组织诱导、生长和发育的一门 技术。
二．愈伤组织形成的过程
• 外植体中已分化的活细胞，在外源激素的 诱导下通过脱分化后形成愈伤组织，这一 过程被大致划分为三个时期:
• 诱导期 • 分裂期 • 形成期
• 诱导期：细胞分裂的准备期
• 特点： • 1、细胞大小没有多大变化，外观无明显 特征； • 2、细胞内物质代谢旺盛，RNA含量迅速 增加，细胞核体积明显增大。
形成；而这一比例低时，有利于根的形成。这样通过变换激 素的种类和浓度，即可有效地调节培养组织的器官分化。
• 不同激素的效果是不同的:如NAA对生根的作用比
IAA和IBA的效果好，但用IAA和IBA处理，产生的根比较健 壮，而用NAA处理，产生的根则较纤细。2，4-D往往利于愈 伤组织的诱导。
愈伤分化
三 愈伤组织的形态发生方式
• 愈伤组织分生细胞团可进行再分化，即进行形 态建成，可再产生完整的植株。
• 愈伤组织形态发生方式有两种： 1．不定芽方式（unfixed bud） 2．胚状体方式（somatic embryo）
1．不定芽方式（unfixed bud）
——指愈伤组织培养物，通过形成不定芽再生成 植株的器官发生方式。有三种方式： • （1）先形成芽，再在芽伸长后，在其茎的基部 长出根而形成小植株，多数植物属这种情况 • （2）先产生根，再从根的基部分化出芽而形成 小植株。这种情况较难诱导芽的形成，尤其对 于单子叶植物； • （3）先在愈伤组织的邻近不同部位分别形成芽 和根，然后两者结合起来形成一株小植株。
• （二）培养基
• 2．无机营养元素 在植物组织培养，细胞的
生长也要求满足植物生长的必要元素。
-----其影响不如激素的影响明显。 -----各种类型的植物所需要的每种元素的量，特别是大量元 素是有区别的，如生根培养要求无机离子浓度小一些，所以 常用1/2MS或White。 • 愈伤组织所表现出来的缺素症状如下：
• 1 、脱离母体植株：摆脱了原来所受到的遗传上
的控制和生理上的制约； • 2、一定的培养条件：主要为激素的种类和浓度最 为重要； （2，4-D） • 3、内源激素水平：外植体的类型和外植物体原来 在植株上所处的位置。
•
大量研究表明，几乎所有高等植物的各种器官，如根、 茎、叶和花等，以及各种组织，如皮层、茎髓和形成层等， 离体后在适当条件下，都能产生愈伤组织。
• 氮——某些组织（如五叶地锦）表现出一种很引入注目的花色素苷的颜色； 不能形成导管。 • 氮、钾和磷——细胞过度生长，形成层组织减退； • 硫——非常明显地褪绿。 • 铁——细胞分裂停止。 • 硼——细胞分裂停滞，细胞伸长。 • 锰或钼——影响细胞伸长。
• （二）培养基
• 3．有机成分
糖、B族维生素、肌醇和甘氯酸等—满 足愈伤组织的生长和分化的要求。 氯基酸和嘌 呤、嘧啶类物质—促进器 官分化。如：水解酪蛋白中含有多种氨基酸，
继代：将培养物转移到新鲜培养基上继续
培养的过程。
目的：愈伤组织始终处于旺盛的分裂期
• 脱分化细胞不断进行分裂，从而形成了愈伤组织，愈伤组 织在培养基上生长一段时间以后，由于营养物质枯竭，水 分散失，以及代谢产物的积累，如果让愈伤组织留在原培 养基上继续培养而不继代，它们则不可避免地发生分化， 产生新的结构。通过继代培养，可使愈伤组织无限期地保 持在不分化的增殖状态。
组织细胞特性。
3. 细胞的核和核仁增大到最大。 4．细胞中RNA含量减少，而DNA含量保持不 变。
• 形成期(分化期)：是指外植体经过诱导期和分裂期
后形成了无序结构的愈伤组织进行分化并形成器官的时期。
主要特征如下： • 1、细胞的平均大小相对稳定。 • 2、细胞分裂由原来局限在组织外缘分裂转为组织内 部较深层局部细胞的分裂。
原理：
• 细胞全能性（cell totipetency）：植物细胞具 有全套遗传信息，在特定环境条件下能进行表达， 而产生一个独立完整的植株个体。 脱分化：一个成熟细胞转变为分生状态的过程。 恢复细胞的分裂活性。 再分化：经脱分化的组织或细胞在一定的培养条 件下转变为各种不同细胞类型的过程。
一． 愈伤组织形成的条件
优良的愈伤组织的 特点
• 1、高度的胚性或再分化能力——以便从这些愈伤 组织得到再生植物。 • 2、容易散碎——以便用这些愈伤组织建立优良的 悬浮系，并且在需要时能从中分离出全能性的原生 质体。 • 3、旺盛的自我增殖能力——以便用这些愈伤组织 建立大规模的愈伤组织无性系。 • 4、经过长期继代保存而不丧失胚性——以便有可 能对它们进行各种遗传操作。
水稻花药培养温度试验的报道认为： • 诱导花形成愈伤组织——昼夜恒温较好； • 器官分化——昼夜具有一定温差比较好，分化出的小植 株比较健壮。 菊芋试验也有类似的报道。
复习思考题
1. 概念：愈伤组织培养 细胞全能性 胚壮体 2. 愈伤组织培养对外植体有何要求? 3. 愈伤组织的形态发生有哪两种方式？如何 进行调控？ 4．用激素控制理论解释愈伤组织的形态发生 方式。
第三章 植物组织培养技术
（愈伤组织的分化与再分化、脱分化，及形态发生）
•目的与要求：
1、了解愈伤组织形成的条件 2、掌握愈伤组织形成过程 3、掌握 愈伤组织的形态发生方式 4、了解愈伤组织形态发生的调控
植物组织培养类型 （按外植体）：
1. 器官培养 2. 茎尖分生组织培养 3. 愈伤组织培养 4. 细胞培养 5. 原生质体培养 胚状体：指由体细胞诱导分化出的胚芽、胚根、
• 3、形成分生组织结节。瘤状或片状的拟分生组织。
分生组织结节可以成为愈伤组织的生长中心。
• 4、形成维管组织结节。由分生组织结节外围的细胞
作平周分裂成为形成层状细胞，并形成了部分维管组织如管 胞、纤维细胞等，但不形成维管系统。
• 5、形成不同形态和功能的细胞。因此有人又将此期称
为分化期。
愈伤组织的继代培养
• （二）培养基
4 物理性质：固体或液体状态、渗透压等。
——对形态发生有明显的影响。
培养基状态：
第一阶段诱导形成愈伤组织——固体培养基 第二阶段细胞和胚状体的增殖——液体培养基 第三阶段胚状体发育成可移植植株——固体培养基
培养基渗透压：
对细胞增殖和胚状体的形成都有十分明显的影响。如 油菜花药培养宜先在高糖（9-10%）培养基中培养， 有利于细胞增殖和胚状体的形成。
2．胚状体方式 （somatic embryo） ——指由愈伤组织培养物诱导分 化出的胚芽、胚根、胚轴的胚状 结构，进而长成完整植株的方式。
四．愈伤组织形态发生的调控
愈伤组织的形态发生，主要受三大类 因素的调控：
• 外植体本身 • 培养基 • 培养环境
（一）材料本身
• 1．遗传型
不同植物种类的器官分化能力明显不同， 如烟草、胡萝卜和矮牵年等植物容易诱导器官形成， 而禾谷类、豆类、棉花等就比较困难。 通常同一种植物的不同器官或组 织所形成的愈伤组织，无论在生理上或形态上，其差 别均不大。但是对有些植物而言，确有明显差异。如 油菜的花器官比叶、根易于分化成苗，水稻和小麦幼 穗的苗分化频率也比其他器官为高。
• （三）培养环境条件
1.光周期的影响 ：根据植物种类、培养目的来决定
在愈伤组织诱导阶段：一般采用三种做法：全
暗、周期性光照、散射性光照。 对一些植物三种培养方法结果差异较大。如：石刁柏 全暗——诱导愈伤组织，要比周期性光照下好得多； 大豆散射性光照——愈伤组织诱导比较好。
器官发生阶段：一般给予周期性光照比较好。
• 2．器官和部位
• 3．生长年龄
年龄较幼的外植体，不仅易于诱导 形成愈伤组织，而且也容易诱导分化成植株。如油菜 植株的自下而上的茎段的培养结果表明，下部的器官 形成频率低，愈往上部，苗的分化频率越高。
• （二）培养基 1．生长调节剂：
细胞分裂素/生长素的比例是 控制芽和根形成的重要条件之一。
• 激素控制理论：细胞分裂素/生长素比例高时有利于芽
光周期长短因植物种类而异，多数植物8-10小时黑暗 为宜。也有例外，有些植物如石刁柏需要16小时光照， 12小时黑暗。
• （三）培养环境条件
2、温度
一般为22-25℃的恒温进行培养。
喜温性植物： 26-28℃
禾本科等。
茄科、葫芦科、兰科、
冷凉性植物： 25℃以下 百合科、十字花科、
菊科等。
培养周期中的昼夜温差影响：国内有关小麦、
• 诱导期的长短，因植物种类和外植体的生理状况和外 部因素而异，如胡萝卜的诱导期要好几天，新鲜的菊 芋块茎则只要22h，但菊芋块茎经过5个月的贮藏后， 诱导期则须延长到40h以上。
• 分裂期：细胞从开始分裂到持续分裂的时期
• 分裂期主要特征如下：
1.细胞的数目迅速增加，但平均鲜重下降。 2.细胞体积小，无液泡。如同根尖和茎尖的分生
胚轴的胚状结构。
外植体培养发育方向：
腋芽萌发（定芽）
脱分化后产胚状体（原球茎） 脱分化后直接产生不定器官
☆ 脱分化后形成愈伤组织
直接 离体 繁殖
间接离体繁殖
建立悬浮系或 分化胚状体及 不定芽
总结：From callus to plant
• 愈伤组织培养：
将外植体（explaut）在无菌条件下接种到培 养基上，进行愈伤组织诱导、生长和发育的一门 技术。
二．愈伤组织形成的过程
• 外植体中已分化的活细胞，在外源激素的 诱导下通过脱分化后形成愈伤组织，这一 过程被大致划分为三个时期:
• 诱导期 • 分裂期 • 形成期
• 诱导期：细胞分裂的准备期
• 特点： • 1、细胞大小没有多大变化，外观无明显 特征； • 2、细胞内物质代谢旺盛，RNA含量迅速 增加，细胞核体积明显增大。
形成；而这一比例低时，有利于根的形成。这样通过变换激 素的种类和浓度，即可有效地调节培养组织的器官分化。
• 不同激素的效果是不同的:如NAA对生根的作用比
IAA和IBA的效果好，但用IAA和IBA处理，产生的根比较健 壮，而用NAA处理，产生的根则较纤细。2，4-D往往利于愈 伤组织的诱导。
愈伤分化
三 愈伤组织的形态发生方式
• 愈伤组织分生细胞团可进行再分化，即进行形 态建成，可再产生完整的植株。
• 愈伤组织形态发生方式有两种： 1．不定芽方式（unfixed bud） 2．胚状体方式（somatic embryo）
1．不定芽方式（unfixed bud）
——指愈伤组织培养物，通过形成不定芽再生成 植株的器官发生方式。有三种方式： • （1）先形成芽，再在芽伸长后，在其茎的基部 长出根而形成小植株，多数植物属这种情况 • （2）先产生根，再从根的基部分化出芽而形成 小植株。这种情况较难诱导芽的形成，尤其对 于单子叶植物； • （3）先在愈伤组织的邻近不同部位分别形成芽 和根，然后两者结合起来形成一株小植株。
• （二）培养基
• 2．无机营养元素 在植物组织培养，细胞的
生长也要求满足植物生长的必要元素。
-----其影响不如激素的影响明显。 -----各种类型的植物所需要的每种元素的量，特别是大量元 素是有区别的，如生根培养要求无机离子浓度小一些，所以 常用1/2MS或White。 • 愈伤组织所表现出来的缺素症状如下：
• 1 、脱离母体植株：摆脱了原来所受到的遗传上
的控制和生理上的制约； • 2、一定的培养条件：主要为激素的种类和浓度最 为重要； （2，4-D） • 3、内源激素水平：外植体的类型和外植物体原来 在植株上所处的位置。
•
大量研究表明，几乎所有高等植物的各种器官，如根、 茎、叶和花等，以及各种组织，如皮层、茎髓和形成层等， 离体后在适当条件下，都能产生愈伤组织。
• 氮——某些组织（如五叶地锦）表现出一种很引入注目的花色素苷的颜色； 不能形成导管。 • 氮、钾和磷——细胞过度生长，形成层组织减退； • 硫——非常明显地褪绿。 • 铁——细胞分裂停止。 • 硼——细胞分裂停滞，细胞伸长。 • 锰或钼——影响细胞伸长。
• （二）培养基
• 3．有机成分
糖、B族维生素、肌醇和甘氯酸等—满 足愈伤组织的生长和分化的要求。 氯基酸和嘌 呤、嘧啶类物质—促进器 官分化。如：水解酪蛋白中含有多种氨基酸，
继代：将培养物转移到新鲜培养基上继续
培养的过程。
目的：愈伤组织始终处于旺盛的分裂期
• 脱分化细胞不断进行分裂，从而形成了愈伤组织，愈伤组 织在培养基上生长一段时间以后，由于营养物质枯竭，水 分散失，以及代谢产物的积累，如果让愈伤组织留在原培 养基上继续培养而不继代，它们则不可避免地发生分化， 产生新的结构。通过继代培养，可使愈伤组织无限期地保 持在不分化的增殖状态。
组织细胞特性。
3. 细胞的核和核仁增大到最大。 4．细胞中RNA含量减少，而DNA含量保持不 变。
• 形成期(分化期)：是指外植体经过诱导期和分裂期
后形成了无序结构的愈伤组织进行分化并形成器官的时期。
主要特征如下： • 1、细胞的平均大小相对稳定。 • 2、细胞分裂由原来局限在组织外缘分裂转为组织内 部较深层局部细胞的分裂。
原理：
• 细胞全能性（cell totipetency）：植物细胞具 有全套遗传信息，在特定环境条件下能进行表达， 而产生一个独立完整的植株个体。 脱分化：一个成熟细胞转变为分生状态的过程。 恢复细胞的分裂活性。 再分化：经脱分化的组织或细胞在一定的培养条 件下转变为各种不同细胞类型的过程。
一． 愈伤组织形成的条件
优良的愈伤组织的 特点
• 1、高度的胚性或再分化能力——以便从这些愈伤 组织得到再生植物。 • 2、容易散碎——以便用这些愈伤组织建立优良的 悬浮系，并且在需要时能从中分离出全能性的原生 质体。 • 3、旺盛的自我增殖能力——以便用这些愈伤组织 建立大规模的愈伤组织无性系。 • 4、经过长期继代保存而不丧失胚性——以便有可 能对它们进行各种遗传操作。
水稻花药培养温度试验的报道认为： • 诱导花形成愈伤组织——昼夜恒温较好； • 器官分化——昼夜具有一定温差比较好，分化出的小植 株比较健壮。 菊芋试验也有类似的报道。
复习思考题
1. 概念：愈伤组织培养 细胞全能性 胚壮体 2. 愈伤组织培养对外植体有何要求? 3. 愈伤组织的形态发生有哪两种方式？如何 进行调控？ 4．用激素控制理论解释愈伤组织的形态发生 方式。
第三章 植物组织培养技术
（愈伤组织的分化与再分化、脱分化，及形态发生）
•目的与要求：
1、了解愈伤组织形成的条件 2、掌握愈伤组织形成过程 3、掌握 愈伤组织的形态发生方式 4、了解愈伤组织形态发生的调控
植物组织培养类型 （按外植体）：
1. 器官培养 2. 茎尖分生组织培养 3. 愈伤组织培养 4. 细胞培养 5. 原生质体培养 胚状体：指由体细胞诱导分化出的胚芽、胚根、
• 3、形成分生组织结节。瘤状或片状的拟分生组织。
分生组织结节可以成为愈伤组织的生长中心。
• 4、形成维管组织结节。由分生组织结节外围的细胞
作平周分裂成为形成层状细胞，并形成了部分维管组织如管 胞、纤维细胞等，但不形成维管系统。
• 5、形成不同形态和功能的细胞。因此有人又将此期称
为分化期。
愈伤组织的继代培养