米曲霉种曲培养条件的优化
沪酿3.042米曲霉产中性蛋白酶条件的优化
沪酿3.042米曲霉产中性蛋白酶条件的优化阚清华;汤斌;张庆庆;张海龙【摘要】选择了8种影响因子利用Plackett-Burman设计法,对影响沪酿3.042米曲霉产蛋白酶的主要影响因子进行筛选,试验结果表明,影响该菌产蛋白酶的主要因子为培养温度、初始pH和料水比.利用最陡爬坡试验研究了其逼近最大响应区域,采用响应面法(RSM)对产酶条件进行了优化,并得出菌株产蛋白酶的数学模型;通过对二次多项回归方程求解,得最适产酶条件:培养温度为22 ℃,初始pH为7.0,料水比为1∶0.8.优化后,酶活提高了38.3%.【期刊名称】《安徽工程大学学报》【年(卷),期】2010(025)002【总页数】4页(P26-29)【关键词】米曲霉;蛋白酶;响应面;优化【作者】阚清华;汤斌;张庆庆;张海龙【作者单位】安徽工程大学,微生物发酵安徽省工程技术研究中心,安徽,芜湖,241000;安徽工程大学,微生物发酵安徽省工程技术研究中心,安徽,芜湖,241000;安徽工程大学,微生物发酵安徽省工程技术研究中心,安徽,芜湖,241000;安徽工程大学,微生物发酵安徽省工程技术研究中心,安徽,芜湖,241000【正文语种】中文【中图分类】TQ925酱油是我国传统酿造制品,有着几千年的实践经验.纯菌种代替野生菌的成功应用,使得酱油实现了大规模工业化生产,原料蛋白质的利用率大大提高,从最初的50%左右提高到80%左右[1].特别是我国上海酿造科学研究所诱变获得的沪酿3.042米曲霉新株,成为我国酿造酱油的最主要菌种,它具有蛋白酶活力高,生长快,适应性强,安全无毒[2]等优点.随后有许多科研工作者为了获得产量更高的菌株,在沪酿3.042的基础上进行研究.孙春华等[3]研究了碳源、氮源对米曲霉的产酶影响;李秀婷等[4]对沪酿3.042在不同碳氮源及pH,温度下的进行最佳产酶的条件研究.本研究利用响应面分析法[5]对沪酿3.042的产酶条件进行分析,找出影响其产酶的显著条件,通过试验,找出其产酶的最佳条件.1 材料与方法1.1 试验菌种米曲霉(Aspergillus niger)沪酿3.042,由安徽味甲天食品酿造有限公司提供.1.2 培养基斜面培养基:将豆粕加水5倍煮沸,小火煮1 h,每1 000 g豆粕制成1000mL浓度为4～5°Bé豆汁、可溶性淀粉20 g、(NH4)2SO40.5 g、MgSO4◦7H2O 0.5 g 、KH2PO41 g、琼脂25 g 、pH 自然,121 ℃灭菌30 min;种子培养基:麸皮 80 g、面粉 10g、豆粕 10 g、水 90 g、pH 自然、121 ℃灭菌 30 min;发酵培养基:豆粕、麸皮、水、其他(草木灰、磷酸盐等)、121℃灭菌30 min[6](其配比根据不同试验来确定).1.3 单因素发酵试验在影响米曲霉产酶的诸多条件中,选取了不同原料配比、豆粕的颗粒度、培养温度、曲料的初始润水量、曲料的初始pH值、添加草木灰和添加磷酸盐(以磷酸根计)等因素对米曲霉产酶的影响做单因素试验.豆粕在115℃下干蒸15 min,再1∶1比例润水(或不同pH或不同浓度的磷酸盐的水溶液)30 min,再加入麸皮、草木灰等,放入剩余的水或水溶液再润水20 min后,121℃,30 min灭菌,接种,前18 h,30℃培养,之后在26℃下发酵66 h后测中性蛋白酶酶活[7].1.4 产酶条件优化在单因素试验的结果上,进行Plackett-Burman试验,确定爬坡路径,最终用SAS 8.2软件进行响应面条件优化.40℃下每分钟水解酪蛋白产生1 μ g酪氨酸,定义为一个蛋白酶活力单位.中性蛋白酶活力测定:Folin法[8].2 结果与讨论2.1 单因素试验原料配比试验[9],豆粕与麸皮配比为8∶2,7∶3,6∶4,5∶5,4∶6,3∶7;豆粕颗粒度试验[10],豆粕颗粒度分别为＜16目、16目、9目、6目、4目;培养温度对米曲霉产酶的影响[4],在产酶阶段分别放到18℃、20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃、32℃下培养;曲料的初始润水量指总原料和水的配比,分别为1∶0.6、1 ∶0.8、1∶1.0 、1∶1.2、1 ∶1.4;初始pH 对米曲霉产酶的影响[12],把pH 分别为 4.0、5.0、6.0 、7.0、8.0、9.0、10.0的水溶液加入到曲料中;草木灰[13]添加量分别为原料质量的0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和1.0%;添磷酸盐对米曲霉产酶的影响[12],原料的润水改用不同浓度的磷酸盐(0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05mol/L)水溶液处理后灭菌接种培养,测成曲中中性蛋白酶酶活.试验结果以测得中性蛋白酶酶活为参考值,得出每个因素产酶的最佳水平分别为:原料配比为豆粕∶麸皮比为4∶6;豆粕颗粒度为6目;产酶培养温度20℃;初始料水比为1∶0.8;初始pH7.0;草木灰添加量为培养基量0.4%;磷酸盐水溶液浓度为0.04moL/L.2.2 Plackett-Burman试验由单因素试验结果,根据Plackett-Burman试验设计得到的N=12试验组合(见表1).配制培养基,接种,发酵(每组3个平行样),以发酵终期的蛋白酶酶活为响应值Y,用于筛选主要影响因子.表1 Plackett-Burman试验结果RUN X1(料比)/(豆粕:麸皮)X2(颗粒度)/目X3(温度)/℃X4 X7(误差项)X5(初始润水量)/(料水比)X6(草木灰)/%(初始pH)X8(磷酸根)/(moL◦L-1)Y(酶活)/U 1 3∶7 ＜16 30 0 1:0.6 0 10 0.05 1207.3 2 3∶7 4 18 0 1:0.6 0 4 0.05 973.4 3 8∶2 4 30 0 1:1.4 0 4 0 251.1 4 3∶7 ＜16 30 0 1:0.6 0.8 4 0 1037.5 5 3∶7 4 18 0 1:1.4 0 10 0 1287.3 6 3∶7 4 30 0 1:1.4 0.8 4 0.05 419.5 7 8∶2 4 30 0 1:0.6 0.8 10 0 630.5 8 8∶2 ＜16 30 0 1:1.4 0 10 0.05 376.4 9 8∶2 ＜16 18 0 1:1.4 0.8 4 0.05 387.3 10 3∶7 ＜16 18 0 1:1.4 0.8 10 0 1243.3 11 8∶2 4 18 0 1:0.6 0.8 10 0.05 1780.9 12 8∶2 ＜16 18 0 1:0.6 0 4 0 1056.2由表2可以看出,对沪酿3.042产蛋白酶影响最大因素是培养温度、初始润水量、初始pH值,这3个因素对产酶影响较为显著,可信度高于95%.表2 因素、水平及影响效果因素 t值检验 Pr＞|t|概率重要性因素 t值检验 Pr＞|t|概率重要性X1料比 1.53418559 0.22537 4 X5初始润水量 -2.47604 0.089583 2 X2颗粒度 0.031577 0.976792 7 X3温度 -2.55358 0.083687 1 X4 误差项X6草木灰 0.316046 0.77268 6 X7初始pH 2.184659 0.116837 3 X8磷酸根 -0.3286 0.764056 52.3 爬坡试验根据Plackett-Burman试验结果分析确定爬坡路径.减少温度、料水比,同时增加初始pH对提高沪酿3.042产蛋白酶酶活有积极意义.因此将温度每次降低2℃,料水比每次减少20%,同时每次增加pH为1.0,其他次要影响因子固定在中心点水平,试验设计及结果见表3.在豆粕:麸皮为4∶6,豆粕颗粒度为6目,产酶培养温度为22℃,初始润水量为1∶0.8,草木灰添加量为0.4%,pH为7.0,磷酸根添加量为0.04mol/L 条件下沪酿3.042产中性蛋白酶酶活最高.表3 爬坡试验结果RUN X1(料比)/(豆粕:麸皮)X2(颗粒度)/目X3(温度)/℃X4X7(误差项)X5(初始润水量)/(料水比)X6(草木灰)/%(初始pH)X8(磷酸根)/(moL◦L-1)Y(酶活)/U 1 4∶6 6 18 0 1:0.4 0.4 5 0.04 22.7 2 4∶6 6 20 0 1:0.6 0.4 6 0.04 807.9 3 4∶6 6 22 0 1:0.8 0.4 7 0.04 1532.7 4 4∶6 6 24 0 1:1.0 0.4 8 0.04 1050.3 5 4∶6 6 26 0 1:1.2 0.4 9 0.04 830.62.4 响应面(RSM)条件优化通过Plackett-Burman试验和最陡爬坡试验结果分析,利用SAS8.2统计软件,设计Box-Beheken中心组合试验;试验因素及水平见表4,以发酵终期的蛋白酶酶活(U/g湿基)的平均值为响应值Y进行试验.试验设计及结果见表5.图1和图2为响应面分析的曲面图和等高线图.表4 Box-Beheken中心组合试验结果RUN X3(温度)/℃X5(初始润水量)X7(初始pH)Y(酶活)/U RUN X3(温度)/℃X5(初始润水量)X7(初始pH)Y(酶活)/U 1 20 1:0.6 7 1558.7 9 20 1:0.8 6 1856.5 2 20 1:1 7 2011.1 3 24 1:0.6 7 1247.5 4 24 1:1 7 1120.5 5 22 1:0.6 6 1399.7 6 22 1:0.6 8 1260.7 7 22 1:1 6 1077.0 8 22 1:1 8 1114.9 10 24 1:0.8 6 1564.2 11 20 1:0.8 8 2221.8 12 24 1:0.8 8 1337.1 13 22 1:0.8 7 1451.4 14 22 1:0.8 7 1439.1 15 22 1:0.8 7 1444.5表5 回归方差分析方差来源自由度平方和均方 F Pr＞F概率 RootMSE R-sequare一次项 3 709971.7 236657.2 13.74839 0.007521 6.4733 94.35%二次项 3 568876.9 189625.6 11.01613 0.012138交互项 3 179491.8 59830.58 3.475804 0.106689总回归 9 1458340 162037.8 9.41344 0.011854Box-Beheken中心组合试验结果以蛋白酶酶活为响应值,根据Box-Beheken设计表中温度、初始润水量、初始pH量,利用统计分析软件进行多元回归分析,得出蛋白酶活(U/g)依温度、初始润水量、初始pH量三元二次回归方程为Y1=1445-297.35X1-17.8875X2+4.6375X3+285.6375X21-144.85X1X2-148.1X1X3-246.1875X22+44.225X2X3+14.2625X23 ,表5中的F值检验显示,总回归达到显著.表明培养温度、初始润水量、初始pH这3个影响因素与蛋白酶活之间存在显著的回归关系.其中一次项、二次项、交互项较高,表明温度、初始润水量、初始pH量对蛋白酶酶活的影响是显著的.决定系数为94.35%,表明回归方程的拟合程度较好.图1、图2证实拟合面有真实的最大值,即各个具体因子都有一个最佳量.对上述蛋白酶酶活的回归方程求导,可得培养温度为22℃、初始润水量料水比为1∶0.8、初始pH为7.0,此时预测最大蛋白酶活为1532.6U/g.在此条件下,经3次重复试验验证,得到中性蛋白酶平均酶活为1549.8U/g,试验值与模拟值相差在2%以内,证实了沪酿3.042产酶酶活模型的可靠性.同时在优化前培养条件下,发酵得到蛋白酶活平均值为1120.5U/g.产酶条件优化后,沪酿3.042较优化前酶活提高了38.3%.图1 温度 X1、初始润水量X2、和初始pH值 X5两两浪酿产酶曲面图图2 温度 X1、初始润水量X2与初始pH值X5两两交互影响沪酿3.042产酶等高线图3 结论本试验在单因素试验的基础上找出每个单因素的最高水平值,在此基础上进行Plackett-Burman试验,试验结果表明培养温度、初始润水量、初始pH量这3个因素对产酶影响较为显著,由此结果再进行爬坡试验确定了3种因素的浓度范围.最终用SAS8.2软件进行Box-Beheken中心组合试验和多元回归分析对此实验结果进行了验证.产酶条件优化后,沪酿3.042酶活提高了38.3%.沪酿3.042的最佳产中性蛋白酶条件是:产酶培养温度为22℃,pH7.0,初始润水量为1∶0.8,原料豆粕对麸皮配比为4∶6,豆粕颗粒度为6目,添加草木灰量为0.4%,磷酸盐(磷酸根计)水溶液浓度为0.04mol/L.参考文献:【相关文献】[1] 贾爱娟.提高高盐稀态法酿造酱油原料蛋白质利用率及氨基酸出品率的研究[D].西北农林科技大学,2006:11-12.[2] 孟颢华.沪酿3.042米曲霉的纯化复壮[J].中国调味品,2001,7(269):7-9.[3] 孙春华,燕磊,常维山.不同碳源和氮源对米曲霉产酶影响的研究[J].西南农业学报,2007,20(5):986-990.[4] 李秀婷,赵进,鲁绯,等.米曲霉固态发酵产酶条件及酶活力研究[J].ChinaBrewing,2009,203(2):26-28.[5] 赵选民.试验设计方法.科学出版社[M],2006.[6] 贠建民,张卫兵,赵连彪.调味品加工工艺与配方[M].化学工业出版社,2007:108-109.[7] 林祖申.酱油生产技术问答[M].中国轻工业出版社,2000:29-30.[8] SB/T10317-1999,蛋白酶活力测定方法[S].[9] 陈阿娜,汤斌,张庆庆,等.根霉RhizopusspTC1产酶条件的研究[J].安徽工程科技学院学报:自然科学版,2006,21(4):20-22.[10]AshokPandey.RecentProcessdevelopmentsinsolid-statefermentation[J].processBiochemistry,1992(27):109-117.[11]叶勤.发酵过程原理[M].北京:化学工业出版社,2005:106.[12]葛向阳,田焕章,梁运祥.酿造学[M].北京:高等教育出版社,2006:124.。
米曲霉培养条件及培养基配方优化的研究
米曲霉培养条件及培养基配方优化的研究作者：宗玉梅林巧赵树东杨柳炜邓远均侯云境来源：《现代食品·上》2019年第03期摘要：本文利用单因素实验对米曲霉3.042培养基组成成分和培养条件进行优化，分别研究了培养基碳源含量、氮源含量、营养因子、加水量、培养温度、培养时间、初始pH对米曲霉生长情况的影响。
结果表明：蔗糖27g·L-1，硝酸钠2.5g·L-1，硫酸镁（MgSO4.7H20）0.6g·L-1，初始pH6.5，在30°C的环境下培养72h后，米曲霉生长得最好。
关键词：米曲霉3.042;单因素实验;培养基优化中图分类号：TS201米曲霉（Aspergillusoryzae）是中国传统发酵调味食品酱油酿造过程中使用的关键菌种之一，其产酶活力的高低会影响原料的利用率及产品的品质。
酱油的生产过程一般是原料处理、制曲、发酵、浸出淋油、加热灭菌、检测、包装等，在这些过程中，涉及各种微生物的作用。
因而近年来，越来越多的研究者对酱油酿造中的微生物群落进行研究，其中，霉菌是人们首要的研究对象，霉菌就有米曲霉、黑曲霉、红曲霉等。
米曲霉更是酱油酿造过程中的重中之重，它拥有极强分解蛋白质的能力和糖化淀粉的能力，在酿造酱油的过程中，就是用种曲培养米曲霉，等米曲霉不断繁殖大量后就会分泌出各式各样的酶，其中最多也最重要的就是淀粉酶和蛋白酶”。
鉴别产品品质、提高原料利用率及降低生产成本基本上是以把酶活性的高低作为参考之一。
实际上，提高米曲霉产蛋白酶活力不仅仅能够使原料的利用率得到提高，而且能够降低在酿造过程中对环境产生不良影响的概率，在工厂实际生产发挥了十分重要作用。
提高米曲霉产蛋白酶活力可以通过优化米曲霉培养基组成和培养条件实现。
1材料与方法1.1材料与试剂1.1.1菌种米曲霉3.042，由四川省生生酱园食品有限公司分离出的一株高产米曲霉。
1.1.2主要仪器及试剂电子天平（沈阳龙腾电子有限公司）、乐祺电子天平（上海瑶新电子科技有限公司）、手提式不锈钢压力蒸气灭菌器、生物显微镜B204LED（重庆奥特光学仪器有限公司）、电热恒温隔水式培养箱（黄石市恒丰医疗器械有限公司）、游标卡尺、苏净安泰洁净工作台、电子调温万用电炉（天津市泰斯特仪器有限公司）、四门双机双温冷柜（产品型号：QBSL-09S，耗电量5.0kW）、KQ5200DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。
纯种米曲霉AS3.042制曲黄豆酱的后发酵条件优化
纯种米曲霉AS3.042制曲黄豆酱的后发酵条件优化康蕾;刘素纯;胡茂丰【摘要】以黄豆为原料,通过纯种米曲霉AS3.042制曲,以氨基酸态氮含量为考察指标,采用响应面分析法优化黄豆酱的后发酵工艺条件.结果表明:黄豆酱后发酵期为40 d的最适保持温度为40.28℃,添加盐水的最佳浓度为9.66％(质量百分数),该浓度盐水的最适添加量为74.70％(体积百分数).采用该工艺条件发酵的黄豆酱,其氨基酸态氮含量为0.837 6 g/kg,与理论值(0.841 g/kg)接近.该工艺可运用于实际生产.【期刊名称】《食品与机械》【年(卷),期】2015(031)004【总页数】5页(P203-207)【关键词】米曲霉AS3.042;黄豆酱;氨基酸态氮【作者】康蕾;刘素纯;胡茂丰【作者单位】湖南农业大学食品科学技术学院,湖南长沙410128;食品科学与生物技术湖南省重点实验室,湖南长沙410128;湖南农业大学食品科学技术学院,湖南长沙410128;食品科学与生物技术湖南省重点实验室,湖南长沙410128;湖南农业大学生物科学技术学院,湖南长沙410128【正文语种】中文自然发酵是自制黄豆酱最常见的发酵方式，在工厂与实验室中多采用人工接种不同菌种的方式来获得不同口感的产品［1，2］。
最常见的制曲菌种为纯种米曲霉，其优势在于蛋白酶活力强［3］。
经过制曲阶段菌种分解大豆产生蛋白质、糖类等有机物，在加入盐水的制酱过程中，这些有机物会在酵母菌及乳酸菌等的作用下进行分解产生醇、醛、酸、酚、酯类物质。
其中氨基酸态氮含量［4］常作为评判酱品质的指标。
笔者［5］前期曾分别用米曲霉、高大毛霉、根霉、黑曲霉等菌种制曲制酱，发现米曲霉制曲酱的效果最好，其游离氨基酸含量为174.17mg/g（干基），挥发性物质种类多于其他3种酱，对香味有贡献的物质含量也最多，在香味和营养价值方面最理想。
吴兰芳等［6］曾对曲霉型豆豉制取工艺进行优化，但目前尚未有关于用响应面法优化纯种米曲霉AS3.042制曲黄豆酱后发酵条件的研究。
米曲霉培养条件及培养基配方优化的研究
米曲霉培养条件及培养基配方优化的研究作者：宗玉梅,林巧,赵树东,杨柳炜,邓远均,侯云境来源：《现代食品》 2019年第5期◎ 宗玉梅1,林?巧1,赵树东1,杨柳炜1,邓远均2,侯云境2(1.西昌学院,四川?西昌?615000;2.四川省生生酱园食品有限公司,四川?西昌?615000)Zong Yumei1, Lin?Qiao1, Zhao Shudong1, Yang Liuwei1, Deng Yuanjun2, HouYunjing2(1.Xichang University, Xichang?615000, China;2.Sichuan Shengshengjiangyuan Food Co., Ltd., Xichang?615000, China)摘?要:本文利用单因素实验对米曲霉3.042培养基组成成分和培养条件进行优化,分别研究了培养基碳源含量、氮源含量、营养因子、加水量、培养温度、培养时间、初始pH对米曲霉生长情况的影响。
结果表明:蔗糖27 g·L-1,硝酸钠2.5 g·L-1,硫酸镁(Mg SO4?7H2O)0.6 g·L-1,初始pH 6.5,在30 ℃的环境下培养72 h后,米曲霉生长得最好。
关键词:米曲霉3.042;单因素实验;培养基优化Abstract:The composition and culture conditions of Aspergillus 3.042 medium were optimized by single factor experiment, and the effects of carbon source content, nitrogen source content, nutrition factor, water addition, culture temperature, culture time and initial pH on the growth of Aspergillus are studied respectively. The results showed that Aspergillus 27 g·L-1 grew best when sucrose, sodium nitrate 2.5 g·L-1, ma gnesium sulfate 0.6 g·L-1, initial pH 6.5 and 72 h were cultured in 30 ℃ environment.Key words:Aspergillus 3.042; Single factor experiment; Medium optimization 中图分类号:TS201米曲霉(Aspergillus oryzae)是中国传统发酵调味食品酱油酿造过程中使用的关键菌种之一,其产酶活力的高低会影响原料的利用率及产品的品质。
米曲霉的制备
毕业论文课题名称米曲霉的制备姓名学号所在系制药与生物工程系专业年级P09生物制药指导教师职称讲师指导教师职称二O一二年六月八日摘要微生物在酱油生产制曲工艺和发酵过程中起着至关重要的作用，在高盐稀态发酵工艺过程中，培养良好的米曲霉菌种不仅可以提高酱油中总氮、氨基酸态氮含量和酱油风味,而且还可以提高原料利用率。
因此米曲霉种曲培养是生产优质酱油的有效保证。
本论文主要介绍米曲霉在不同阶段的扩大培养方法，包括试管菌种、锥形瓶菌种、种曲罐菌种、种曲等方面的培养方法及注意事项。
米曲霉培养温度为28～32℃,培养时间为72h,米曲霉生长最旺盛作用,此时,曲料的曲酶孢子数大于8×109个/g,蛋白酶活力可达1000mg/100g以上。
关键词米曲霉；温度；时间；试管菌种；三角瓶菌种；扩大培养目录引言 (1)1 菌种的种类 (1)1.1 米曲霉 (1)1.2 黑曲霉 (1)2 菌种的选择条件 (1)2.1 不产生黄曲霉毒素及其他真菌毒素 (1)2.2 酶系全、酶活力高 (2)2.3 对环境适应能力强，生长繁殖快 (2)2.4 酿制的酱油风味好 (2)3试管实验 (2)3.1 灭菌 (2)3.2 培养基的制备 (2)3.3 培养基的鉴别 (2)3.4 接种培养 (3)3.5 菌种的留选 (3)4 锥形瓶培养 (3)4.1 原料配比 (3)4.2 接种培养 (3)5种曲制备 (3)5.1 种曲原料要求 (3)5.2 做料前检查事项 (4)5.3 做料 (4)5.4 蒸料 (4)5.5 抽真空 (4)5.6 降温 (4)5.7 接种 (5)5.8 自动培养 (5)5.9 开罐 (5)5.10操作过程中应注意的问题 (5)6种曲的质量标准 (6)6.1感官特性 (6)6.1.1外观 (6)6.1.2香气 (6)6.1.3手感 (6)6.2孢子数的测定 (6)6.2.1样品的稀释 (6)6.2.2制片 (7)6.2.3观察计数 (7)6.2.4注意事项 (7)参考文献 (9)谢辞 (10)引言米曲霉是一类产复合酶的菌株，半知菌亚门，丝孢纲，属真菌中的一种常见种。
高产蛋白酶米曲霉培养条件的研究8...
摘要蛋白酶是活细胞产生的生物催化剂，应用十分广泛；米曲霉具有丰富的蛋白酶系，是美国食品与药物管理局和美国饲料公司协会公布的安全微生物菌株之一，也是国内酱油等发酵食品生产的主要菌株。
因此，提高米曲霉的蛋白酶活力对于发展轻工业、提高产品质量有重要意义。
本论文利用米曲霉沪酿3.042为出发菌株，通过紫外诱变筛选出一株中性蛋白酶活力较高的菌株，命名为米曲霉UV-16。
该菌株的遗传稳定性较好，并将出发菌株的中性蛋白酶活力由1996.5 U·g-1提高到2368.0 U·g-1，蛋白酶活力提高了18.6%。
实验对米曲霉UV-16的酶系进行了研究，发现该突变株其他酶系基本没发生改变。
实验研究了基质组分和发酵条件对米曲霉UV-16产中性蛋白酶的影响，通过单因素实验，我们确定了麸皮为碳源，豆粕为氮源，豆粕添加量20%，KNO3添加量0.8%，MgSO4添加量0.07%，Na2HPO4添加量0.14%，每10g培养基接种1×108个孢子，温度28℃，加水量为原料量的85%，发酵时间70h，pH自然，并且发现FeSO4对产酶有抑制作用。
经过单因素实验，蛋白酶活提高到2707.8U·g-1，酶活力在诱变的基础上提高了14.3%。
单因素实验后，对加水量、培养温度、培养时间、豆粕添加量、KNO3、MgSO4利用响应面分析法精确找出最优条件。
通过PB实验，确定了培养时间和豆粕添加量为主要影响因素；通过最陡爬坡实验，找到了响应面实验的中心点；再通过中心组合实验，确定了最佳的培养条件：培养基加水量为87%，豆粕添加量23.37%，KNO3添加量0.7%，MgSO4添加量为0.08%，Na2HPO4添加量0.14%，每10g培养基接种1×108个孢子，培养温度为29℃，培养时间67h。
米曲霉UV-16产中性蛋白酶的能力达到2824.9U·g-1，蛋白酶活力再次提高4.3%。
青稞酒曲微生物多样性分析及米根霉制曲条件优化
青稞酒曲微生物多样性分析及米根霉制曲条件优化袁亦舟;张伟国;徐建中【摘要】采用高通量测序和分离培养相结合的方法对青稞酒曲进行微生物多样性分析,分离培养酒曲中的优势微生物,制作青稞酒纯种曲.结果表明,酒曲中真菌主要有根霉属、曲霉属、线虫草属和酵母属,其中米根霉是酒曲中真菌的优势菌株,同时也是主要糖化菌;细菌主要有库克菌属、球菌属、芽孢杆菌属、微球菌属等.随后,在利用米根霉制作纯种曲时发现,培养温度30℃、麸皮青稞粉配比2∶1、料水比40％、培养时间72 h、种曲接种量3.5％时糖化酶活力为1 246.9 U/g,液化酶活力为61.4 U/g,比原曲酶活力分别提高了9.2、2.4倍.【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2018(044)005【总页数】7页(P39-45)【关键词】青稞酒曲;高通量测序;米根霉;条件优化【作者】袁亦舟;张伟国;徐建中【作者单位】江南大学生物工程学院,工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡,214122;江南大学生物工程学院,工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡,214122;江南大学生物工程学院,工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡,214122【正文语种】中文青稞酒是西藏地区的特色饮品，因西藏所具有的特殊地理因素和人文因素赋予了青稞酒独特的口感[1]。
曲为酒之骨，曲菌的繁殖和产酶将淀粉、蛋白质等分解，产生葡萄糖、氨基酸等营养物质和有机酸、高级醇等风味物质，对酒的品质和出酒率都有极大的影响[2]。
对酒曲中的微生物进行分析，对于筛选功能微生物，实现青稞酒的工业化生产有重要的意义。
最初研究酒曲中微生物的方法是传统的实验室分离培养法。
然而，酒曲中除了可培养的微生物之外，还存在着大量实验室无法培养的微生物，单纯依靠分离培养法不能反映出酒曲中真实的微生物菌群。
近年来分子生物技术成为研究微生物多样性的新的工具，但传统的微生物分离培养法仍然是分离获得优势菌种的重要方法[3]。
米曲霉GN―2菌株产中性蛋白酶固体发酵条件的优化
米曲霉GN―2菌株产中性蛋白酶固体发酵条件的优化摘要：对米曲霉（Aspergillus oryaze）GN-2菌株产中性蛋白酶固体发酵的条件进行优化。
单因素试验结果表明，米曲霉的固体适宜发酵条件为发酵原料麸皮∶豆粉为4∶1（质量比，下同），培养时间60 h，培养温度25 ℃，培养基加水量10 mL，接种量1×106个/mL孢子悬液2.0 mL，培养基起始pH 6.0，0.02%（NH4）2SO4溶液1 mL。
正交试验结果表明，在温度25 ℃、加水量20 mL、麸皮∶黄豆粉为4∶1、培养时间72 h的条件下酶活力最高，达1 016.9 U/g。
关键词：米曲霉（Aspergillus oryaze）；中性蛋白酶；产酶条件中图分类号：TQ925；Q93-33 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）07-1637-04Optimizing the Solid Fermentation Conditions of Neutral Protease fromAspergillus oryzae GN-2 StrainHUANG Yan，JU Lu-ning（Minbei V ocational and Technical College，Nanping 353000，Fujian，China）Abstract：The optimal solid fermentation conditions ofneutral protease from Aspergillus oryzae GN-2 strain was studied. The results of single factor test showed that the highest neutral protease activity was obtained under the conditions of wheat bran and soybean powder addition ratio 4∶1，fermentation time 60 h，temperature 30 ℃，water addition 10 mL，inoculum amount 2.0 mL 1×106 spores/mL spore suspension，the initial medium pH 6.0，0.02%（NH4）2SO4 1 mL. The results of orthogonal experiment showed that the highest neutral protease activity was obtained when the solid fermentation was carried out at 25 ℃for 72 h，water addition 20 mL and the addition ratio of wheat bran and soybean powder 4∶1，with the highest neutral protease activity of 1 016.9 U/g.Key words：Aspergillus oryzae；neutral protease；enzyme production conditions中性蛋白酶是指最适作用pH介于6.0～7.5的一类蛋白酶，能催化蛋白质肽键水解。
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5.酱油醅理化指标测定数据
五，小结
米曲霉菌种是酿造酱油品质优劣的 关键，本文通过一系列的研究表明 米曲霉的生命活动与其周围的环境 条件有密切的相关性。只有在适宜 的外界环境下，才能进行良好的生 长繁殖，产生人类所需的各种酶。
1.结论
本课题的实验研究表明米曲霉产蛋白酶的最佳 pH为7，最佳温度32℃，最佳培养时间为48小 时，。此外，在替代原料实验中，运用对照组 和实验组的数据对照，可以看出，啤酒糟：麸 皮=5:5与传统工艺培养的酶活基本一致，最后 根据酱油醅的理化指标分析，表明了用啤酒废 料替代原料的实践可行性。
在这样的一个经济快速发展的时代，人民生活 水平的提高,对酱油质量要求越来越高,需求量越 来越大,这与蛋白质资源缺乏的矛盾日益突出。 啤酒生产过程中产生了大量的废料，这些物质 大部分没有得到较好的利用，大多停留在原始 粗加工上，创利甚微，不但浪费资源，甚至会 污染环境。 对啤酒的废料的成分进行分析可知，废啤酒糟 中蛋白质含量为45%~50%，还有丰富的B族维 生素、有机磷、有机钙、铁等物质。
(5).米曲霉的替代原料培养 原料配比：（参照组）麸皮80% 面粉20% 水70%
四，实验结果与讨论
1.在不同初始pH下试验数据与讨论
2.不同温度下进行试验的数据与讨论
由图可看出，蛋白酶酶活力与其所处的温度有密切相 关，米曲霉产蛋白酶的最适温度为32℃。
3.不同培养时间条件下进行试验的数据与讨论
米曲霉种曲培养条件的优化
XXX 生物工程XXX班 指导老师：XXX（讲师）
一，引言
1.本课题研究的背景
米曲霉具有丰富的酶系,包括蛋白酶，淀粉酶， 纤维素酶，酯酶，果胶酶等多种酶，且其稳 定性高，被广泛的应用于食品、饲料、酿造 等发酵工业。 沪酿3042米曲霉是一个优良的菌株，不仅蛋 白酶活力高而且酶系较全，从20世纪60年代 末期开始，在酱油生产中广泛应用，至今已 40多年，无论是传统工艺生产还是速酿工艺 生产，都仍十分受欢迎。
二，实验内容
（1）通过米曲霉的活化，观察菌 种的菌丝体形状，颜色等来得到 纯化米曲霉； （2）单因子研究影响因素，主要 包括不同的pH、温度、培养时间 条件下对种曲的蛋白酶活力分布 的影响； （3）通过米曲霉的优化证明啤酒 下脚料完全有可能全部或部分替 代豆粕进行酱油酿造。
三，实验方法
1.米曲霉的分离纯化
2.本试验创新之处
本课题在指导老师带领下，在不影响质量的前 提下，考虑价格，研究米曲霉培养条件的同时 结合废啤酒糟替代原料为研究方向，用废啤酒 糟来替代原料，为生产节约成本，创造更大的 经济效益。实验表明其成品酱油基本符合国家 二级酱油标准，若将这一方法成功推广，将 对部分农副产品延伸 产业链，降低酱油酿 造成本、提高相关企 业以及环境保护具有 积极的意义。
因此，从理论上来说啤酒 糟完全可以替代全部或部 分豆粕作为酿造酱油的原 料。
本课题在指导老师的指导下展开 研究，主要切入点是针对酱油酿 造菌株-米曲霉蛋白酶活力低的问 题,为了提高原料的利用率, 降低 生产成本等问题，将研究菌种在 不同培养条件下的生长形状，生 长速度及其产酶活力情况来选育 优良的米曲霉菌种。
2.本课题研究的意义
酱油酿造过程主要依赖于米曲霉所产生的丰富的 蛋白酶、淀粉酶、酯酶等多种酶系,分解原料中的 各种成分 。生产过程中米曲霉主要作用是制曲和 发酵，制曲的目的是使米曲霉在曲料上充分生长 发育，并大量产生和积蓄所需要的酶。 其发酵机理是一个错综复杂的 物化学反应过程，其主要是淀 粉与蛋白质的分解与合成代谢 过程，通过温度和时间,让蛋 白酶分解蛋白质为氨基酸,淀 粉酶分解淀粉成葡萄糖。
2.为确定最佳条件在各条件下测定蛋白水解酶 测定方法：福林-酚试剂法
标准曲线公式：本实验方案
(1).米曲霉在不同曲料pH条件下的酶活力 考虑到米曲霉的生长情况，选择范围为 pH为4~11。配置pH 4.0~11.0八类发酵 培养基。 (2).培养温度对米曲霉产蛋白酶活力的影响 在自然pH下，于温度分别于37℃、40℃、 43℃、46℃，在最佳的时间，测定蛋白 酶活力。 (3).培养时间对米曲霉蛋白酶活力的影响 在上述培养条件下，取40h，44h，48h 三个时间点测定米曲霉的蛋白酶活力， 确定最佳培养时间。
从图可得，米曲霉的蛋白酶的活力和培养时间有密切 的关系，在40~44小时之间，蛋白酶活力成直线上升， 44小时之后，酶活力下降，在44小时达到最高峰， 所以最佳培养时间为44小时。
4.替代原料的米曲霉酶活试验数据与讨论
从米曲霉的生长表观指标来看，除全部替代组菌种生 长明显较差外，其余各实验组菌体均生长良好。 从表数据结果可看出，啤酒糟：麸皮=5:5配比组酶活 最高。
（1）米曲霉的分离纯化（平皿培养） 30℃保温箱内培养2d，选取菌落半径比值大，菌落 生长快，孢子多的单一菌落。 （2）米曲霉的斜面培养 在恒温箱30℃培养2—3d，直至长满茂盛的黄绿色 孢子。 （3）米曲霉的二次扩大培养（三角瓶培养） 在30℃保温箱内培养3d左右，瓶内曲料上布满白斑 及菌丝，孢子充分长满曲料