杜仲愈伤组织继代培养条件的优化
杜仲细胞悬浮培养及主要次生代谢物积累的研究的开题报告
杜仲细胞悬浮培养及主要次生代谢物积累的研究的开题报告第一部分：研究背景杜仲是一种重要的中药材，其干皮和根皮富含多种生物活性物质，包括三萜皂苷、多酚、黄酮等次生代谢物。
这些次生代谢物不仅具有极高的药用价值，在食品、化妆品等领域也有广泛的应用。
然而，由于杜仲树的生长速度非常缓慢，其资源受到了很大的限制。
为了解决杜仲资源短缺的问题，以及提高杜仲药用价值，研究人员采用细胞培养技术，通过培养杜仲细胞来获得大量杜仲次生代谢物。
目前，已有一些研究表明，通过细胞培养技术可以促进杜仲次生代谢物的积累。
然而，对于杜仲细胞的悬浮培养以及次生代谢物的积累机制还存在一定的不清楚之处。
第二部分：研究内容本研究的主要内容为，通过杜仲细胞的悬浮培养，探究不同培养条件对杜仲细胞的生长和次生代谢物积累的影响，进而分析杜仲细胞次生代谢物积累的机理。
本研究将从以下几个方面进行探究：1. 杜仲细胞悬浮培养条件的优化。
本研究将通过优化培养基成分、培养温度、培养pH值等因素，探究对杜仲细胞的生长状况和次生代谢物积累的影响，进而确定最佳培养条件。
2. 杜仲细胞次生代谢物的定量分析。
本研究将通过高效液相色谱技术（HPLC）及紫外光谱分析技术，对杜仲细胞培养产生的主要次生代谢物进行定量分析，从而确定最佳次生代谢物积累条件。
3. 杜仲细胞次生代谢物的积累机制探究。
本研究将通过细胞内酶活性测定、代谢组学分析等手段，探究不同培养条件下杜仲细胞次生代谢物积累的机制和途径。
第三部分：研究意义本研究旨在通过杜仲细胞的悬浮培养，探究不同培养条件对杜仲细胞次生代谢物的积累机制，从而为杜仲资源的有效利用和开发提供科学依据。
同时，本研究还有望推动植物细胞培养技术的发展，为其他中药材的研究提供参考。
第四部分：研究方法1. 培养杜仲细胞悬浮培养，并通过细胞计数仪定期监测其生长情况。
2. 通过高效液相色谱技术（HPLC）及紫外光谱分析技术，对杜仲细胞次生代谢物进行定量分析。
实验愈伤组织的继代与分化培养
实验四、愈伤组织的继代与分化培养一、实验目的学习愈伤组织的继代培养方法；巩固无菌操作技术；观察愈伤或培养物的再生情况及其形态特点。
二、实验原理愈伤在生长一段时间后，由于营养、水分减少和代谢物等积累，使其生长减缓甚至变褐衰亡，须转接到新鲜培养基上进行继代培养或分化培养。
通常，生长素/细胞分裂素比值低利于芽的分化，高则利于根的分化。
将外植体或愈伤接种到激素配比适宜的培养基上培养，可以通过器官发生或体胚发生途径获得再生植株。
三、实验用品器皿与设备同前；用实验三培养的甜瓜/烟草愈伤或子叶外植体，分化培养基（老师准备，同实验三）。
四、实验内容及操作方法注意：四人一组，每组2-3瓶培养基；挑选培养物量大或者培养基少的优先转接。
1）超净工作台等准备工作：同前。
2）将三角瓶用75%酒精喷雾后放入超净工作台中，在酒精灯火焰前取下封口膜，用镊子将培养物夹取、转接到装有新鲜培养基的三角瓶中。
如果愈伤或子叶较大，或分化出根，则用镊子或剪刀将根切除，并将愈伤切割成0.5 cm见方的小块（在培养皿中进行），然后再进行转接。
3）封好瓶口，标好姓名和接种日期。
4）将接种后的三角瓶置于25℃、每天16 h光照和8 h黑暗条件下培养。
五、观察记载内容与实验报告1、观察记载内容每人接种数，4人小组接种总数；外植体/培养物的变化及其形态特征，再生情况；污染情况等。
每隔3天观察一次。
2、实验报告1）实验目的 2）实验原理 3）实验方法：可用流程图表示 4）实验结果与分析A. 描述培养物的变化及其形态特征；B. 统计再生率与污染率，并对结果进行分析。
再生率=分化绿芽（不定根/小植株/胚状体）的愈伤或外植体数/接种总数×100%。
说明：实验报告每人一份，实验结果与分析如有抄袭，涉者均按不及格论处。
愈伤组织的继代培养
实验
实验七七愈伤组织的继代培养
【目的要求】：1、掌握愈伤组织的继代培养方法
2、学习接种操作技术规范。
【实验内容】：1、70%乙醇喷洒净化工作台并擦洗干净，将接种所用的工具等放入工作台。
打开紫外灯，15分钟后关闭紫外灯开始方可操作。
打开风机吹风15分钟，
备用。
2、挑选生长旺盛的苜蓿愈伤组织（此类愈伤组织多呈白色或淡黄色，有光泽），
将其分割成直径约为0.5cm的小块。
3、将分割好的愈伤组织小块接种到新鲜的原培养基上，摆放均匀
4、培养：将培养瓶用封口纸包好，用记号笔写上姓名和接种日期,放在培养
室内25±2℃条件下暗培养。
【实验结果】：观察愈伤组织在继代培养基上的生长情况。
思考题：1．为什么要进行继代培养？
2．在进行愈伤组织继代培养中应注意的问题是什么？。
实验愈伤组织的继代与分化培养
实验四、愈伤组织的继代与分化培养一、实验目的学习愈伤组织的继代培养方法；巩固无菌操作技术；观察愈伤或培养物的再生情况及其形态特点。
二、实验原理愈伤在生长一段时间后，由于营养、水分减少和代谢物等积累，使其生长减缓甚至变褐衰亡，须转接到新鲜培养基上进行继代培养或分化培养。
通常，生长素/细胞分裂素比值低利于芽的分化，高则利于根的分化。
将外植体或愈伤接种到激素配比适宜的培养基上培养，可以通过器官发生或体胚发生途径获得再生植株。
三、实验用品器皿与设备同前；用实验三培养的甜瓜/烟草愈伤或子叶外植体，分化培养基（老师准备，同实验三）。
四、实验内容及操作方法注意：四人一组，每组2-3瓶培养基；挑选培养物量大或者培养基少的优先转接。
1）超净工作台等准备工作：同前。
2）将三角瓶用75%酒精喷雾后放入超净工作台中，在酒精灯火焰前取下封口膜，用镊子将培养物夹取、转接到装有新鲜培养基的三角瓶中。
如果愈伤或子叶较大，或分化出根，则用镊子或剪刀将根切除，并将愈伤切割成0.5 cm见方的小块（在培养皿中进行），然后再进行转接。
3）封好瓶口，标好姓名和接种日期。
4）将接种后的三角瓶置于25℃、每天16 h光照和8 h黑暗条件下培养。
五、观察记载内容与实验报告1、观察记载内容每人接种数，4人小组接种总数；外植体/培养物的变化及其形态特征，再生情况；污染情况等。
每隔3天观察一次。
2、实验报告1）实验目的 2）实验原理 3）实验方法：可用流程图表示 4）实验结果与分析A. 描述培养物的变化及其形态特征；B. 统计再生率与污染率，并对结果进行分析。
再生率=分化绿芽（不定根/小植株/胚状体）的愈伤或外植体数/接种总数×100%。
说明：实验报告每人一份，实验结果与分析如有抄袭，涉者均按不及格论处。
一、请教关于水稻愈伤组织的问题
组培常见英汉对照abortion（败育）adenine（腺嘌呤）agar （琼脂）anther（花粉）apical（顶端的）aseptic(无菌的) auxin（生长素）axillary bud （腋芽）callus，calli（愈伤组织）cellular totipotency（细胞全能性）cellulase（纤维素酶）cellulose（纤维素）centrifuge（离心）chloroplast（叶绿体）chromosome doubling（染色体加倍）colony（细胞团，菌落）cybrid（cytoplasmic hybrid,胞质杂种）cytokinin（细胞分裂素）cytoplasm（细胞质）degeneration （败育）dedifferentiation （脱分化）redifferentiation（再分化）dicotyledonous（双子叶的）dihaploid（二单倍体）diploid （二倍体）dissect（剥离）dormancy（休眠）eliminate （除去）embryo（胚胎）embryoid（胚状体）embryogenesis（胚胎发生方式）epidermis（表皮，上表皮）excise（切除）explant （外植体）filter paper（滤纸）gelose（琼脂糖）genetype（基因型）germplasm（种质）global embryo （球型胚）haploid（单倍体）heterokaryon（异核体）homozygous（纯合的）hormone （激素）interspecific（种间的）intraspecific（种内的）in vitro（体外）in vivo（活体）kinetin（激动素）macerozyme（离析酶）male sterile（雄性不育）medium（培养基）membrane（膜）meristem（分生组织）meristem culture（茎尖培养）micropropagation（微繁）microspore（小孢子）monocotyledon/moncots（单子叶植物）nod culture （茎段培养）organelle（细胞器）organgenesis（器官发生方式）osmotic（渗透的）pith（髓）plantlet（小植株，苗）pollen culture （花粉培养）pollinate（授粉）protocorm（PLB）原球茎protoplast fusion（原生质体融合）rapid propagation（快繁）regeneration（再生）self-incompatibility （自交不亲和）shoot tip（茎尖）sodium hypochlorite（NaClO）somatic embryo（体细胞胚）somatic hybridization（体细胞杂交）somatic hybrid（体细胞杂种）stem（茎）stem tip culture（茎尖培养）sterilant（消毒剂）sterile distilled water（蒸馏水）sterilization（消毒）stock plant （母株）subculture (继代) sucrose（蔗糖）terminal bud（顶芽）transfer （转移）virus eradication（脱毒）常用缩略语ABA（脱落酸）CM（椰子汁）CPW（细胞-原生质体清洗液）DMSO（二甲基亚砜）IAA（吲哚乙酸）IBA（吲哚丁酸）KT（激动素）NAA（萘乙酸）PEG（聚乙二醇）LH（液氮）CH（水解酪蛋白）GA3（赤霉素）一、请教关于水稻愈伤组织的问题:我的水稻愈伤组织经过转化后，基本上不分化，听说TDZ能帮助分化，请问是用TDZ完全代替KT，还是按一定比例加入？还有就是在分化过程中还需要再加入潮霉素和羧苄吗？我用的水稻品系是台北309，以前的分化培养基为MS+0.5/l谷氨酰胺+0.5g/l脯氨酸+0.3g/l水解酪蛋白+2mg/l KT+0.5mg/l 6BA+0.2mg/l NAA+300MG/L羧苄+50MG/L潮霉素。
愈伤组织的继代培养
实验
实验七七愈伤组织的继代培养
【目的要求】：1、掌握愈伤组织的继代培养方法
2、学习接种操作技术规范。
【实验内容】：1、70%乙醇喷洒净化工作台并擦洗干净，将接种所用的工具等放入工作台。
打开紫外灯，15分钟后关闭紫外灯开始方可操作。
打开风机吹风15分钟，
备用。
2、挑选生长旺盛的苜蓿愈伤组织（此类愈伤组织多呈白色或淡黄色，有光泽），
将其分割成直径约为0.5cm的小块。
3、将分割好的愈伤组织小块接种到新鲜的原培养基上，摆放均匀
4、培养：将培养瓶用封口纸包好，用记号笔写上姓名和接种日期,放在培养
室内25±2℃条件下暗培养。
【实验结果】：观察愈伤组织在继代培养基上的生长情况。
思考题：1．为什么要进行继代培养？
2．在进行愈伤组织继代培养中应注意的问题是什么？。
植物愈伤组织培养的关键技术
植物愈伤组织培养的关键技术在现代农业中，植物愈伤组织培养技术广泛应用于种植业和植物育种中。
该技术通过培养和再生植物愈伤组织，可以实现快速繁殖、基因转化和育种改良等目的。
以下是植物愈伤组织培养中的关键技术：1. 材料准备：选择适宜的植物组织（如茎尖、叶片等）作为外植体，确保其健康和无病虫害。
外植体的选择对成功培养愈伤组织至关重要。
2. 外植体的消毒：使用适当的消毒方法，如漂白剂或酒精处理，以杀灭外植体表面的微生物。
3. 媒体配制：选择适宜的基础培养基，并添加必要的植物生长调节剂（如激素）和营养物质，以提供愈伤组织生长和分化所需的条件。
4. 培养条件控制：为愈伤组织提供适宜的光照、温度和湿度条件，以促进其生长和分化。
光照和温度的合理控制对于植物愈伤组织的培养成功至关重要。
5. 组织诱导和增殖：通过添加适当的激素和营养物质，诱导外植体形成愈伤组织，并通过继代培养，实现愈伤组织的快速增殖。
6. 分化和再生：通过调整培养基的成分和激素的添加量，促进愈伤组织分化为根、茎和叶等不同的组织器官，并进一步培养和培育出整株植物。
7. 病害防治：在愈伤组织培养过程中，要注意病害的防治，如消毒外植体、灭菌培养器具等，以避免病原微生物的侵染。
8. 营养调控：根据不同植物的营养需求和生长阶段的需要，合理调节培养基中的营养物质的含量和比例，以促进愈伤组织的生长和发育。
植物愈伤组织培养技术的成功与否，往往取决于以上关键技术的合理应用和控制。
这些技术的正确操作和调控，能够为植物育种和种植业的发展提供有力支持。
以上是关于植物愈伤组织培养的关键技术的简要介绍。
希望对您有所帮助！。
水稻愈伤组织诱导与之植株再生培养体系的建立
水稻愈伤组织诱导与之植株再生培养体系的建立1：研究的目的和意义1.1：研究的目的1.1.1. 以水稻成熟胚为外植体，寻求一个科学的实验方法，探讨愈伤组织的产生规律。
1.1.2. 用相同的培养方式对不同类型的籼稻品种和粳稻品种成熟胚进行组织培养，比较不同类型的水稻品种成熟胚愈伤组织诱导率之间的差异。
1.1.3. 通过植株再生培养体系,寻求提高水稻成熟胚的再生频率的方法，建立水稻不同种间成熟胚高效的培养体系。
1.2：研究的意义1.2.1. 水稻种子是水稻组织培养研究中使用最早的外植体,与其它外植体相比,种子胚具有再生周期短,再生植株育性好,取材不受生长季节的限制,灭菌容易,外植体均匀,重复性好等优点,因而是一种理想的研究材料。
但种子胚也存在诱导率不高,品种差异明显等限制因素[1]。
为了不断优化该体系的各个环节,人们做了大量研究,有关的研究报道也较多。
杨跃生等[2]以籼稻栽培种成熟胚诱导形成的愈伤组织为材料,对影响植株再生的一些因素进行了研究。
发现与N6相比MS培养基中的无机大量成分严重抑制再生植株根系生长,但MS的无机微量成份对诱导植株再生的效果则较明显。
较高浓度的BA利于诱导更多的植株再生,而较低的BA 浓度则利于壮苗和植株根系的形成。
增加诱导培养基或分化培养基中的渗透压和琼脂浓度,维代培养时加入适量的激动素或6-节基氨基嚓吟以及在分化培养基中加入活性炭、玉米素和AgNO3等均可提高水稻愈伤组织的分化成苗率[3]。
另有研究则发现脱水处理能有效促进水稻愈伤组织的植株再生[4-6]。
目前用于作物转基因的外植体,主要有胚性悬浮细胞系,成熟胚愈伤组织,幼胚及其愈伤组织,花药愈伤组织,分生组织盘,萌发的胚!叶或根,茎尖分生组织等,其中成熟胚具有取材方便,不受季节的限制,在转基因研究中有着较为广阔的应用前景，但是到现在为止,适合不同籼稻品种的有效组织培养体系还未建立,特别是釉稻品种成熟胚的组织培养效果很差,因此,严重影响了籼稻基因工程的开展，为此,进行籼稻愈伤组织的高频率诱导,胚性愈伤组织的保持及高频率绿苗分化的研究,是一项极其重要的水稻细胞工程和基因工程研究的基础工作，因此,研究籼稻成熟胚的组织培养特性,建立杂交水稻亲本成熟胚再生体系具有极其重要的理论和现实意义。
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收稿日期：２０１３－１０－２９基金项目：“十二五”农村领域国家科技计划课题（２０１２ＢＡＤ２１Ｂ０５０２）作者简介：金晓玲（１９６３－），女，浙江东阳人，教授，博士生导师，主要从事园林植物繁育技术方面的研究和教学工作。
Ｅ－ｍａｉｌ：ｊｘｌ０７１６＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ杜仲愈伤组织继代培养条件的优化金晓玲１，王 征１，伍江波１，刘雪梅１，杜红岩２（１．中南林业科技大学风景园林学院，湖南长沙４１０００４；２．国家林业局泡桐研究开发中心，河南郑州４５０００２）摘要：为了建立杜仲愈伤组织再生体系，为转基因研究提供平台，以成熟胚诱导的浅黄色愈伤组织和幼胚诱导的乳白色愈伤组织为材料，研究不同培养基、继代时间、继代次数对杜仲愈伤组织生长和不定芽诱导的影响。
结果表明：浅黄色愈伤组织继代培养后具有不定芽的分化能力，乳白色愈伤组织继代培养后褐化死亡；愈伤组织继代培养基为ＭＳ＋６－ＢＡ １．５ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ ０．０５ｍｇ／Ｌ，继代周期为１８ｄ；愈伤组织继代次数对愈伤组织增殖有显著影响，以继代４次的增殖倍数最高，达２．５；愈伤组织继代次数对不定芽的诱导有显著影响，以继代２次的愈伤组织不定芽诱导率最高，达到６６．７％，继代４次的愈伤组织不定芽的增殖系数最高，为３．２。
关键词：杜仲；愈伤组织；继代周期；增殖中图分类号：Ｓ５６７．１ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００４－３２６８（２０１４）０５－０１３８－０４Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｅｕｃｏｍｍｉａ ｕｌｍｏｉｄｅｓ ＣａｌｌｕｓＪＩＮ Ｘｉａｏ－ｌｉｎｇ１，ＷＡＮＧ Ｚｈｅｎｇ１，ＷＵ Ｊｉａｎｇ－ｂｏ１，ＬＩＵ Ｘｕｅ－ｍｅｉ １，ＤＵ Ｈｏｎｇ－ｙａｎ２（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌａｎｄｓｃａｐｅ Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ，Ｃｅｎｔｒａｌ Ｓｏｕｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｎｇｓｈａ ４１０００４，Ｃｈｉｎａ；２．Ｐａｕｌｏｗｎｉａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓｔａｔｅ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ ４５０００２，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ Ｅｕｃｏｍｍｉａ ｕｌｍｏｉｄｅｓ ｃａｌｌｕｓ，ｔｈｅ ｂｕｆｆ ｃａｌｌｕｓ ｆｒｏｍ ｍａｔｕｒｅｅｍｂｒｙｏｓ ａｎｄ ｃｒｅａｍ ｗｈｉｔｅ ｃａｌｌｕｓ ｆｒｏｍ ｙｏｕｎｇ ｅｍｂｒｙｏｓ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｍｅｄｉｕｍ，ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅｔｉｍｅ，ａｎｄ ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ ｔｉｍｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｃａｌｌｕｓ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ ｂｕｄ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄｔｈａｔ ｂｕｆｆ ｃａｌｌｕｓ ｈａｄ ｔｈｅ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ，ｔｈｅ ｃｒｅａｍ ｗｈｉｔｅ ｃａｌｌｕｓ ｆｒｏｍ ｙｏｕｎｇ ｅｍｂｒｙｏｓｄｉｅｄ ａｆｔｅｒ ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ．Ｔｈｅ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｃａｌｌｕｓ ｗａｓ ＭＳ＋６－ＢＡ １．５ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ０．０５ｍｇ／Ｌ ａｎｄ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ ｐｅｒｉｏｄ ｗａｓ １８ｄａｙｓ．Ｔｈｅ ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｌｌｕｓ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ａｆｆｅｃｔｅｄｂｙ ｔｈｅ ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ ｔｉｍｅｓ，ｔｈｅ ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｉｍｅｓ ｗａｓ ｈｉｇｈｅｓｔ ｗｉｔｈ ２．５ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ ｆｏｒ ｆｏｕｒｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓ，ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ ｂｕｄ ｗａｓ ａｌｓｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ａｆｆｅｃｔｅｄ ｂｙ ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ ｔｉｍｅｓ，ｔｈｅｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ ｂｕｄ ｗａｓ ｈｉｇｈｅｓｔ ｗｉｔｈ ６６．７％ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ ｆｏｒ ｔｗｏ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓ，ａｎｄ ｔｈｅｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｗａｓ ｈｉｇｈｅｓｔ ｗｉｔｈ ３．２ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ ｆｏｒ ｆｏｕｒ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓ．Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｅｕｃｏｍｍｉａ ｕｌｍｏｉｄｅｓ；ｃａｌｌｕｓ；ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ ｐｅｒｉｏｄ；ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ 杜仲（Ｅｕｃｏｍｍｉａ ｕｌｍｏｉｄｅｓ Ｏｌｉｖｅｒ）为杜仲科杜仲属的第三纪孑遗植物［１］，为国家二级保护植物［２］。
近年来，随着杜仲药用价值和杜仲胶功能等研究的深入，在全国范围内掀起了杜仲研究的热潮［３－６］。
利用组织培养技术进行杜仲新品种的繁殖研究正在展开［７－９］。
另外，杜仲有效成分绿原酸的合成途径以及关键合成酶的发现，使利用转基因技术获得有效成分含量高的杜仲新品种成为可能［１０］。
然而，稳定的杜仲愈伤组织再生体系是成功进行杜仲转基因技术研究的基础和前提。
本研究对杜仲愈伤组织继代培养条件进行筛选，旨在为杜仲转基因分子研究提供技术平台。
河南农业科学，２０１４，４３（５）：１３８－１４１ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅｎａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ１ 材料和方法１．１ 材料供试材料为以成熟胚为外植体诱导产生的浅黄色愈伤组织和以幼胚为外植体诱导的乳白色愈伤组织。
１．２ 方法１．２．１ 愈伤组织继代培养基的筛选 将２种愈伤组织切成０．５ｃｍ×０．５ｃｍ的均匀小块，接种在分别含有不同质量浓度ＮＡＡ、６－ＢＡ、２，４－Ｄ、ＴＤＺ的ＭＳ培养基上。
培养３０ｄ后，统计愈伤组织增殖倍数、色泽和生长情况以及褐化情况。
褐化率（％）指供试外植体培养后出现褐化的个体与外植体总数的百分比，增殖倍数以体积比计算。
１．２．２ 愈伤组织继代时间的确定 取浅黄色愈伤组织，切成０．５ｃｍ×０．５ｃｍ均匀小块，接种于培养基（ＭＳ＋６－ＢＡ １．５ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ ０．０５ｍｇ／Ｌ）上继代培养。
每隔３ｄ测定愈伤组织的质量，持续２７ｄ，计算增长量（ｇ／ｄ）并做出相应的愈伤组织增长曲线。
增长量＝（Ｗｎ－Ｗｎ－１）／Ｔ，其中，Ｗｎ是第ｎ次取样时愈伤组织质量，Ｗｎ－１是第ｎ－１次取样时愈伤组织质量，Ｔ＝３。
根据愈伤组织增长曲线，确定愈伤组织的适宜继代周期。
１．２．３ 继代次数对愈伤组织增殖和不定芽诱导的影响 将浅黄色愈伤组织，以１８ｄ为１个继代周期，进行愈伤组织的继代培养。
培养基为ＭＳ＋６－ＢＡ １．５ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ ０．０５ｍｇ／Ｌ。
分别选取继代２、４、６、８次的愈伤组织进行增殖培养，继代３０ｄ后观察生长情况并计算愈伤组织增殖倍数和褐化率。
分别选取继代培养２、４、６、８次的愈伤组织接种在ＭＳ＋６－ＢＡ １．０ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ ０．０５ｍｇ／Ｌ培养基上，进行不定芽的诱导。
３０ｄ后观察生长情况并统计不定芽的诱导率和增殖系数。
不定芽增殖系数＝不定芽的总数／产生不定芽的愈伤组织个数。
以上试验的培养条件为：光照强度２ ５００ｌｘ，光照时间１５ｈ／ｄ，培养温度（２５±２）℃。
每瓶３个愈伤组织，共６瓶，重复３次。
２ 结果与分析２．１ 不同培养基对愈伤组织增殖和生长的影响浅黄色愈伤组织接种在１－１２号和１９－２４号培养基上，乳白色的愈伤组织接种在１３－１８号培养基上。
愈伤组织培养３０ｄ后的增殖和生长情况见表１。
表１ 不同培养基对２种杜仲愈伤组织增殖和生长的影响编号６－ＢＡ／（ｍｇ／Ｌ）ＮＡＡ／（ｍｇ／Ｌ）２，４－Ｄ／（ｍｇ／Ｌ）ＴＤＺ／（ｍｇ／Ｌ）生长情况增殖倍数褐化率／％１ ０．５ ０．０５嫩绿，长势一般２．０ ３３．３２ ０．５ ０．１０嫩绿，长势一般１．７ ２２．２３ ０．５ ０．５０嫩绿，长势一般１．５ ３３．３４ １．５ ０．０５嫩绿，长势较好２．５ ３３．３５ １．５ ０．１０嫩绿，长势较好２．２ ７７．８６ １．５ ０．５０嫩绿，长势一般２．０ ５５．６７ ３．０ ０．０５黄绿，长势一般２．０ ６６．７８ ３．０ ０．１０黄绿，长势较差１．６ ８８．９９ ３．０ ０．５０嫩绿，长势一般１．３ ５５．６１０ ０．５嫩绿，长势一般１．７ ３３．３１１ １．５黄绿，长势较差１．５ ５５．６１２ ３．０黄绿，长势较差１．３ ６６．７１３ ０．５ １．０ ０ １００１４ ０．５ ２．５ ０ １００１５ １．０ １．０ ０ １００１６ １．０ ２．５ ０ １００１７ ２．０ １．０ ０ １００１８ ２．０ ２．５ ０ １００１９ １．０ ０．５嫩绿，长势较好２．０ ３３．３２０ ２．５ ０．５黄绿，长势一般１．４ ３３．３２１ １．０ １．０黄绿，长势较好１．８ ６６．７２２ ２．５ １．０黄绿，长势一般１．５ ５５．６２３ １．０ ２．０深绿，长势较好２．２ ６６．７２４ ２．５ ２．０长势差，褐化死亡０ ８８．９９３１ 第５期金晓玲等：杜仲愈伤组织继代培养条件的优化 由表１可以看出，浅黄色愈伤组织在单独使用６－ＢＡ时，愈伤组织可增殖，但增殖倍数较低，长势较差；随着６－ＢＡ质量浓度升高，增殖倍数逐渐降低，褐化现象逐渐加重。
在６－ＢＡ和ＮＡＡ搭配使用时，愈伤组织增殖倍数明显提高；６－ＢＡ１．５ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ ０．０５ｍｇ／Ｌ培养基中的愈伤组织增殖倍数最高，达到２．５，且生长较好，颜色嫩绿，质地较致密，有利于其进一步增殖和分化。
浅黄色愈伤组织在含ＴＤＺ和ＮＡＡ的培养基中生长状况不如含６－ＢＡ和ＮＡＡ的培养基。
乳白色愈伤组织在６－ＢＡ与２，４－Ｄ组合培养基中的生长状况不好，逐渐褐化死亡。
２．２ 继代周期对愈伤组织生长的影响由图１可以看出，杜仲愈伤组织的生长可分为３个时期：生长迟缓期（０～９ｄ）、对数生长期（９～２１ｄ）、生长稳定期（２１～２７ｄ）。
愈伤组织在生长１８ｄ左右出现１个拐点，表明这个拐点的时间为愈伤组织的最适继代周期。
图１ 培养时间对杜仲愈伤组织生长的影响２．３ 继代次数对愈伤组织增殖和不定芽诱导的影响２．３．１ 继代次数对愈伤组织增殖的影响 由表２可见，愈伤组织增殖倍数和褐化率与初始培养的愈伤组织继代次数有显著关系。
在愈伤组织继代次数较少时，愈伤组织增殖倍数随继代次数增加而增加，褐化率也逐渐降低，其中，以继代４次的愈伤组织为材料培养生长状况最好，增殖倍数达到２．５，褐化率表２ 继代次数对杜仲愈伤组织增殖的影响继代次数增殖倍数生长情况褐化率／％２ ２．２嫩绿，长势一般１１．１４ ２．５嫩绿，长势一般０６ ２．１黄绿，长势一般２２．２８ １．７黄绿，长势一般４４．４为０；随着继代次数继续增加，愈伤组织增殖倍数逐渐下降，褐化率逐渐提高，继代８次的愈伤组织增殖倍数仅为１．７，褐化率也上升到４４．４％。