小鼠骨髓间充质干细胞分离培养新方法
发育生物学实验指南简要
实验一小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养一、目的要求1．掌握小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养方法。
2．了解小鼠骨髓间充质干细胞的鉴定方法。
3．了解小鼠骨髓间充质干细胞定向分化和鉴定方法。
二、材料与设备1．动物：SD大鼠。
2．主要试剂：胎牛血清（FBS），DMEM--LG培养基，PBS，抗体（NSE和GFAP）。
3．主要器材与仪器：手术剪，手术镊，眼科剪，眼科镊，培养瓶，培养皿，称量瓶，刻度离心管，吹打管，注射器，倒置相差显微镜，CO2培养箱三、实验步骤1．小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal stem cells,BMSC)的分离培养:⑴小鼠BMSC的分离和原代培养：①以颈髓离断法处死小鼠。
在无菌条件下取出小鼠股骨，除去骨表面附着的组织，用PBS 清洗干净。
②用剪刀去除股骨两端，暴露骨髓腔。
无菌条件下用5ml注射器抽取PBS约3-4ml将小鼠股骨内的骨髓冲出，收集骨髓冲洗液，将收获的全部骨髓用注射器反复抽吸，以打散组织成为细胞悬液。
③收集细胞悬液约7ml并将其转入15毫升离心管中，1500r/min离心5min，弃上清液及脂肪层。
④在细胞沉淀中加入5-6ml含10%胎牛血清的DMEM一LG培养基，倒置显微镜下观察，37℃、5%CO2 培养箱中培养。
2. 带学生在电脑上观看以往的小鼠间充质干细胞免疫荧光图片。
实验二大鼠神经干细胞的分离培养一、目的要求1．掌握大鼠胚胎神经干细胞的分离培养方法。
2．了解大鼠胚胎神经干细胞的鉴定方法。
3．了解大鼠胚胎神经干细胞定向分化和鉴定方法。
二、材料与设备1．动物：孕龄约15天的Wistar或SD孕鼠2．试剂：条件培养基(DMEM/F12+20ng/mlbFGF+20ng/mlEGF+20μl/mlB27)，D-Hank’s液(NaCl 8g, KCL0.4g，Na2HPO4.12H2O 0.1g, KH2PO4 0.06g, NaHCO3 0.35g, 加水1000ml溶解，调PH 值为7.2－7.4，高压灭菌后，4℃储存备用)，0.25％胰蛋白酶（D-Hank’s液配制，过滤灭菌，-20℃储存），抗体(巢蛋白、NSE、GFAP)。
贴壁法培养不同龄小鼠骨髓间充质干细胞的生物学特点
中国实验诊断学
２Ｏ 年 １ 第 ｌ 卷 Ｏ７ 月 １
第１ 期
一
ｌ 一 ３
文章编号 ：０７ ２７ ２０ ）１ ０ ３ ３ １０ —４８ （０７０ —０ １ —０
贴 壁法培养不 同龄小 鼠 骨髓 间充质干细胞 的生物学特点
杨 光 范东艳 陈 强 ， ， ， 任淑萍 ， 尹维田‘
选取出生 １ 、 周 、 周 的健 康昆明小 鼠 ， 周 ８ １ ６ 分成新 生 、 年 、 年三组 ， 青 成 采用
各组 细胞 约在 ９—１ ２天
贴 壁法分离培养骨髓间充质干 细胞 ， 进行 细胞形态 学和贴壁率 观察 ， 制生长 曲线 。结果 绘
８％一 ０ ０ ９％长满培养瓶底， 融合成单层， 传代后的骨髓间充质干细胞形态 医院 手外科 ， ｔ 吉林 长春 １０３ ； ． ３０３ ２吉林大学公共 卫生学 院 毒理学教研室 ） 摘要 ： 目的 观察不 同龄小 鼠骨髓 间充质干细胞在体 外分离 、 培养、 扩增 的过 程 ， 并对其 生物学特性进行 初步 比
较分析 ， 为下一步实验提供依据。方法
细胞 。贴壁率的观察和生长曲线显 示 ， 在相同的培养条件下 ， 新生小 鼠细胞增殖最快 ， 细胞可扩增 能力最强 ， 而成年 小 鼠细胞增殖最慢 ， 细胞可扩增能力最弱 ， 青年 小 鼠细 胞介于两 者之 间。结论 关键词 ： 骨髓 ； 间充质干细胞 ； 鼠； 小 细胞培养 中图分类号 ： ４ １ Ｑ ２ ＹＮ ｕｎ Ｆ ＮＤ ｎ－ａ Ｃ Ｅ Ａ ＧＣａｇ。Ａ ｏｇｙｎ， Ｈ Ｎ ，
ｄ 】 ｅｅ【 ｍ ｂｃ ｇｏｎ ｒｆｒ ａｋ ｒｕ ｄｆ ｕ・ ｏ
Ｂｏ￣ ｅｌ ｈ ｒｅｅ ｔｓ ｆＩ ＩＯ ＂ 瑚 ， ｌ ｔ ｃｌ ｍｉ ｆ ｍ＇ｅｔ ｇｓ ｕｔｒｄｉ ｉｏｗ ｔ ｄｅｅｔ ｌｌ ａ ａａｔ ｌ ＩＢ ￣ ｍ 邛日 ｓ ｍ ｌｏ ｃ ｏ ｄ ｅ ｎ ｅ ｌ ｅ ｎｖｒ ｉ ａ ｈｒｎ ｍｄｌ ｅ ｄｓｅ ｏ Ｉ＇ Ｔ ｅ ｅｓ ｆ ｅ ｒ ａ ｃ ｕ ｔ ｈ １ ． ｄ： ｂｅ ｔｅ ｏｏ ｅｖ ｅｆ ｔ ｅｏ ｔ ｃｏ ，ｅａａｏ ，ｕｕｅａｄ 峨哪； ｏ ｉ ｒ ｗ ｍ ｓｎｈｍ ｌ ｔ ｅｓ Ｏ Ｊｄ ｖ Ｔ ｌ ｒ ｔ ａ ｒ ｆｅ ｒ ｔ ｎ ｓ ｒｔｎ ｃｌ ｒ ｎ ￣ ｅｈ ｅｕ ｘａ ｉ ｐ ｉ ｔ ｅ ｆ／ ｌ ｅ ｅｙ ａ ｓ ｍ ｃｌ ｌ ＇ ａｏ ｅ ｅ ｌ
小鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养和鉴定方法学探讨
２ ０ １ ３年 ４月
第１ ７卷
第４
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６ ４７ ・ － — — —
文章编号 ： １ ０ ０ ７ —４ ２ ８ ７ （ ２ ０ １ ３ ） ０ ４ —０ ６ ４ ７ —０ ４ ．
小 鼠骨 髓 间充 质 干 细胞 的体 外 分 离 培 养 和 鉴 定方 法 学 探讨
无 菌条 件 下 分 离 处 死 后 取 小 鼠双 下 肢 骨 ， 低糖 Ｄ ＭＥ Ｍ 培 养 液 冲 出骨 髓 ， 离心 ５ ａｉ ｒ ｎ ｓ ， 用５ ｍｌ 含 １ Ｏ
胎 牛 血 清 的低 糖 ＤＭＥ Ｍ 培养液重悬 细胞。加入等体积密度为 １ ． ０ ７ ３ ｇ ／ Ｉ ｐ ｅ ｒ ｃ ｏ ｌ １ 分离液离心 ３ ０ ｍｉ ｎ ｓ 。取 中层 云雾 状 细 胞 。３ ７ ℃、 ５ Ｃ Ｏ 培 养箱 中 贴 壁 培 养 。取 ５ ～ １ Ｏ代 细 胞 培 养 至 对 数 生 长期 后 ， 洗 涤 离 心 。取 １ ０ ０ ｌ 细 胞 悬 液 分 别 加
Ｇ ｕ ａ ｎ ｇ — ｙ ｕ ｅ 。 Ｃ ＨＥＮ Ｓ ｕ — ｐ ｉ ｎ ｇ ， ＤＩ ＮＧ Ｊ ｕ ｎ — ｌ ｉ ， ｅ ｔ ａ １ ． （ １ ． Ｄｅ ｐ ａ ｔ ｍｅ ｎ ｔ ｏ ｆ Ｌ ａ ｂ ｏ ｒ ａ ｔ ｏ ｒ ｙ， ２ ． Ｄｅ ｐ ａ ｔ ｍｅ ｎ ｔ ｏ ｆ Ｐ ａ ｔ ｈ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ Ｐ
ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ ｉ ｎ ｖ ｉ ｔ ｒ ｏ， ｆ ｉ ｎ ｄ ａ ｂｅ ｔ ｔ ｅ ｒ ｃ ｅ ｌ ｌ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｅ ｃ ｏｎ ｄｉ ｔ ｉ ｏｎ ｔ ｏ ｓ ａ ｔ ｉ ｓ ｆ ｙ ｔ ｈｅ ｉ ｒ ｑｕ ａ ｌ ｉ ｔ ｙ ａ ｎｄ ｑｕ ａ ｎｔ ｉ ｔ ｙ ． Ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄｓ Ｔ ｈｅ ｍｉ ｃ ｅ ｗｅ ｒ ｅ ｋｉ ｌ ｌ ｅ ｄ ｕ ｎ—
小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化及鉴定
小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化及鉴定赵继学;王广义;张海玉;伏鑫【摘要】目的探讨分离、培养、纯化和鉴定小鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)方法,观察MSCs体外生长特征.方法取小鼠胫骨和股骨,取出骨髓细胞,用1.073 g/ml的Percoll分离液梯度离心,培养皿培养、换液除去非贴壁细胞,获得MSCs,通过传代对MSCs进行纯化和扩增培养.进行形态学观察,测定生长曲线,用流式细胞仪检测P3代MSCs细胞周期及表面抗原.结果新分离的MSCs呈小圆形,形态规整.培养传代后,细胞大小均匀,形态较一致,多为梭形.P1、P2、P3代MSCs生长曲线均呈S型.P3代MSCs 75.27%的细胞处于G0-G1期.P3代MSCs CD44表达阳性,表达率为88.71%,CD34表达阴性.结论利用密度梯度离心法联合贴壁培养法分离纯化骨髓MSCs,在含15%FBS的DMEM-LG培养基中培养MSCs,可获得稳定生长的昆明小鼠MSCs.培养的MSCs细胞系性状稳定,表型稳定均一,适于做进一步研究.%Objective To explore a new method for the isolation, cultivaton, purification and identification of MSCs and observe the biological features of mice MSCs in vitro. Methods Bone marrow was extracted from the tibia and thighbone of mice. The marrow liquid were isolated with 1. 073 g/ml ocrcoll. MSCs were obtained by removing the non-adherent cells. Then the MSCs were purified and expanded through passage in time. The growth curve was drawn and the morphology was observed. Cell cycle and the antigen expression of P3 MSCs were measured with FACS. Results The MSCs exhibited a small round shape after fresh separation. After cultivated and passaged,the MSCs were homogcnenously fusiform shaped. The growth curves of P1 ,P2 and P3MSCs were "S" shape. The cells of G0-G1 stage account for 75. 27%. The expression of CD 44 was positive, while the expression of CD34 was negative. Conclusion The method of density gradient centrifugation combined with adherent culture could isolate MSCs from bone marrow simplcly. DMEM-LG medium supplemented with 15% fetal bovine scrum is suitable for the culture of MSCs. The cultured MSCs lineage is stable and can be used for further research.【期刊名称】《中国实验诊断学》【年(卷),期】2012(016)001【总页数】3页(P11-13)【关键词】骨髓间充质干细胞;细胞培养;鉴定;小鼠【作者】赵继学;王广义;张海玉;伏鑫【作者单位】吉林大学第一医院儿外科,吉林长春130021;吉林大学第一医院普外科,吉林长春130021;吉林大学第一医院儿外科,吉林长春130021;中日联谊医院【正文语种】中文【中图分类】Q78骨髓间充质干细胞（MSCs）是骨髓中存在的除造血干细胞（HSCs）外的另一类干细胞。
小鼠骨髓细胞提取及培养
小鼠骨髓细胞的提取1、脱臼处死小鼠，投入到装有75%酒精的烧杯中浸泡3-5分钟，把小鼠拿到细胞房。
2、用保鲜袋平铺在安全柜内，并将小鼠放置在保鲜袋上进行实验操作。
3、用眼科镊小心捏起小鼠两髋关节之间的腹部皮肤，用眼科剪小心剪开皮肤，并分离两下肢的皮肤，往下在脚踝处剪断，往上在髋关节处剪断，这样可以游离出小鼠的两条下肢。
4、小心剥离下肢的肌肉，取下胫骨和股骨，并放到装有75%酒精的培养皿中。
5、把小鼠尸体拿出，清理干净安全柜，换上新的手套。
6、拿5ml和20ml的无菌注射器各一支，用20ml的注射器吸取已配好的1640，换装一个5ml注射器的针头。
轻轻插入骨髓腔，对准一个无菌50ml离心管，将细胞冲出。
7、将骨髓细胞都冲出来后，4300rpm离心5分钟，去上清。
8、加进3-4ml的红细胞裂解液静置3-4min以裂解红细胞，加入30-40ml无菌的PBS（按加入红细胞裂解液与PBS间1:9的比例加入PBS）。
9、将含BM细胞的混合液通过细胞筛过滤到新的50ml离心管中。
10、4300rpm离心5min，弃上清，得到骨髓细胞沉淀。
骨髓细胞的培养1、加入一定量的GEBICO原装的1640，吹匀细胞沉淀，然后用计数板计数BM细胞的总数。
2、按照24孔板每个孔2-2.5million的细胞数来铺孔，算出要铺孔的数目。
3、根据每个孔需要2ml的培养基，可以算出所需培养基的总体积。
4、培养BM细胞的培养基是按照90% GEBICO原装的1640、10%FBS、1%双抗、1‰β-ME和万分之二的GM-CSF来配成。
5、细胞跟培养基充分混匀后，把细胞混合液铺倒24孔板中培养。
注意：1、一定要注意整个过程都要在无菌环境下操作，一切用品都要保证无菌。
2、剥离骨头时一定要保持骨头的完整，小心不要剪断。
3、培养基和PBS一定要各自分装好标清楚，自己用自己的，避免交叉污染。
小鼠骨髓细胞提取及培养
小鼠骨髓细胞提取及培养小鼠骨髓细胞的提取1、脱臼处死小鼠，投入到装有75%酒精的烧杯中浸泡3-5分钟，把小鼠拿到细胞房。
2、用保鲜袋平铺在安全柜内，并将小鼠放置在保鲜袋上进行实验操作。
3、用眼科镊小心捏起小鼠两髋关节之间的腹部皮肤，用眼科剪小心剪开皮肤，并分离两下肢的皮肤，往下在脚踝处剪断，往上在髋关节处剪断，这样可以游离出小鼠的两条下肢。
4、小心剥离下肢的肌肉，取下胫骨和股骨，并放到装有75%酒精的培养皿中。
5、把小鼠尸体拿出，清理干净安全柜，换上新的手套。
6、拿5ml和20ml的无菌注射器各一支，用20ml的注射器吸取已配好的1640，换装一个5ml注射器的针头。
轻轻插入骨髓腔，对准一个无菌50ml离心管，将细胞冲出。
7、将骨髓细胞都冲出来后，4300rpm离心5分钟，去上清。
8、加进3-4ml的红细胞裂解液静置3-4min以裂解红细胞，加入30-40ml无菌的PBS（按加入红细胞裂解液与PBS间1:9的比例加入PBS）。
9、将含BM细胞的混合液通过细胞筛过滤到新的50ml离心管中。
10、4300rpm离心5min，弃上清，得到骨髓细胞沉淀。
骨髓细胞的培养1、加入一定量的GEBICO原装的1640，吹匀细胞沉淀，然后用计数板计数BM细胞的总数。
2、按照24孔板每个孔的细胞数来铺孔，算出要铺孔的数目。
3、根据每个孔需要2ml的培养基，可以算出所需培养基的总体积。
4、培养BM细胞的培养基是按照90% GEBICO原装的1640、10%FBS、1%双抗、1‰β-ME和万分之二的GM-CSF来配成。
5、细胞跟培养基充分混匀后，把细胞混合液铺倒24孔板中培养。
注意：1、一定要注意整个过程都要在无菌环境下操作，一切用品都要保证无菌。
2、剥离骨头时一定要保持骨头的完整，小心不要剪断。
3、培养基和PBS一定要各自分装好标清楚，自己用自己的，避免交叉污染。
间充质干细胞分离及培养方案
取小鼠（C57）两只，脱颈（大镊子卡住颈部）窒息而死，75%酒精在平皿中完全浸泡10分钟
无菌条件下脱皮，取出双侧股骨，胫骨，弘骨，除去肌肉和骨膜
用含1%双抗（青霉素+链霉素）的Hanks’液冲洗三次（无菌操作）
用剪刀剪去股骨，胫骨，弘骨的骨骺端，露出骨髓腔（无菌操作）
0.5毫升的重悬细胞液+4.5毫升4%的冰乙酸（对细胞液10倍稀释，分解红细胞），进行细胞计数，根据细胞数再确定稀释倍数
以1x107的浓度进行接种与培养瓶（塑料，带透气），37℃，5%CO2培养，48小时后换液，之后每两天换液一次
用不含双抗的M199培养基5毫升冲出骨髓，再吸取培养液继续冲洗，直至骨髓腔发白为止（无菌操作）
用纱布（两层纱布）在漏斗中进行细胞液的过滤，过滤到100毫小瓶子中（无菌操作）
将细胞液分到10毫升的离心管，1000转离心10分钟（无菌操作）
10毫升的M199培养基（不含双抗）对离心后的细胞进行重悬，吹打细胞时要轻（无菌操作）
分离小鼠骨髓间充质干细胞的方法
分离小鼠骨髓间充质干细胞的方法一、分离方法说明及图例A.Ⅰ.取新鲜抗凝血液或脐带血与羟乙基淀粉550（Cat#：HES-TBD550）按1:1比例混合，37℃反应5-10分钟（5ml以下样本反应5分钟，5ml以上样本反应10分钟）；Ⅱ.取新鲜抗凝骨髓，加入一份细胞洗涤液（Cat#：2010X1118），混匀后以400g（约1500转/分）离心5分钟，弃去上清。
沉淀与羟乙基淀粉550（Cat#：HES-TBD550）按1:1比例混合，37℃反应5-10分钟（5ml以下样本反应5分钟，5ml以上样本反应10分钟）；B.加入为步骤A中所得混合液1/2体积的全血及组织稀释液（Cat#：2010C1119）混匀20℃-30℃自然沉降20-30分钟，吸取上清备用；C.向步骤B中所得上清液中加入为其一倍以上体积的细胞洗涤液（Cat#：2010X1118）混匀，以500g（约1800转/分）离心15分钟（半径15cm水平转子），弃去上清保留沉淀细胞；D.向细胞沉淀中加入全血及组织稀释液（Cat#：2010C1119）调整细胞浓度为2×108—1×109个/ml，小心叠加于细胞分离液之液面上（混合液：分离液=2:1）；（本实验采用天津灏洋TBD生物实验室的分离液）E.以400g（约1500转/分）离心20分钟（半径15cm水平转子）；第三层；为透明分离液层。
第四层；为极少数红细胞层。
收集第二层细胞放入约为其5-10倍体积的细胞洗涤液（Cat#：2010X1118）中，充分混匀后以500g（约1800转/分）离心1 5分钟。
沉淀经反复洗涤2次既得所需干细胞。
F.为获得纯度更高的干细胞，在步骤E中离心完成后可吸取第二层干细胞层再与羟乙基淀粉550（Cat#：HES-TBD550）按1:1比例混匀，20℃-30℃自然沉降20-30分钟，收集上清加入细胞洗涤液500g（约1800转/分）离心15分钟。
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间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)是骨髓中除造血干细胞外另一重要的干细胞。
MSC 具有自我更新、多向分化、免疫调控和支持造血的能力，而且来源广泛，容易在体外培养和扩增，目前已经应用于临床并显示了良好的治疗效果。
虽然MSC临床应用广泛，但许多关键问题如免疫调控的具体机制等并未解决。
小鼠是重要的实验动物之一，广泛用于基础实验研究。
在体外成功分离培养MSC，并得到大量纯化的MSC是研究其分化及功能调控机制的前提。
目前分离小鼠骨髓MSC的方法包括全骨髓贴壁法、骨片消化法、流式或磁珠分选法等。
然而全骨髓贴壁法获得的细胞往往含有不少造血细胞；骨片消化法需要进行胶原酶消化，步骤多且消化时问不好控制；流式或磁珠法虽然获得细胞较纯，但程序复杂，花费高且获得的细胞相对少。
骨髓MSC的分离目前常用的方法有全骨髓贴壁法、骨片消化法和流式细胞术或磁珠分选法。
全骨髓贴壁法即根据MSC的贴壁性，定期换液除去不贴壁细胞，从而达到纯化MSC的目的。
然而该方法获得的MSC往往含有较多基质细胞和造血细胞污染。
我们的结果也显示，全骨髓贴壁法原代培养的细胞有75％为CD45阳性的细胞，传至第3代，MSC中仍有5％的CD45阳性细胞，即造血细胞。
骨片消化法，是先将骨髓冲干净，将股骨和胫骨剪碎，然后进行胶原酶消化。
虽然该方法获的MSC纯度较高，但是程序复杂，且不同鼠龄骨片胶原酶消化时间不同，不容易掌握。
随着对MSC表面抗原认识的深入，有研究者利用免疫方法如流式细胞仪法、免疫磁珠法对其进行分离纯化旧191；虽然这些方法可以得到纯度较高的细胞，但分离过程对细胞的活性影响较大，甚至导致细胞完全失去活性；而且实验条件要求高，需要骨髓量大，加之耗费较大和技术难度，在某种程度上限制了这些方法的广泛应用。
本研究采用骨髓加骨片法分离小鼠MSC，即将股骨和胫骨肌肉去干净后，不需冲骨髓，不需消。