外植体的继代培养
实验五外植体的继代培养
一、实验目的
学习用母液法配制MS培养基（外植体的继代培养）以及掌握培养基灭菌的方法及其操作过程。
二、原理
1、愈伤组织在一定的条件下，可“再分化”出根和芽等器官。
在这个过程中，植物生长调节剂起着决定性作用，调控着愈伤组织的芽和根的分化。
主要是细胞分裂素与生长素类的比例。
2、由外植体直接诱导出的侧芽，转接到相应培养基上，进行增殖和继代，以提高增殖率。
三、实验用具和药品：
四、实验步骤：
每组配制500ml培养基
接种、培养、观察记录。
文档：植物组培的继代培养
植物组培的继代培养将诱导产生的芽、苗、愈伤组织、原球茎或胚状体等培养物重新分割，接种到新鲜培养基上进一步扩大培养的过程称为继代培养，也称为增殖培养。
该过程是植物组织培养中决定繁殖速度快慢、繁殖系数高低的关键阶段。
继代使用的培养基对于一种植物来说，每次几乎完全相同。
由于培养物在适宜的环境条件、充足的营养供应和生长调节剂作用下，排除了其他生物的竞争，繁殖速度大大加快。
1、继代增殖方式根据外植体分化和生长的方式不同，继代培养中培养物的增殖方式也各不相同。
主要的增殖方式有：（1）多节茎段增殖将顶芽或腋芽萌发伸长形成的多节茎段嫩枝，剪成带1~2枚叶片的单芽或多芽茎段，接种到继代培养基进行培养的方法。
该方法培养过程简单，适用范围广，移栽容易成活，遗传性状稳定，如马铃薯、葡萄、刺槐、山芋等即可此种方式增殖。
（2）丛生芽增殖将顶芽或腋芽萌发形成的丛生芽分割成单芽，接种到继代培养基进行培养的方法。
该方法不经过愈伤组织的再生，是最能使无性系后代保持原品种特性的一种增殖方式，而且成苗速度快，繁殖量大，适合于大规模的商业化生产。
（3）不定芽增殖将能再生不定芽的器官或愈伤组织块分割，接种到继代培养基进行培养的方法。
不定芽形成的数量与腋芽无关，其增殖率高于丛生芽方式。
但是通过这种方式再生的植株在遗传上的稳定性较差，而且随着继代次数的增加，愈伤组织再生植株的能力会下降，甚至完全消失。
（4）原球茎增殖将原球茎切割成小块，也可以给予针刺等损伤，或在液体培养基中振荡培养，来加快其增殖进程。
（5）胚状体增殖通过体细胞胚的发生来进行无性系的大量繁殖。
具有极大的潜力，其特点是成苗数量多、速度快、结构完整，因而是增殖系数最大的一种方式。
但胚状体发生和发育情况复杂，通过胚状体途径繁殖的植物种类远没有丛生芽和不定芽涉及的广泛。
一种植物的增殖方式不是固定不变的，有的植物可以通过多种方式进行无性扩繁。
如葡萄可以通过多节茎段和丛生芽方式进行繁殖；蝴蝶兰可以通过原球茎和丛生芽方式进行繁殖。
实验十 植物组织的继代培养与观察
（三）培养环境条件
2、温度 一般为22-25℃的恒温进行培养。 喜温性植物： 26-28℃ 茄科、葫芦科、兰科 、禾本科等。 冷凉性植物： 25 ℃以下 百合科、十字花科、 菊科等。 培养周期中的昼夜温差影响：国内有关小麦、水 稻花药培养温度试验的报道认为： 诱导花形成愈伤组织——昼夜恒温较好； 器官分化——昼夜具有一定温差比较好，分化出 的小植株比较健壮。
愈伤组织的继代培养
继代：将培养物转移到新鲜培养基上继续培养的 过程。 目的：愈伤组织始终处于旺盛的分裂期
脱分化细胞不断进行分裂，从而形成了愈伤组织 ，愈伤组织在培养基上生长一段时间以后，由于 营养物质枯竭，水分散失，以及代谢产物的积累 ，如果让愈伤组织留在原培养基上继续培养而不 继代，它们则不可避免地发生分化，产生新的结 构。通过继代培养，可使愈伤组织无限期地保持 在不分化的增殖状态。
2．胚状体方式（somatic embryo） ——指由愈伤组织培养物诱导分 化出的胚芽、胚根、胚轴的胚状结 构，进而长成完整植株的方式。
四．愈伤组织形态发生的调控
愈伤组织的形态发生，主要受三大类因素 的调控： 外植体本身 培养基 培养环境
（一）材料本身
1．遗传型 不同植物种类的器官分化能力明显不同 ，如烟草、胡萝卜和矮牵年等植物容易诱导器官形 成，而禾谷类、豆类、棉花等就比较困难。 2 ．器官和部位 通常同一种植物的不同器官或组 织所形成的愈伤组织，无论在生理上或形态上，其 差别均不大。但是对有些植物而言，确有明显差异 。如油菜的花器官比叶、根易于分化成苗，水稻和 小麦幼穗的苗分化频率也比其他器官为高。 3．生长年龄 年龄较幼的外植体，不仅易于诱导 形成愈伤组织，而且也容易诱导分化成植株。如油 菜植株的自下而上的茎段的培养结果表明，下部的 器官形成频率低，愈往上部，苗的分化频率越高。
最新组培实验外植体选择处理及接种培养知识讲解
• 2.污染的预防措施
• 发现污染的材料应及时处理，否则将导致培养室环境污染。 对一些特别宝贵的材料，可以取出再次进行更为严格的灭 菌，然后接入新鲜的培养基中重新培养。要处理的污染培 养瓶最好在打开瓶盖前，先集中进行高压灭菌，再清除污 染物，然后洗净备用。现就根据污染途径，阐述污染的几 种预防措施。
常规的表面灭菌处理方法 ①把材料放进75%的酒精中约30～ 60s。 ②用2.5%的CaCl0（次氯酸钙）溶液浸泡15～20min。 ③无菌蒸馏水冲洗3～5次。 ④灭菌时进行摇动，使植物材料与灭菌剂有良好的接触。 ⑤在灭菌剂里滴入数滴0.1%的Tween20（吐温）或Tween80湿润 剂，能增强灭菌效果。
尔敏或75%的酒精擦洗，然后用紫外灯照射约20min。使 用前用75%的酒精喷雾，使空间灰尘落下。一年中要定 期一、二次用甲醛和高锰酸钾熏蒸。 • （7）操作人员在接种时一定要严格按照无菌操作的程 序进行
二、外植体的接种和培养 （一）外植体的接种 （二）外植体的培养
（一）外植体的接种
外植体的接种——是把经过表面消毒后的植物材料切碎 或分离出器官、组织、细胞，并将它们转放到无菌培养 基上的全部操作过程。整个接种过程均须无菌操作。操 作过程中引起的污染，主要由空气中的细菌和工作人员 本身引起的。因此除接种室空气消毒外，应特别注意防 止工作人员本身引起的污染。
常用灭菌药剂的使用和效果
灭菌剂
次氯酸钠 次氯酸钙 漂白粉 氯化汞 酒精 过氧化氢 溴水 硝酸银 抗菌素
使用浓度（%）
2—3 2
饱和浓度 0.1—1 70—75 10—12 1—2
消毒继代及移栽
升汞（氯化汞）0.1-1％
酒精
过氧化氢
70-75%
10-12%
0.2-2min
5-15min
易
3. 玻璃化的原因与防治
定义：外植体在进行离体繁殖时，有的植株嫩茎和叶片往 往出现半透明状，水渍状，这种现象称为玻璃化。 特点： ①植株矮小肿胀、失绿、叶片皱缩成纵向卷曲，脆弱易碎 ②叶表面缺少角质层蜡质，没有功能性气孔，仅有海绵组 织而无栅栏组织 ③体内含水量高，但干物质、叶绿素、蛋白质、纤维素和 木质素含量低 ④吸收营养与光合功能不全，分化能力大大降低，苗生长 缓慢、繁殖系数大为降低，甚至死亡 ⑤生根困难，移栽成活率低
初代培养
接种某种外植体后，最初的几代培养。根据 初代培养时发育的方向可分为：
顶芽和腋芽的发育
不定芽的发育
体细胞胚状体的发生与发育
继代培养
由最初的外植体上切下新增殖的组织，转入新的培 养基上继续培养。
驯化：外植体开始培养时要加入生长调节物质， 经长期继代培养后，加入少量或不加生长调节 物质就可以生长的现象。 衰退：长期继代培养的材料逐渐丧失形态发 生能力的现象。
玻璃化的克服方法 根据诱因，可以适当降低培养基含水量、减少 含氮化合物用量、增加光照、调整培养温度、降 低细胞分裂素含量等措施来减少玻璃化的产生。
植株移栽
组培苗由于是在无菌、有营养供给、适宜光照、 温度和湿度环境条件下生长的，因此，在生理、 形态等方面都与自然条件生长的小苗有着很大 的差异。
花卉 外植体接种技术继代培养
17：继代培养、 实训 17：继代培养、生根培养操作技术
目的要求： 进一步掌握无菌接种技术。 一、 目的要求： 要求 使学生掌握植物组培技术的程序， 二、材料及用具： 材料及用具： 1、材料：初代培养的无菌苗 ： 2、用具：超净工作台、培养基、酒精灯、接种镊子、接种剪刀、75%酒精。 三、方法步骤 1、继代培养：外植体达到无菌培养后，在人为条件下经诱导产生茎段、丛 生芽、原球茎，并能在短期内加倍增殖，这部分增殖的材料称为中间繁殖体，这 种增殖过程称继代培养。 菊花继代增殖培养基：MS + BA 0.5 mg/L + NAA 0.2 mg/L + 3% 蔗糖 将初代培养分化形成的菊花芽苗进行无菌操作，转接至继代增殖培养基上。 分化后的材料可长期继代培养， 每代 30-40 天。 材料在培养容器内的分布要均匀， 以保证必要的营养面积和光照条件。 2、生根培养：离体繁殖产生大量的芽、嫩梢、原球茎，需进一步诱导生根， 才能得到完整的植株。 菊花生根培养基：1/2 MS + NAA 0.1 mg/L + 2% 蔗糖 将继代培养诱导出的 3-4 厘米长的菊花芽苗剪下，转接于生根培养基中，一 个月即可形成良好的根系。 3、注意事项：接种过程中注意防止污染，以免浪费接种材料和培养基。 四、思考与作业 1、思考：观察记录菊花丛生芽增殖情况、开始生根时间、生根率等，根据 培养情况进分析。 2．将菊花继代培养、生根培养接种技术及操作过程写出书面报告。
外植体的接种和培养
（2）无机盐
在初代培养时，培养基中无机盐浓度过
高，酚类物质将会大量外溢，导致外植 体褐变。原因是无机盐中的有些离子， 如Mn2+、Cu2+是参与酚类合成与氧化酶类 的组成成分或辅因子，因此盐浓度过高 会增加这些酶的活性，酶又进一步促进 酚类合成与氧化。
（3）植物生长调节物质
有报道说，初代 培养处在黑暗条件下，生长调节物质的存 在是影响褐变的主要原因，此时去除生长 调节物质可减轻褐变。细胞分裂素6-BA或 KT不仅能促进酚类化合物的合成，而且还 能刺激多酚氧化酶的活性，这一现象在甘 蔗的组织培养中十分明显。而生长素类如2， 4-D和IAA可延缓酚类化合物的合成，减轻 褐变现象发生。
抑制作用。
第五章 外植体的接种和培养
第一节 外植体的接种 第二节 外植体的褐变及其预防措施
第四节 外植体的接种
外植体的接种——是把经过表面消毒后的植物 材料切碎或分离出器官、组织、细胞，并将它
们转放到无菌培养基上的全部操作过程。整个
接种过程均须无菌操作。操作过程中引起的污
染，主要由空气中的细菌和工作人员本身引起
三、影响褐变的因素有哪些？
随着植物种类、基因型、外植体的部位及生理状 况等的不同，褐变的程度也有所不同。 1．植物材料 （1）基因型 不同种植物，同种植物不同类型 、不同品种在组织培养中褐变发生的频率、严重程 度都存在很大差别。人们已经注意到，木本植物（ 木质素）、单宁含量或色素含量高的植物容易发生 褐变。这是因为酚类的糖苷化合物是木质素、单宁 和色素的合成前体，酚类化合物含量高，木质素、 单宁或色素形成就多，而酚类休合物含量高将导致 褐变的发生，因此，木本植物一般比草本植物容易 发生褐变。
基本是对应的，春季较弱，随着生长 季节的到来，酶活性逐渐增强，因而有 人认为取材时期比取材部位更加重要。 Chever报道，欧洲栗在1月15日-30日醌 类物质形成少，而在5月-6月醌类物质明 显提高。
组培中常见问题分析
组培苗在培养过程中常见问题分析一、植物褐化A、原因可能有：1、植物本身含有较多的酚类物质，在切割外植体时，从伤口渗透出来，直接渗入培养基中，或在继代培养时不断形成并渗出。
2、（1）外植体的取材部位及季节（2）培养基成分，浓度过高的无机盐和高浓度6-BA、KT 等容易加重褐化。
（3）培养条件不当，温度过高培养时间过长、光照过强，均可以提高多酚氧化酶的活性。
B、防止措施：1、选择合适的外植体：选取幼龄材料，选合适部位，时间一般在初冬或初春2、暗培养或勤转瓶3、弱光培养、低温培养4、添加活性炭或抗氧化剂等5、可以降低无机盐含量，由全量降为半量，减少铵态氮的含量。
二、玻璃化现象A、原因可能有：1、培养温度高2、生长素种类及其配制比例不合适。
铵态氮及碳源对某些植物培养不适宜。
B、防止措施：1、降低培养瓶内的湿度，增加琼脂量，每瓶接种量减少三分之一2、降低培养温度3、增加光照4、降低培养温度5、降低培养基中细胞分裂素含量，可以考虑加入适量脱落酸。
也可以降低或去除铵态氮。
6、在培养基中加入1.0~5.0g/L活性炭。
三、黄化现象A、原因可能有：1、培养基中铁元素含量不足，激素配比不当，糖用量不足。
2、培养瓶温度不适，光照不足。
3、pH值有问题。
（培养基配置不正确）B、防止措施：1、检查培养基配置过程，保证培养基成分正确添加2、调节培养基的成分和pH值3、控制培养室温度，增加光照，用透气盖改善瓶内通气情况四、污染现象A、原因可能有：1、原瓶苗有污染2、接种工具灭菌不彻底3、操作时认为带入菌4、接种环境不干净5、原瓶苗细菌性污染（浑浊水渍状、或泡沫发酵状）常由于灭菌锅未排尽冷空气、灭菌锅压力温度不够，计时不准确造成。
6、原瓶苗真菌性污染（出现各种颜色的孢子），可能是由于空气、瓶口及瓶盖真菌孢子引起。
B、防止措施：1、正确使用灭菌锅2、接种工具每次使用完后要消毒灭菌，接种时，手不要碰盘子的任何地方，用镊子夹盘子。
3、污染的原瓶苗要及时淘汰，如果原瓶苗数量少要进行灭菌4、接种时，要保证接种环境的干净卫生，台内工具不宜放太多。
名词解释
一、名词解释愈伤组织(callus):原指植物体的局部受到创伤刺激后，在伤口表面新生的组织。
在组织培养中则指人工培养基上由外植体长出来的一团无序生长的薄壁细胞。
继代培养：对来自于外植体所增殖的培养物(包括细胞、组织或其切段)通过更换新鲜培养基及不断切割或分离，进行连续多代的培养，就称为继代培养玻璃化苗：指试管苗因生理失调而引起的嫩茎、叶片出现半透明状和水渍状的现象。
其苗称为玻璃化苗。
花粉胚：用花粉经过人工的组织培养而形成的幼胚，发育成的植株就只有正常胚一半的染色体组，所以由花粉胚发育成的植株不会产生种子。
生理隔离：植物传粉后或动物交配后，由于生理上的不协调而不能完成受精作用的现象。
种植保存：指利用天然或人工创造的适宜环境保存种植资源，使个体中所包含的遗传物质保持其遗传完整性和活力，并能通过繁殖将其遗传特性传递下去。
脱分化：已分化的细胞在一定因素作用下恢复细胞分裂能力,失去原有分化状态的过程叫做脱分化。
全能性：是指干细胞具有的分化成机体所有类型细胞和形成完全胚胎的能力。
人工种子：指通过组织培养技术，将植物的体细胞诱导在形态上和生理上均与合子胚相似的体细胞胚，然后将它包埋于有一定营养成分和保护功能的介质中，组成便于播种的类似种子的单位。
炼苗：是在保护地育苗的情况下，采取放风、降温、适当控水等措施对幼苗强行锻炼的过程，使其定植后能够迅速适应陆地的不良环境条件，缩短缓苗时间，增强对低温、大风等的抵抗能力。
再分化：已经脱分化的愈伤组织在一定条件下，再分化出胚状体，形成完整植株，这一过程叫作再分化。
褐变：指在组培过程中，培养材料向培养基中释放褐色物质，致使培养基逐渐变成褐色，培养材料也随之慢慢变褐而死亡的现象。
脱毒培养：利用组织培养技术，脱除植物细胞中的病毒，生产健康的无毒繁殖材料的过程。
胚状体：亦称体细胞胚。
指在组培过程中，由植物体细胞所形成的类似于合子胚的结构。
细胞培养：是指从体内组织取出细胞模拟体内出现环境，在无菌，适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使其生长繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。
植物细胞培养技术一般流程
植物细胞培养技术一般流程植物细胞培养技术可有意思啦，就像养小宠物一样，不过咱养的是植物细胞。
这植物细胞培养呢，有一套自己的流程。
一、外植体的选择。
咱得先找个合适的外植体。
啥是外植体呢？就是从植物体上取下来用于培养的那部分，就像从树上摘个小树枝或者从花上揪个小花瓣啥的。
这外植体的选择可讲究了呢。
要挑那些健康的、生命力强的部分。
比如说吧，如果是培养苹果的细胞，那可能就选个苹果树上长得壮实的小嫩芽。
而且不同的植物细胞培养目的，外植体也不一样哦。
要是想让细胞分化出根来，可能就选靠近根部的组织；要是想让它长出叶子，那可能就选茎尖附近的组织啦。
这就跟咱们做菜选食材一样，得选对了才能做出好菜呢。
二、外植体的消毒。
选好外植体之后，可不能就直接往培养皿里放呀，得消毒呢。
这就好比咱们从外面带回来的小宠物，得先给它洗个澡，消消毒，不然有病菌就不好了。
消毒的时候得小心，不能把外植体给弄死了。
一般会用一些温和的消毒剂，像酒精啊，再加上一些其他的消毒剂配合着用。
消毒的时间也得把握好，时间短了，消毒不彻底，病菌还在；时间长了，外植体可能就被毒死了。
这就像给小宠物洗澡，洗太久了可能小宠物就着凉生病啦。
三、接种。
消毒完了就到接种这一步啦。
这就像是把小宠物放进它的小窝一样。
把外植体放到含有营养物质的培养基上。
这培养基可神奇了，就像是给植物细胞做的营养餐，里面有各种营养成分，像糖类呀，维生素呀，矿物质呀，都是细胞生长需要的东西。
接种的时候也得小心翼翼的，要在无菌的环境下进行。
就像给小宠物找个干净的小窝一样，要是有细菌混进去了，细胞可就长不好了。
四、初代培养。
接种完了，细胞就开始在培养基上生长啦，这就是初代培养。
细胞就像小婴儿一样，开始慢慢适应新环境，吸收培养基里的营养，慢慢长大。
在这个过程中，有时候细胞会开始分化，形成一些小的组织块，就像小婴儿开始学会做一些小动作一样。
不过有时候也会遇到问题呢，比如说细胞可能不生长，或者长得很慢，这时候就得找找原因了，是不是培养基的营养不够啊，还是环境温度不合适呀。
《细胞工程》名词解释
植物细胞全能性:植物体的每个细胞都携带有该物种的全部遗传信息，因而只要在适当的条件下，植物一切生活细胞都具有分化为一个完整植株的潜在能力，这就是细胞的全能性。
这是细胞工程的理论基础。
细胞分化:个体细胞发育过程中，后代细胞在形态、结构和生理功能上发生差异的过程。
脱分化:原已分化的细胞，失去原有的形态和机能，又回复到没有分化的无组织的细胞团或愈伤组织，这个过程称为脱分化。
再分化:由脱分化状态的细胞再度分化形成另一种或几种类型的细胞的过程，称为再分化愈伤组织:外植体在离体条件下，细胞经脱分化等一系列过程，转变为一种能迅速增殖的无特定结构和功能的细胞团，称为愈伤组织。
愈伤组织细胞大而不规则,高度液泡化、没有次生细胞壁和胞间连丝。
继代培养:对来自于外植体所增殖的培养物通过更新新鲜培养基及不断切割或分离,进行连续多代的培养.外植体:植物组织培养中用来进行离体无菌培养的材料,可以是器官、组织、细胞和原生质体。
器官发生:指离体培养条件下的组织或细胞团分化形成不定根、不定芽等器官过程。
体细胞胚：由外植体可直接形成胚状体，外植体也可以经脱分化先形成愈伤组织，再由愈伤组织形成胚状体。
胚状体是由体细胞发育而来人工种子：通过将植物组织培养中所产生的体细胞胚或珠芽等包埋在“人工胚乳”和“人工种皮”里，制成的具有播种功能、类似天然种子的颗粒就称为人工种子。
繁殖系数：也叫增殖系（倍)数或增殖率，是指繁殖材料在一个培养周期内增殖的倍数。
污染：指在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象。
褐变：指在组织培养中，由于材料被切割而使多酚氧化酶活化将组织中的酚类物质氧化形成棕褐色的醌类物质，并向培养基中扩散，抑制培养物生长甚至导致其死亡的现象。
玻璃化：指组织培养过程中的特有的一种生理失调或生理病变，试管苗呈半透明状外观形态异常的现象。
悬浮培养：将游离的单细胞或小的细胞团，按照一定的细胞密度，悬浮在液体培养基中进行培养的方法。