组培实验外植体选择处理及接种培养
组培成功必备的几大要素
组培成功必备的几大要素组织培养（tissue culture）是一种在实验室或生物技术设施中，通过控制环境条件来培养植物组织或细胞的技术。
以下是组织培养成功必备的几大要素：1.无菌环境：无菌环境是组织培养成功的首要条件。
所有用于组织培养的材料，包括外植体、培养基、接种工具等，都必须进行严格的消毒处理，以防止细菌、真菌等微生物的污染。
实验室应配备超净工作台、紫外灯、高压蒸汽灭菌器等设备，确保无菌操作。
2.合适的培养基：植物组织培养的成功与否，很大程度上取决于所使用的培养基。
培养基应含有植物生长所需的营养成分，如糖、氨基酸、微量元素、维生素等，以及适量的植物生长调节剂，如生长素和细胞分裂素。
根据不同的植物种类和培养目的，可以选择不同的培养基。
3.适宜的温度和光照：在组织培养过程中，温度和光照也是影响成功的关键因素。
每种植物都有其最适的生长温度和光照条件。
一般来说，大多数植物在25-30℃的温度下和16-24小时的光照条件下生长良好。
4.外植体选择与处理：选择健康、无病虫害的植物材料作为外植体，并对材料进行适当的预处理，如清洗、消毒等，是组织培养成功的关键步骤。
此外，选择适合的外植体类型也对培养成功至关重要。
5.接种技术：接种是将外植体接入培养基的过程。
熟练的接种技术能够减少对植物组织的损伤，避免污染，并提高组织的存活率。
6.细胞分裂与增殖：在适宜的培养条件下，植物细胞会分裂并增殖形成愈伤组织。
这个过程需要定期观察和记录细胞的生长情况，及时调整培养条件以促进细胞的分裂和增殖。
7.生根与移植：当愈伤组织形成后，可以将其转移到生根培养基中，促使组织产生根系。
当根系形成后，可以将其移植到土壤中或进行其他后续实验。
8.遗传稳定性：为了确保组织培养后得到的植株是纯合的，并保持其遗传稳定性，需要采用适当的遗传检测方法。
这可以通过分子生物学方法，如DNA 指纹分析或基因表达分析来实现。
9.法规与伦理：在进行组织培养实验时，必须遵守相关的法规和伦理准则。
6 植物组织培养实验二PPT课件
谢谢你的到来
学习并没有结束，希望大家继续努力
Learning Is Not Over. I Hope You Will Continue To Work Hard
演讲人：XXXXXX 时 间：XX年XX月XX日
18
2、无菌操作要注意：每次操作前， 将双手用酒精棉球擦拭消毒；镊 子、解剖剪刀等金属工具用火焰 烧过灭菌，冷却后方可使用；尽 量减少无菌三角瓶或培养皿在空 气中的暴露时间；所有无菌操作 尽量快速完成，并要求在酒精灯 附近进行。
19
3、请先在自然条件下练习外植体解剖， 分割成0.5cm2左右的小块（段），经操 作熟练，检查无误后，再进行无菌解 剖分割及接种，以减少植物材料染菌 或失水死亡的机率。
欢迎同学们进入奇幻的植物组织培养实验世界
1
植物组织培养实验Ⅱ——— 外植体取材﹑表面消毒与接种
实验目的 实验原理、基本知识 实验用品、材料 实验要求 实验内容 、方法 实验报告——作业 下一次实验预告
2
一、实验目的
1、掌握无菌操作技术，加深对无菌操作的了
解；
2、掌握常规的植物细胞组织培养技术，达到 能独立操作的能力
29
7、打开三角瓶——铝箔纸的拿法
30
8、瓶口在火焰上烧过
31
9、铝箔纸的放法
32
10、镊出黄瓜苗
33
11、镊出黄瓜苗
34
12、放入培养皿中
35
13 、
黄 瓜
幼 苗 形 态
生 长 点
36
——
14、剪取茎段
37
15、剪好的外植体
38
16、黄瓜切块的接种
蓝莓组织培养
蓝莓组织培养方案1、植物介绍：1）供试材料来源：选取长势旺盛的幼嫩枝条，去除多余的叶片，切取除顶芽外的第3节~第10节作为外植体。
提供的材料希望老师可以从组培室提供。
2）技术路线：外植体处理→接种→增殖培养→生根培养→移栽2方法步骤：1）外植体的剪取与消毒程序的筛选：切取除顶芽外的第3节~第10节作为外植体段去叶片留叶柄→流水冲洗30min→75%酒精浸泡30s→0.1%升汞溶液消毒3~7min→无菌水冲洗4~5次→用滤纸吸去水分→将茎段切成带有1~2个腋芽的小段2)初代培养基的筛选：选用MS为最基本的培养基，根据需要的不同，添加激素6-BA、NAA、ZT。
3)增殖培养基的筛选：以MS为基本培养基，按激素6-BA、NAA、ZT含量的不同，诱导增殖培养基设4系列处理（培养基1~4号），生根培养基设2系列处理（培养基5~6号），培养基配方表如下：表中培养基蔗糖含量：分化和继代培养基为30g/L，pH值5.6~5.8，在115MPa气压下灭菌20min。
4)生根培养基的筛选不同的培养基进行生根的优势也不一样，根据大量的材料表明1/4 MS中的小苗生根均明显优于全量的MS培养基，所以用激素以IBA0.5mg/L效果最好，生根情况好且所需天数也最短。
最适培养基应该为1/4 MS+IBA 0.5mg/L5)试管苗移栽试验：当苗根长到1~1.5cm时，打开瓶盖，取出小苗，洗净培养基。
用多灵菌500~800倍浸泡30min左右，然后栽入0.1%高锰酸钾消毒过的苗床上。
苗床基质分5个处理，分别为沙：草炭土=1:1、沙：蛭石=1：1、纯沙、纯蛭石、腐苔藓。
（根据资料查找以腐苔藓为基质最好，成活率达80%以上，草炭土和沙半量也可达50%的成活率。
）。
接种实验
组培实验---实验二外植体的灭菌、接种与初代培养一、实验目的通过实验初步掌握外植体材料消毒、接种的无菌操作技术以及外植体初代培养的方法。
二、实验原理植物组织培养是在无菌条件下对离体的植物器官或组织的培养。
而植株各部分的表面携带着各种不同的微生物，所以在接种前就必须选择合适的消毒剂对外植体进行消毒，获得无菌材料进行组织培养，这是取得组织培养成功的前提和重要保证。
离体器官或组织受到适当刺激，便可进行器官分化，从而实现细胞的全能性。
三、实验材料、试剂和仪器设备1．实验材料：喜树当年生枝条2．试剂：升汞，吐温-803.仪器设备（以各组所需为例）无菌器材：4瓶培养基，一个无菌烧杯+吸水纸，1升无菌水，大号、中号镊子各1把，1把解剖刀、1把剪刀，2个500ml烧杯非无菌材料：0.1%升汞消毒液200ml，1个250ml消毒缸，1盏酒精灯及火机1个，1个烧杯，内装75%酒精150ml，1个烧杯，内装75%酒精及棉球，1把大号镊子、1把枝剪、1把解剖刀、1把旧牙刷，橡皮筋若干、标签纸、记号笔、洗衣粉、毛巾、喷雾器四、实验步骤1．实验一制备的培养基即是本实验所用培养基。
2．接种前，用75%酒精棉球擦拭超净工作台台面，将培养基及接种用具放入超净工作台。
房间用酒精喷雾降尘后打开超净工作台紫外灯及房间的紫外灯，照射约30mins；然后关闭紫外灯，打开房间换气扇以及超净工作台的风机，并微启超净工作台的玻璃挡板，通风20min后，即可进行无菌操作。
3．选取生长健壮的枝条，用饱满又未萌发的侧芽作为外植体（取中部的芽较好）。
将外植体用手术刀切去叶片，并剥去附在茎上的叶柄及皮刺，用毛刷沾洗衣粉刷洗并在自来水下冲洗干净。
吸干水份后切成约2-3cm的茎段，每段至少有1个侧芽。
将处理好的外植体转入洁净的消毒缸中，用加了数滴吐温-80的0.1%的升汞溶液浸泡10min。
在表面灭菌过程，应不停摇动消毒缸使消毒液与外植体充分接触。
4．进入接种间，用酒精棉球仔细擦拭双手至手腕部位5．把浸泡在消毒液中的外植体转移到超净工作台中。
植物组织培养的一般流程
植物组织培养的一般流程一个完整的植物组织培养过程一般包括以下几个步骤：1）准备阶段（然根据已成功培养的相近植物资料，结合实际制订出切实可行的培养方案。
查阅相关文献，并经高压灭菌或过后根据实验方案配制适当的化学消毒剂以及不同培养阶段所需的培养基，滤除菌后备用。
2）外植体选择与消毒（将消毒后的外然后进行消毒处理。
选择合适的部位作为外植体，采回后经过适当的预处理，接种到初代培养基上。
植体在无菌条件下切割成一定大小的小块，或剥离出茎尖，挑出花药，）初代培养（3促使外植体中已分化的细胞脱分化形成愈伤接种后的材料置于培养室或光照培养箱中培养，然后将愈伤组织转移到分化培养基分化成不同的器官组织，或顶芽、腋芽直接萌发形成芽。
原基或形成胚状体，最后发育形成再生植株。
（4）继代培养当芽苗繁殖到一分化形成的芽、原球茎数量有限，采用适当的继代培养基经多次切割转接。
进行脱毒苗培养的需提前定数量后，再将一部分用于壮苗生根，另一部分保存或继续扩繁。
进行病毒检测。
5）生根培养（提高生长素浓多数无根，此时可降低细胞分裂素浓度或不加，刚形成的芽苗往往比较弱小，度，促进小苗生根，提高其健壮度。
6）炼苗移栽（选择生长健壮的生根苗进行室外炼苗，待苗适应外部环境后，再移栽到疏松透气的基质中，注意保温、保湿、遮荫，防止病虫危害。
当组培苗完全成活并生长一定大小后，即可移向大田用于生产。
P P 1 、二、单项选择题1. 在衡量杂种优势（H ）时，超中优势的计算方法为（[F 1 -(P 1 +P A. H ＝2 分别表示两亲本的性状平均值，F 1 为杂种一代的性状平均值）：[F 1 -(P 1 +P 2 )/2]/(P 1 +P 2 )/2 D. H ＝2 )/2]/(P 1 -P 2 )/2 B. H ＝(F 1 -P 1 )/P 1 C. H ＝(F 1 -P 2 )/P 2层细胞发生突变，则下列器官或组织会发L II 2. 根据植物梢端组织发生层学说，如果生变异的是：中柱C. 不定根D. ．表皮A B. 种子3. 对于孢子体型自交不亲和而言，下列基因型的杂交组合能产生后代的是：S 1 S 2 B ．S 1 S 2 ×S 1 S 3 C ．S 1 S 2 ×．A S 1 S 2 ×S 2 S 3 D ．S 1 S 2 ×S 3 S44. 原始群体性状差异较大的异花授粉园林植物，实生选种时一般采用：A ．一次单株选择B ．一次混合选择C ．混合－单株选择D ．单株－混合选择5. 现有两种菊属植物，其染色体组类型分别为AABB 和CC ，则将它们进行体细胞杂交获得的谐和细胞杂种染色体组类型应该为： A. AABB B. ABC C. AABBCC D.CC6. 下列射线中，哪一种属于可以引起物质电离的电磁波？A ．X 射线B ．β射线C ．紫外线D ．激光7. 园林植物的多倍体与二倍体相比，一般会表现为：A ．气孔增多B ．花大色艳C ．适应性减弱D ．结实率增加8. 常用的化学诱变剂EMS （甲基磺酸乙酯）是一种：A ．碱基类似物B ．烷化剂C ．抗生素D ．生长调节物质9. 在下列有性杂交方式中，被称为双交的是：A ．(A ×B) ×(C ×D)B ．[(A ×B) ×B] ×BC ．A ×BD ．[(A ×B) ×C] ×D10. 对于繁殖系数较高的草花而言，有时为了加速其选种进程，下列哪个程序或圃地可以省略？A ．株系圃B ．品种比较预备试验圃C ．品种比较试验圃D ．区域试验三、填空题（每空0.5 分，共15 分）1. 园林植物品种应具备的三个基本特征是：___ 、___ 和___。
植物组织培养实训指导书
植物组织培养实训指导书《植物组织培养技术》是生物技术及应用专业的工学结合核心课程之一。
本课程采取“项目引领，任务驱动”的教学模式，使学生掌握植物组织培养技术的职业知识和职业技能，能够在实际工作中具备实验方案设计能力、培养基制备能力、无菌操作能力、组培苗驯化移栽能力及组培苗工厂化生产能力。
实训一：实训室的灭菌与玻璃器皿的清洗一、目的要求1.通过实训，使学生了解各种洗涤液的特性；2.掌握酸液的配制方法和组织培养中常用器皿的洗涤技术；3.通过实训，培养学生良好的卫生习惯，建立组织培养的无菌意识；4.会配制新杰尔灭溶液。
二、材料用具1.灭菌用具：2%新洁尔灭、高锰酸钾、甲醛、70%酒精、洗涤剂、各种培养皿、工作服、口罩、手套、试管刷。
2.洗涤用具：肥皂液、洗衣粉、重铬酸钾粉末、1%HCL、70%酒精、瓶刷等。
三、方法步骤（一）培养室的灭菌1、地面、墙面和工作台的灭菌2、无菌室和培养室的灭菌（二）玻璃器皿的洗涤（酸洗）玻璃器皿的洗涤一般要经过浸泡、刷洗、浸酸和清洗四个步骤。
重铬酸钾洗涤（三种）液配制：重铬酸钾50g，加1L蒸馏水，加热溶化，冷却后再缓缓加入工业浓硫酸90ml。
1、新玻璃器皿的洗涤用1%HCL的溶液浸泡一昼夜，再用清水反复洗涤，最后用蒸馏水冲淋一遍，干燥后备用。
2、用过的玻璃器皿先将器皿中得残留物质除去，用清水冲洗，再用洗衣粉洗涤，最后用清水冲洗3～4遍，把字迹擦洗干净，干燥后使用。
3、污染的培养瓶的处理首先经高压蒸汽灭菌，再按（2）的步骤洗涤。
4、用过的吸管、滴管、容量瓶先放在重铬酸钾溶液浸泡2h以上，取出后经流水冲洗30min左右，干燥后使用。
四、实训报告①.植物组织培养室的灭菌方法步骤。
②.写出洗涤液的配置步骤。
③.记录各种培养瓶的洗涤方法。
实训二：组织培养工厂的设计一、目的要求通过实训，使同学们对现代组培苗生产模式有一个更为深刻的认识，能熟练的根据生产规模设计合理的厂房及工艺流程。
二、材料用具组培苗生产小工厂、绘图纸、绘图笔三、方法步骤(一) 组培工厂的参观1．参观组培实验中心2．组培工厂的组成：准备室、灭菌室、缓冲室、无菌室、培养室、驯化室3．各室内仪器设备的种类及摆放(二) 设计一200m2组培工厂，要求绘出大概的布局图。
组培实验
郁金香组织培养配方：MS＋6-BA2.0mg/L,NAA0.2mg/L+琼脂7g/L组员：李文强１３农学段绍泽１３农学彭新勇１３农学代光好１３农学郁金香组织培养一、简述郁金香(TulipagesnerianaL.)是一种世界名花, 欧美普遍种植。
郁金香的传统繁殖方式为分球繁殖, 繁殖系数低、速度慢,一个新品种投放市场需要25年时间同时由于栽培过程中病毒的侵染和其他原因, 其品种退化严重。
育种工作者急需寻求一种高产、优质、高效的繁殖方法。
而组织培养是快速繁殖的有效途径, 并在一定程度上抑制品种退化。
国际郁金香的组织培养始于20世纪70年代,国内最早的研究始于1983年笔者综述了郁金香组织培养的研究进展, 并展望了其应用前景,主要品种郁金香不同品种再生能力不同, 即使同一品种栽培环境不同, 再生能力也不同。
郁金香栽培品种有8 000多种, 主要栽培品种有130多种, 但是用于组织培养研究的只有20多种培养基的选择二、操作过程一般选择MS培养基作为基础培养基,生根培养基为1/2MS, 试验中经常选用6-苄氨基嘌呤(6-BA)、萘乙酸(NAA)、吲哚乙酸(IAA)、2, 4二氯苯氧乙酸(2, 4-D)、赤霉素(GA3 )、激动素(KT)等激素, pH值调至5.6～5.8,在培养过程中基本采用固体培养、而培养基中糖的含量为3% ～4%在生根培养中糖的含量减半或不变。
１．外植体的选择将郁金香鳞片、花茎、叶片、花托、腋芽、子房、花药、花瓣作外植体都有研究, 鳞片、花茎、叶片作为外植体材料来源充分,所以研究较多。
不同组织器官诱导效应不同, 这可能与植株的发育时期有关。
一般认为花茎诱导效应较好。
同时, 研究认为, 花茎切片厚度会影响愈伤组织的诱导能力, 一般切片厚度为2 ～5 mm。
２、愈伤组织的诱导、增殖和再生陆文梁等研究认为, 培养基中必须有细胞分裂素6-BA的存在,当培养基中只含有6-BA而无NAA时, 外植体可不经过愈伤组织直接成苗;当6-BA与NAA以1∶1配合使用时,外植体先形成愈伤组织而后分化成苗;当培养基中只含有NAA时,外植体只形成愈伤组织而不分化成苗, 这与Lenard等在郁金香离体培养上的观察结果一致。
组培苗生产技术—外植体的选择、处理与接种(植物组织培养课件)
3、蔬菜（龙牙百合） 龙牙百合特征:鳞茎，无皮，广卵形，外部鳞片长,将整个鳞茎 包裹，直径5~15厘米，白色，茎高90厘米左右，直立茎上叶 多而散生，披针形，叶色从浓绿，光滑。花单生茎顶。花朵 呈喇叭状长筒形，白色，有清香。
不能损伤组织材料，保持外植体的生活力，使外 植体在良好的培养条件下很快恢复生机，正常 生长和繁殖.
• 消毒剂的要求 • 要求：具有良好的消毒作用，既不会杀死植物的
组织细胞，又易被无菌水冲洗掉，不影响消毒后 外植体的生长和分化.
常用灭菌药剂的使用和效果
灭菌剂 使用浓度（%） 清除的难易 消毒时间 效 果
2、茎段（采用嫩茎的切段促进腋芽萌发，取材容易） 3、叶（幼嫩叶片组织通过愈伤组织或不定芽分化产生植株，
取材容易，操作方便，但易发生变异）； 4、花球和花蕾 5、种子、根、块根、块茎、花瓣等。
（二）实例分析 1、花卉（非洲菊） • 常用茎尖、嫩叶、花托进行非洲菊的组织培养，也有利用
种子进行组织培养的。 • 茎尖培养操作麻烦，但对于脱毒苗的生产是最有效的。 • 花托培养可直接成苗， 既可保持种性，又易行、 耗时短，是首选的外植体。
• 首先要选择花大、花色艳丽、市场流行的品种，然后再选 择无病虫害、植株生长健壮、花色纯正的优良品种单株进 行取材。
• 一旦选出优株后，应进行挂牌标记，并一直在其上采取花 蕾。作为外植体的花蕾要选取直径在1㎝左右，而且未露 心的小花蕾，太大或是太小的花蕾均不能获得满意的效果 。
2、水果（草莓）
（1）选择结果性优良的草莓母株上新抽出的匍匐茎作外植体，以每年6～7 月份最为适宜。
龙牙百合的许多器官、组织都可作为外植体， 如鳞片、花梗、叶片、茎尖、腋芽、花瓣、花托 、花丝、花药、胚、子房、根尖等，其中采用鳞 片作外植体的较多。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
4．氧气 植物组织培养中，外植体的呼吸需要氧气。在液 体培养中，振荡培养是解决通气的良好办法。
2．温度 离体培养中对温度的调控要比光照显得更 为突出。不同的植物有不同的最适生长温度，大多 数植物最适温度在23C-32C之间。培养室一般所 用的温度是25C±2C。低于15C或高于35C，对 生长都是不利的。
3．湿度 组织培养中的湿度影响主要有两个方面，一是培 养容器内的湿度，它的湿度条件常可保证100%。二是培 养室的湿度，它的湿度变化随季节和天气而有很大变动 。湿度过高过低都是不利的，过低会造成培养基失水而 干枯，或渗透压升高，影响培养物的生长和分化；湿度 过高会造成杂菌滋长，导致大量污染。因此，要求室内 保持70%-80%的相对湿度。
3.选择最适的时期 组织培养选择材料时，要注意植物的生长季节和植物 的生长发育阶段。如快速繁殖时应在植株生长的最适时期 取材，这样不仅成活率高，而且生长速度快，增殖率高； 花药培养应在花粉发育到单核期时取材，这时比较容易形 成愈伤组织。
4.选取适宜的大小 建立无菌材料时，取材的大小根据不同植物材料而异 。材料太大易污染，也不需要；材料太小，多形成愈伤组 织，甚至难于成活。一般选取培养材料的大小，在0.5cm-1.0cm。如果是胚胎培养或脱毒培养的材料，则应更小。
1. 选择优良的种质 无论是离体培养繁殖种苗，或者是进行生物技术研究， 培养材料的选择都要从主要的植物入手，选取性状优良的 种质，或特殊的基因型。对材料的选择要有明确的目的， 具有一定的代表性，提高成功机率，增加其实用价值。
2. 选择健壮的植株 组织培养用的材料，最好从生长健壮的无病虫的植株 上，选取发育正常的器官或组织。因为这些器官或组织代 谢旺盛，再生能力强，比较容易培养成功。
中浸15-20s，再用无菌水冲洗数次。
（3）玻璃器皿的灭菌 • 湿热灭菌法——即将玻璃器皿包扎后置入蒸汽灭菌锅中进
行高温高压灭菌，灭菌时间可延长达25min—30min。 • 干热灭菌法——即将玻璃器皿置入电热烘箱中进行灭菌。 • 煮沸灭菌——即将玻璃器皿放入水中煮沸进行灭菌。
（4）金属器械的灭菌 火焰灭菌法：即把金属器械放在95%的酒 精中浸一下，然后放在火焰上燃烧灭菌。 这一步骤应当在无菌操作过程中反复进 行。 干热灭菌法：即将拭净或烘干的金属器械用 纸包好，盛在金属盒内，放在烘箱中灭菌。
• （5）布质制品的灭菌 • 湿热灭菌法：工作服、口罩、帽子等布质品均用湿
热灭菌法，即将洗净晾干的的布质品，放入高压锅 中，用1.1公斤/厘米2 （即15磅/英寸2），121C的 温度，灭菌20 min～30min。
• （6）无菌操作室的灭菌 • 无菌操作室的地面、墙壁和工作台的灭菌可用2%的新洁
2．操作期间经常用75%的酒精擦拭双手和台面。 特别注意防止“双重传递”的污染，例如：器 械被手污染后又污染培养基。
3．在打开培养瓶时，最大的污染危险是管口边沿沾染 的微生物落入管内，解决这个问题，可在打开前用火 焰烧瓶口。
如果培养液接触了瓶口，则瓶口要烧到足够的热 度，以杀死存在的细菌。
为避免灰尘污染瓶口，可用纸或者保鲜膜包扎瓶 口和塞子，以遮盖瓶子颈部和试管口，相对地减少污 染机会。
(二)外植体的处理 外植体在接种前先要灭菌，在灭菌前，又先要进行预处 理。植物材料一般采取的预处理方法是，先对植物组织进行 修整，去掉不需要的部分，将准备使用的植物材料在流水中 冲洗干净。经过预处理的植物材料，其表面仍有很多细菌和 真菌，因此还需进一步灭菌。
常规的表面灭菌处理方法 ①把材料放进75%的酒精中约30～ 60s。 ②用2.5%的CaCl0（次氯酸钙）溶液浸泡15～20min。 ③无菌蒸馏水冲洗3～5次。 ④灭菌时进行摇动，使植物材料与灭菌剂有良好的接触。 ⑤在灭菌剂里滴入数滴0.1%的Tween20（吐温）或Tween80湿润 剂，能增强灭菌效果。
常用灭菌药剂的使用和效果
灭菌剂
次氯酸钠 次氯酸钙 漂白粉 氯化汞 酒精 过氧化氢 溴水 பைடு நூலகம்酸银 抗菌素
使用浓度（%）
2—3 2
饱和浓度 0.1—1 70—75 10—12 1—2
1 4—50mg/L
清除的难易
易 易 易 较难 易 最易 易 较难 中
消毒时间 效 果
5—30 5—30 5—30 2—10 0.2—2 5—15 2—10 5—30 30—60
（1）防止材料带菌
①用茎尖作外植体时，可在室内或无菌条件下对枝条先进行预 培养。枝条水洗净插入无糖的营养液或自来水促使抽枝，以这 种新抽的嫩枝条作为外植体接种。这样便可大大减少材料的污 染。
或在无菌条件下对采自田间的枝条进行暗培养，待抽出徒 长的黄化枝条时采枝，经灭菌后接种也可明显减少污染。
②选择合适的时间去田间采取外植体
4．工具用后及时消毒，避免交叉污染。 5．工作人员的呼吸也是污染的主要途径。通常在平静呼吸 时细菌是很少的，但是谈话或咳嗽时细菌便增多，因此操作 过程应禁止不必要的谈话并戴上口罩。
6．由于空气中有灰尘，因此在操作时，仍要注意避免灰 尘的落入。尽量把盖子盖好，当打开瓶子或试管时，应 拿成斜角，以免灰尘落入瓶中。
超净工作台的过滤装置失效 培养用器皿的口径过大 为了减少损失，提高工作效率，必须在每个操作环节注意防 止污染的发生。
• 2.污染的预防措施
• 发现污染的材料应及时处理，否则将导致培养室环境污染。 对一些特别宝贵的材料，可以取出再次进行更为严格的灭 菌，然后接入新鲜的培养基中重新培养。要处理的污染培 养瓶最好在打开瓶盖前，先集中进行高压灭菌，再清除污 染物，然后洗净备用。现就根据污染途径，阐述污染的几 种预防措施。
• 1．操作人员需着经消毒的白色工作服，戴口罩。进入 接种室前，工作人员的双手必须进行消毒，用肥皂和水 洗涤能达到良好的效果, 进行操作前再用75%的酒精擦 洗双手。
• 无菌操作室的灭菌 • 无菌操作室的地面、墙壁和工作台的灭菌可用
75%的酒精擦洗，然后用紫外灯照射约20min。 使用前用75%的酒精喷雾，使空间灰尘落下。 一年中要定期1-2次用甲醛和高锰酸钾熏蒸。
1．光照 对离体培养物的生长发育，光照条件有重 要的作用。通常对愈伤组织的诱导，在黑暗条件下 有利，在有光条件下培养的愈伤组织质地和颜色也 有不同。但分化器官需要光照，并随着芽苗的生长 需要加强光照。加强光照，可以使小苗生长健壮， 促进“异养”向“自养”转化，提高移植的成活率。
普通培养室要求每日光照12h-16h，光照强度1000lx5000lx。如果培养材料要求在黑暗中生长，可用铝箔或者 适合的黑色材料包裹在容器的周围，或置于暗室中培养。
刀、剪、镊等用具，一般在使用前浸泡在95%酒精中 或插在器械灭菌器中，用时在火焰上消毒，待冷却后使 用。每次使用前均需进行用具消毒。
（二）外植体的培养 接种后的外植体应送到培养室去培养。组织培养的优
点之一就是在人工控制的环境条件下，使培养物生长发育 ，研究植物的生命活动。
培养室的培养条件要根据植物对环境条件的不同需求 进行调控。其中最主要的是光照、温度、湿度、氧气和培 养基的pH值等。
• 避免阴雨天去田间采取外植体。 • 在晴天采取外植体时，下午采取的外植体要比早晨采的污染
少，因材料经过日晒后可杀死部分细菌或真菌。
• 目前对材料内部污染还没有令人满意的灭菌方法。 在菌类长入组织内部时，要剥去上年生的鳞片， 甚至要除去韧皮组织，只接种内部的分生组织， 以收到一定的防污染效果。
（2）外植体的灭菌 ①多次灭菌法：一是将切好的外植体放入2.5%的次氯酸盐溶 液中消毒20-30min；二是在无菌蒸馏水中冲洗3次；三是将材 料封闭在无菌的培养皿中过夜，保持一定温度；四是第二天 再将外植体用2.5%次氯酸钠灭菌20-30min，然后用蒸馏水洗3 次。对层积过的种子可用多次灭菌法，在种子吸胀前后都要 灭菌。
很好 很好 很好 最好
好 好 很好 好 较好
（三）污染问题及解决措施 1. 污染的原因 污染——是指在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌， 导致培养失败的现象。 污染的原因：从病源菌方面来分析主要有细菌及真菌两大类； 从污染的途径而言，主要是由于外植体带菌、培养基及器皿灭 菌不彻底、操作人员未遵守操作规程等引起的。
4 无菌操作技术
一、外植体的选择与处理 二、外植体的接种和培养 三、试管苗的驯化与移栽 四、常见问题与解决措施
一、外植体的选择与处理
（一） 外植体的选择 （二） 外植体的处理 （三）污染问题及解决措施
（一）外植体的选择 植物组织培养的主要作业大致包括：外植体的选择与
处理、培养基的制备、器具的消毒、无菌操作和环境条件 的调控。
细菌污染的特点：菌斑呈粘液状物，而且在接种后1～2天即 可发现。 原因：材料带菌
培养基灭菌不彻底 操作人员未遵守操作规程 因此接种人员的手应经常用70%洒精擦净，镊子和接种针在使 用前必须在火焰上烧红。
真菌污染的特点：污染部分长有不同颜色的霉菌，在接种后 3～10天才能发现。 原因：周围环境不清洁
尔敏或75%的酒精擦洗，然后用紫外灯照射约20min。使 用前用75%的酒精喷雾，使空间灰尘落下。一年中要定 期一、二次用甲醛和高锰酸钾熏蒸。 • （7）操作人员在接种时一定要严格按照无菌操作的程 序进行
二、外植体的接种和培养 （一）外植体的接种 （二）外植体的培养
（一）外植体的接种
外植体的接种——是把经过表面消毒后的植物材料切碎 或分离出器官、组织、细胞，并将它们转放到无菌培养 基上的全部操作过程。整个接种过程均须无菌操作。操 作过程中引起的污染，主要由空气中的细菌和工作人员 本身引起的。因此除接种室空气消毒外，应特别注意防 止工作人员本身引起的污染。
②对易污染而难灭菌的材料用多种药液交替浸泡消毒： • 一是将外植体用洗涤液充分洗净并修整干净； • 二是将材料放入75%洒精中灭菌30-60s； • 三是在1：500的Roccal B（一种商品灭菌剂名）稀释液中