比较不同培养基培养脐带间充质干细胞
无血清培养体系分离培养人脐带间充质干细胞
无血清培养体系分离培养人脐带间充质干细胞张丽;王文芳;郭芸;邓丹琪;黄雅亮;纪秋琴;张佩莲【摘要】目的用体外无血清培养体系分离培养人脐带间充质干细胞.方法取1例足月妊娠剖宫产健康胎儿脐带,采用组织块贴壁培养,使用无血清培养体系培养获得人脐带间充质干细胞.通过形态学观察,成脂、成骨、成软骨诱导分化能力检测及流式细胞术免疫表型检测进行鉴定.结果组织块贴壁培养6天后可见细胞从组织块边沿爬出;培养15天后,达到80％汇合,生长状况良好,细胞呈梭形,为典型的成纤维细胞形态,极性整齐排列,集落呈涡旋状,形态较均一.传代培养的第三代细胞CD29、CD44、CD90、CD105均为阳性表达,不表达CD34和CD45,均具有成脂、成骨、成软骨分化的能力.结论无血清培养体系组织块贴壁法分离培养人脐带间充质干细胞法成功率高,其生物学特性稳定,并能消除由未确定的病原体引起的风险.【期刊名称】《皮肤病与性病》【年(卷),期】2019(041)001【总页数】3页(P4-6)【关键词】脐带间充质干细胞;分离;贴壁培养【作者】张丽;王文芳;郭芸;邓丹琪;黄雅亮;纪秋琴;张佩莲【作者单位】昆明医科大学基础医学院,云南昆明650500;昆明医科大学第二附属医院皮肤科,云南昆明650101;昆明医科大学第二附属医院皮肤科,云南昆明650101;昆明医科大学第二附属医院皮肤科,云南昆明650101;昆明医科大学第二附属医院皮肤科,云南昆明650101;昆明医科大学第二附属医院皮肤科,云南昆明650101;昆明医科大学第二附属医院皮肤科,云南昆明650101【正文语种】中文【中图分类】R392-33人脐带间充质干细胞（Human umbilical cord mesenchymal stem cells，HUC-MSCs）是从人脐带组织中分离的间充质干细胞，具有增殖能力，如：神经元样细胞、星形胶质细胞、脂肪细胞及少突胶质细胞分化的能力，由于脐带体外细胞能迅速扩增，生物性能稳定，取材比较容易并且细胞来源相对广泛，在细胞移植、基因治疗等领域具有广阔的前景，已经成为治疗的一种新的种子细胞来源[1、2]。
比较不同培养基培养脐带间充质干细胞
比较不同培养基培养脐带间充质干细胞作者：王蓓来源：《医学信息》2014年第20期摘要：目前的培养体系和培养方法中通常采用的是含10%~20%胎牛血清的培养基，但含血清培养基使临床细胞治疗受到限制，存在不安全因素。
通过对脐带间充质干细胞在IMDM、DMEM/F12（不含酚红）及无血清培养基StemProRMSC SFM的培养扩增，比较三种培养体系的优略。
建立从减血清到无血清的培养体系，减少血清对临床细胞治疗的干扰，提高临床细胞治疗的稳定性与安全性。
关键词：有血清培养基;无血清培养基;脐带间充质干细胞随着对脐带间充质干细胞生物学特性及功能的深入研究，脐带间充质干细胞可在体外大量培养扩增，且生物性能稳定，多次传代扩增仍能保持旺盛的功能。
同时脐带间充质干细胞还具有取材方便，无伦理学限制，免疫原性相对纯净的优势，可以为实验和临床提供足够的细胞来源。
1资料与方法1.1一般资料经产妇知情同意，采集足月剖宫产健康胎儿脐带，无菌情况下放入含有抗生素的生理盐水中，4℃保存，6h内无菌处理。
1.2脐带的分离和原代培养植块法分离脐带：用止血钳及剪刀无菌取胎儿脐带4~5cm，D-hank's液充分洗涤，去除脐静脉及动脉内的新鲜血液，分离并去除脐带外膜组织和血管组织，获得脐带wharton胶。
将其剪碎至1mm3组织块，使用吸管将组织块逐一植入T75培养瓶底，密度20~25块/瓶为宜，组织小块在瓶底要分布均匀，倒置放入37℃，体积分数为5%CO2饱和湿度培养箱内。
3~5h后待组织块粘附牢固正向放置到超净台内，加入适量含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，正向放入体积分数为5%CO2饱和湿度培养箱内。
72h后换液，一般5~7d可有间充质干细胞爬出。
1.3脐带间充质干细胞在不同培养体系的体外扩增将原代细胞完全爬出后，在IMDM、DMEM/F12（不含酚红）、StemProR MSC SFM三种培养体系中传代培养，在生长过程中进行形态学观察。
脐带间充质干细胞培养操作细则
脐带间充质干细胞分离培养操作细则一、样本接收1.观察运输箱的温度是否符合要求，采集瓶有无渗漏。
2.查看客户信息是否与交接表一致。
3.样本采集瓶外表面喷酒精擦拭消毒，并粘贴样本编码，填写样本接收记录，传入洁净区准备制备。
二、脐带间充质干细胞分离与接种1）准备耗材试剂：10cm培养皿、15ml离心管、50ml离心管、离心管架、10ml 移液管、T75培养瓶、离心管架、无尘布、50ml注射器针头、封口膜、灭菌止血钳、灭菌镊子、灭菌剪刀、废液缸、无血清干细胞培养基（常温复温）、生理盐水、75%酒精（已过滤）。
2）仪器设备准备及预热：电动移液枪、生物安全柜、离心机3）将75%酒精喷到台面，用无尘布擦拭台面，包括侧面及玻璃。
4）将生物安全柜开紫外30min通风10min，样本喷酒精擦拭，放入生物安全柜中，电动移液枪、移液管、离心管、离心管架喷酒精擦拭放入生物安全柜中，无菌棉球放入到广口瓶中加75%酒精放入生物安全柜中。
50ml、15ml离心管放到离心管架上，10cm皿5-7个。
将装有灭菌器械的灭菌盒喷酒精擦拭放入生物安全柜中。
5）取5个10cm皿依次摆开，1，2，4，5号皿依次加入适量的生理盐水，3号皿加入适量的已过滤的75%酒精。
拿出灭菌盒中已灭菌的止血钳，将脐带从保存瓶中取出放到第一个皿里，并取适量样本保存液留样送检支原体。
使用两个止血钳将脐带在第一个皿里清洗尽量去除脐带外表面的血污以及动静脉的血液和血凝块，将脐带转移至2号皿中，同样的方法再次清洗一次并测量其长度。
6）将清洗干净的脐带转移到装有已过滤75%酒精的3号皿中浸泡1min左右（不要超过两分钟），计时结束后，将脐带转移至4号皿中，同样的洗涤方法去除酒精。
清洗结束后将脐带剪成1-2cm短节，放入5号皿中，再次洗涤尽量去除血管内的血污。
再次拿两个10cm皿，加入适量的生理盐水，去一皿的盖子加少许盐水湿润底部及可。
7）将1-2cm的脐带小段转移到新的皿里，用带齿口的镊子取一段脐带，将脐带展开，再按血管走势剔除脐带的两条动脉，一条静脉。
无血清和有血清培养人脐带间充质干细胞的对比
《中国组织工程研究》 Chinese Journal of Tissue Engineering Research文章编号:2095-4344(2018)13-02020-07 2020www.CRTER .org·研究原著·张学娟，女，1993年生，云南省大理州人，白族，昆明医科大学在读硕士，主要从事人脐带间充质干细胞与衰老相关研究。
并列第一作者：刘高米洋，女，1988年生，云南省宣威市人，汉族，2014年海军军医大学(原第二军医大学)毕业，硕士，医师，主要从事脐带间充质干细胞的临床转化研究。
通讯作者：潘兴华，博士后，主任医师，教授，解放军昆明总医院细胞生物治疗中心，干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合工程实验室，云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室，云南省昆明市 650032中图分类号:R394.2 文献标识码:A稿件接受：2018-02-02Zhang Xue-juan, Master candidate, Kunming General Hospital Clinical College of Kunming Medical University, Kunming 650032, Yunnan Province, China; CellBiological Therapy Center of Kunming General Hospital of PLA, Cell Biological Medicine Integrated Engineering Laboratory of State and Region of Yunnan Province, the Stem Cell Therapy Key Laboratory of YunnanProvince, Kunming 650032, Yunnan Province, ChinaLiu Gao-mi-yang, Master, Physician, Cell Biological Therapy Center of Kunming General Hospital of PLA, Cell Biological Medicine Integrated Engineering Laboratory of State and Region of Yunnan Province, the Stem Cell Therapy Key Laboratory of YunnanProvince, Kunming 650032, Yunnan Province, ChinaZhang Xue-juan andLiu Gao-mi-yang contributed equally to this work.无血清和有血清培养人脐带间充质干细胞的对比张学娟1，2，刘高米洋2，刘菊芬2，宋乙甲1，2，林庆铿1，2，白盈盈1，2，潘兴华2 (1昆明医科大学解放军昆明总医院临床学院，云南省昆明市 650032；2解放军昆明总医院细胞生物治疗中心，干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合工程实验室，云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室，云南省昆明市 650032)DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.0496 ORCID: 0000-0003-2572-725X(张学娟)文章快速阅读：文题释义：胎牛血清：含有细胞生长所需的基本营养成分和丰富的生物活性因子(如生长因子、激素、多肽类物质等)，在细胞的代谢、增殖与分化中发挥着重要的调节作用，用于临床规模生产间充质干细胞的大多数分离和扩增方案均使用补充有体积分数为10%胎牛血清的培养基。
脐带血间充质干细胞体外分离_纯化及培养
脐带血间充质干细胞体外分离、纯化及培养陈 镭1,惠国桢2,栾文忠1,苗宗宁3,王 玲3,陆 华3,吴智远2,芦 奕2(1.天津医科大学,天津,300070; 2.江苏省无锡市第三人民医院细胞实验室,江苏无锡,214019;3.苏大学附属第一医院神经外科,江苏苏州,215006)摘 要:目的 研究脐带血(HUCB)中含有的间充质干细胞(M S Cs)体外分离、纯化及培养条件,探究其作为种子细胞应用于实验和临床的可行性。
方法 无菌条件下取正常足月剖腹产的脐带血,经肝素抗凝,用淋巴细胞分离液分离脐血的单个核细胞,以偏酸性的M esen cult T M 作为培养基进行培养和纯化获得贴壁细胞层,用流式细胞仪检测M SCs 表面抗原。
结果 来源于脐血的单个核细胞经体外培养贴壁后出现破骨样及间充质样的细胞,间充质细胞为成纤维样的细胞形态,并表达M SCs 相关的抗原(CD 29、CD 44、CD 166),但不表达造血细胞抗原(CD 34、CD 45),这与源于骨髓的M SCs 一致。
结论 脐带血来源的M SCs 能在体外培养、扩增,而用于满足实验和临床的需要。
关键词:脐带血;间充质干细胞;体外培养中图分类号:R 329 2 文献标识码:A 文章编号:1672 2353(2004)01 0012 03THE ISOLATION PURIFICATION ANDCULTURE OF HUCA MSCsCHEN Lei,HUI Guo zen,RUAN Wen zong,MIAO Zong ning,WANG Ling,LU HUA,W U Zhi yuan,LU Li(1.T ianj in M edical Univer sity ,T ianj in,300070;2.Cell Dep ar tment,T hir d H osp ital of W ux i ,W ux i ,Jiangsu ,2140001;3.Dep ar tment of Neurosur gery ,First A f f iliated H osp ital of Suz houUniversity ,Suz hou,Jiangsu ,215006)ABSTRAC T Objective:To investig ate the isolation,purification and culture of hum an umbilical cord blood(HUCB)mesenchymal stem cells(M SCs)in vitro,and to observe the feasibility of using M SCs as seed cells in experiment and clinic.Methods:HUCB w ere collected from full term deliveries scheduled for cesarean section,all specimens w as obtained sterilely w ith preservative free heparin,the cord blood mononuclear cell w as isolated by lymphocyte separation medium,and puri fied and culture with M esencult T M medium and acidic environment to produce adherent layer,the surface antig en ex pression of MSCs was detected by flow cytometry.Results:The UCB derived mononuclear cells,when set in culture,gave rise to adherent cells,w hich ex hibited either an osteo clast or mesenchym al like phenoty pe,cells w ith the M SCs displayed a fibroblast like morpholog y and ex pressed several MSCs related antigens (CD 29,CD 44,CD 166),but did not ex press haematopoi etic cells antigens(CD 34,CD 45),which w as identical to human bone marrow derived M SCs.C on clusion:M SCs in H UCB can culture and expand in vitro,which could be regarded as an alternative source of MSCs for experimental and clinical needs.KEY WORDS umbilical cord blood;mesenchymal stem cells;culture in v itro脐带血(human umbilical cord blood,HUCB)是胎儿出生时脐带内及胎盘近胎儿一侧血管内的血液,含有丰富的干细胞和祖细胞,其主要包含造血干细胞和间充质干细胞(mesenchy mal stem收稿日期:2003-12-16基金项目:国家自然科学基金资助项目(30271325)、江苏省自然科学基金资助项目(BK2001170)作者简介:陈镭(1965-),男,天津市人,在读博士研究生。
基于细胞生物学方法比较5种不同组织来源间充质干细胞的特征
基于细胞生物学方法比较5种不同组织来源间充质干细胞的特征刘超; 黄玉香; 张丽君; 陶昊; 杜心洁; 王芮; 李文菁; 丁淑梅; 王怡; 姜磊【期刊名称】《《中国组织工程研究》》【年(卷),期】2019(023)033【总页数】7页(P5334-5340)【关键词】间充质干细胞; 组织块培养法; 胰酶消化法; 脐带胎盘连接处间充质干细胞; 脐带间充质干细胞; 脂肪间充质干细胞; 底蜕膜间充质干细胞; 绒毛膜间充质干细胞【作者】刘超; 黄玉香; 张丽君; 陶昊; 杜心洁; 王芮; 李文菁; 丁淑梅; 王怡; 姜磊【作者单位】临沂市妇女儿童医院山东省临沂市 276000; 青岛奥克生物开发有限公司山东省青岛市 266000; 青岛大学附属医院山东省青岛市 266000【正文语种】中文【中图分类】R459.9; R394.2; R3180 引言 Introduction随着细胞生物学的进步，细胞治疗作为一种新疗法或新药物登上历史舞台，其中间充质干细胞治疗难治性疾病取得了显著进展。
间充质干细胞能够释放细胞因子和外泌体[1]，可以调控免疫系统[2]、定向迁移至受损组织并起到促进组织损伤修复的作用[3-4]，目前在肠炎[5]、糖尿病以及移植物抗宿主反应等疾病的临床治疗中取得了良好效果[6-7]。
目前国际上公认的间充质干细胞是一类具有克隆形成能力、能够多向分化并贴壁生长的细胞[8]，至少具备三大分化能力，即成骨、成软骨和成脂肪分化[9]。
间充质干细胞广泛分布在人体组织中，其中胎盘、脐带是间充质干细胞最理想的来源，在采集过程不会对人体造成损伤，不存在伦理问题，并且获取到的干细胞数量大。
间充质干细胞来源越来越丰富，不同来源的间充质干细胞必然存在差异，早在2007年Friedman等[10]研究发现骨髓间充质干细胞与脐带间充质干细胞分泌的细胞因子存在差异，而这些差异是否影响临床应用还需要深入研究。
文章主要比较分析了胎盘、脐带以及脂肪来源间充质干细胞在细胞生物学上的一些特点，希望间充质干细胞在临床应用中更加精准。
密度梯度法与羟乙基淀粉法培养脐血间充质干细胞比较
遵
义
医
学
院
学
报
ＡＣＴＡ ＡＣＡＤＥＭ Ｉ ＡＥ Ｍ ＥＤＩ ＣＩ ＮＡＥ ＺＵＮＹＩ
ＶＯ １ ． ３ ６ Ｎｏ ． ５ ｏｃ ｔ ．２ ０１ ３
・
技 术与 方密 度梯 度 法 与 羟 乙基 淀 粉 法 培
ｃ ｏ ｒ ｄ ｂ ｌ ｏ ｏ ｄ ｍｅ ｓ ｅ ｎ ｅ ｈ ｙ ｍａ ｌ ｓ ｔ ｅ ｍ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ
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（ Ｄ ｅ ｐ ａ ｒ ｔ ｍ ｅ ｎ ｔ ｏ ｆ Ｐ ｅ ｄ ｉ ａ ｔ ｒ ｉ ｃ ｓ ， Ｔ ｈ ｅ Ａ ｆ ｉ ｆ ｌ ｉ ａ ｔ ｅ ｄ Ｈ ｏ ｓ ｐ ｉ ｔ ａ ｌ ｆ ｏ Ｚ ｕ ｎ ｙ ｉ Ｍ ｅ ｄ ｉ ｃ ａ ｌ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ， Ｇ ｕ ｉ ｚ ｈ ｏ ｕ Ｚ ｕ ｎ ｙ ｉ ５ ６ ３ ０ ９ ９ ， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ）
Ｍ ｏ ｎ ｏ ｎ ｕ ｃ ｌ ｅ ａ ｒ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ（ ＭＮ Ｃ ｓ ）ｗ ｅ ｒ ｅ ｈ ａ ｒ ｖ ｅ ｓ ｔ ｅ ｄ ｒ ｆ ｏ ｍ ｈ ｕ ｍ ａ ｎ ｕ ｍ ｂ ｉ ｌ ｉ ｃ ａ ｌ ｃ ｏ ｒ ｄ ｂ ｌ ｏ ｏ ｄ ．Ｔ ｈ ｅ ｍｏ ｒ ｐ ｈ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ｏ ｆ ＭＮ Ｃ
ｅ ｔ ｈ ｙ ｌ ｓ ｔ ａ ｒ ｃ ｈ ｓ ｅ ｄ ｉ ｍｅ ｎ ｔ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｗａ ｓ ｕ ｓ ｅ ｄ ｔ ｏ ｉ ｓ ｏ ｌ ａ ｔ ｅ ｈ ＵＣ Ｂ — ＭＳ Ｃｓ ｗ ｉ ｔ ｈ ａ ｄ ｈ ｅ ｒ ｅ ｎ ｔ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｅ ，ａ ｎ ｄ ｃ ｏ ｍｐ ａ ｒ ｅ ｄ ．
脐带间充质干细胞培养方法
(一)1.Sections of 8–10 cm of umbilical cords, which are routinely discarded, were internally washed with phosphate-buffered saline (PBS), supplemented with 3% penicillin/streptomycin (Invitrogen-Gibco, Grand Island, NY, ) and immediately immers ed in Dulbecco ’s modi fied Eagle ’s medium- low glucose (DMEM-LG; Invitrogen-Gibco) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS; Invitrogen-Gibco) and 3% penicillin/streptomycin (Invitrogen-Gibco). All samples were processed within 12 –15 h after collection.2. UCs were fil led with 0.1% collagenase (Sigma-A ldrich, St. L oui s, /sigma-aldrich/home.h tml) in PBS and incuba ted at 37°C for 20 min. Each UC was washed wi th proli feration medium, and the detach ed cell s were harvested after gentl e mass age of the UC. Cells were centr ifuged at 300 g for 10 min, resus -pended in prolifera tion medium, and seeded in 25-cm^ 2 flasks at a densi ty of 5 × 10^7 cells per ml.After 24 h of incubation, non-adherent cells were removed, and culture medi um was replace d every 3 days.（二）HuMSCs were prepared as previously described.8 Wharton's jelly was processed within 24 hours of collection and cut into pieces of about 1 mm3 for culture. These pieces were placed in 24-well plates and cultured in DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 5 ng/ml EGF, 5 ng/ml basic fibroblast growth factor, 100 U/ml penicillin and 100 mg/ml streptomycin, and 1 μg/ml amphoterin B. The culture plate was placed in an incubator with saturated humidity at about 37°C containing 5% (v/v) CO2. The medium was changed every three days and the cells were passaged when they reaching 70% confluence. Adherent cells were recovered by treatment with 0.25% trypsin for 3 to 5 minutes then centrifuged.(三) 脐带间充质干细胞的分离：脐带自手术台取下后，浸入含抗生素的生理盐水中，4 ℃保存，在操净台内取出脐带，用D-PBS冲洗净脐动脉和脐静脉内的残余血液，用止血钳和剪刀剔除上述血管，将脐带剪成1 mm^3大小的组织块后放入200 mL 蓝盖试剂瓶，加入质量/ 体积比为0.1%的Ⅱ型胶原酶30 mL，置于恒温振荡仪内持续消化6 h ，100 目筛网过滤收集细胞。
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比较不同培养基培养脐带间充质干细胞目前的培养体系和培养方法中通常采用的是含10%~20%胎牛血清的培养基，但含血清培养基使临床细胞治疗受到限制，存在不安全因素。
通过对脐带间充质干细胞在IMDM、DMEM/F12（不含酚红）及无血清培养基StemProRMSC SFM的培养扩增，比较三种培养体系的优略。
建立从减血清到无血清的培养体系，减少血清对临床细胞治疗的干扰，提高临床细胞治疗的稳定性与安全性。
标签：有血清培养基;无血清培养基;脐带间充质干细胞随着对脐带间充质干细胞生物学特性及功能的深入研究，脐带间充质干细胞可在体外大量培养扩增，且生物性能稳定，多次传代扩增仍能保持旺盛的功能。
同时脐带间充质干细胞还具有取材方便，无伦理学限制，免疫原性相对纯净的优势，可以为实验和临床提供足够的细胞来源。
1资料与方法1.1一般资料经产妇知情同意，采集足月剖宫产健康胎儿脐带，无菌情况下放入含有抗生素的生理盐水中，4℃保存，6h内无菌處理。
1.2脐带的分离和原代培养植块法分离脐带：用止血钳及剪刀无菌取胎儿脐带4~5cm，D-hank’s液充分洗涤，去除脐静脉及动脉内的新鲜血液，分离并去除脐带外膜组织和血管组织，获得脐带wharton胶。
将其剪碎至1mm3组织块，使用吸管将组织块逐一植入T75培养瓶底，密度20~25块/瓶为宜，组织小块在瓶底要分布均匀，倒置放入37℃，体积分数为5%CO2饱和湿度培养箱内。
3~5h 后待组织块粘附牢固正向放置到超净台内，加入适量含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，正向放入体积分数为5%CO2饱和湿度培养箱内。
72h后换液，一般5~7d可有间充质干细胞爬出。
1.3脐带间充质干细胞在不同培养体系的体外扩增将原代细胞完全爬出后，在IMDM、DMEM/F12（不含酚红）、StemProR MSC SFM三种培养体系中传代培养，在生长过程中进行形态学观察。
1.4 流式细胞仪表型检测取生长状态良好的P4代细胞，消化并计数，以每管1×106个细胞，分别加入10μl单克隆抗体CD73、CD34、CD45、CD105、HLA-DR、HLA-ABC及阴性对照lgG1-PE、阳性对照lgG1-FITC，室温避光孵育30min，PBS洗涤两次，室温300g，5min。
PBS重悬后上流式细胞仪。
1.5 cck-8 法检测细胞活性取生长状态良好的P4代细胞，调整细胞浓度至0.2×105/ml，加入96孔板。
每孔90μl放在37℃、体积分数为5%CO2饱和湿度培养箱内培养。
7d内每日上午10:00取出96孔板用与原来孔内相同培养基100μl 换液后加入cck-8溶液，继续孵育1h。
用酶标仪波长450nm测定各孔OD值。
以OD值代表细胞的相对数量，绘制细胞生长曲线。
2结果2.1细胞形态学观察在细胞植块5~7d可见呈纤维样细胞从植块边缘爬出，散在分布或形成小克隆。
2~3w细胞达到70%左右融合，细胞呈平行或旋涡状排列。
下图为传代培养至P2代细胞，1d后观察无血清培养基StemProRMSC SFM和有血清DMEM/F12中脐带间充质干细胞的生长状态。
2.2流式细胞表型特征流式细胞学检测显示，三种培养体系中人脐带间充质干细胞均不表达造血干细胞标记CD34、CD45、HLA-DR、高表达CD73、CD105、HLA-ABC。
2.3 hUC-MSCs在三种培养体系的生长曲线，见图3。
图3 hUC-MSCs在三种培养体系的生长曲线3三种培养体系的比较3.1 DMEM/F12培养基（不含酚红）早期实验室广泛应用的是Eearle’s MEM 即最低必需培养基。
它是建立在平衡盐溶液（BSS）基础上的，它仅含有12种必须氨基酸、谷氨酰胺和8种维生素。
成分简单，可用于哺乳动物细胞类型的培养。
DMEM与最低必需培养基相比，氨基酸含量为MEM的2倍，又添加了甘氨酸、丝氨酸等非必需氨基酸；维生素含量为MEM的四倍，同时含有酵解途径中的重要物质-丙酮酸和微量的铁离子。
而Ham’s F12培养基成分复杂，含有多种微量元素，可加入少量血清培养，特别适合于克隆细胞的培养。
脐带间充质干细胞的培养大多使用的是DMEM/F12，它将含有较丰富成分的F12和高浓度营养成分的DMEM 1:1结合，配制成DMEM/F12培养基。
考虑到DMEM/F12可作为无血清培养基的基础，且适用于血清浓度含量较低条件下哺乳动物的细胞培养，故本实验使用DMEM/F12进行原代细胞的培养，为传代扩增更好的适应另两种培养体系做好基础。
本实验选用不含酚红的DMEM/F12。
由于酚红是一种实验诊断药，在常用的DMEM/F12培养基中被用作PH值的指示剂。
中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。
它在无血清培养基中会引起钠/钾失衡，影响细胞生长；在一些雌激素的研究表明，酚红可以模拟固醇类雌激素作用[1],产生固醇类反应。
而且在后期细胞检测中酚红对流式细胞检测会产生干扰，因此本实验选择了不含酚红的培养基进行原代间充质干细胞培养。
3.2 IMDM 培养基IMDM(Iscove’s Modified Dubecco’s Medium ) 又称为伊思柯夫改良培养液。
此种培养基含有硒、额外的氨基酸和维生素、丙酮酸钠和HEPES,并用硝酸钾取代了硝酸铁；不含α-硫代甘油；不含碳酸氢钠；含酚红。
IMDM适合高密度细胞培养，适用于成纤维细胞培养，一般加入的血清浓度为20%。
3.3无血清培养基StemProRMSC SFM无血清培养基就是在细胞培养中不添加血清的成分，但要添加替代血清成分的补充因子。
①必需补充因子：胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸钠。
胰岛素可以促进RNA、蛋白质和脂肪酸的合成，抑制细胞凋亡，是重要的细胞存活因子[2]。
大多数哺乳动物细胞上存在特定的转铁蛋白受体与转铁蛋白/Fe3+复合物结合是细胞获取必需的微量元素铁的主要来源。
微量元素硒参与谷胱甘肽过氧化物歧化酶的作用过程，消除氧化物酶和氧自由基对细胞的伤害。
②特殊补充因子：生长因子和激素[3]。
生长因子包括表皮生长因子、成纤维细胞生长因子和神经生长因子等。
③激素除了胰岛素外，大多数的哺乳动物细胞还需要一定量的其它激素如甲状腺素、多肽类激素中的生长激素等。
3.4三种培养体系的比较通过细胞生长曲线我们明显看出在含血清培养基中脐带间充质干细胞在DMEM/F12中的生长状态要明显高于IMDM，同时考虑到IMDM所需的血清浓度高，且含有酚红，不利于后续操作中进行减血清到无血清的培养扩增及流式检测。
因此，实际比较的是DMEM/F12和StemProRMSC SFM 两种培养体系。
不可否认血清成分多样，对细胞生长有很大的促进作用。
但同样存在着一些风险：①取材中可能带入支原体、病毒，对细胞产生潜在影响。
②血清中含有一些对细胞有毒性的物质，如多氨氧化酶，能与来自高度繁殖细胞的多胺反应，形成有细胞毒性作用的聚精胺。
③血清的使用使得实验室和生产的标准化很难达到，尤其在临床细胞治疗中存在很大的风险性。
④批间差异。
上述情况看来无血清培养基是目前实验室培养细胞用培养基的首选，但在脐带间充质干细胞种子细胞的培养中无血清培养基仍不能替代有血清培养基。
因此，采用无血清培养最关键的问题是细胞从有血清培养基到无血清培养基的驯化过程。
4从有血清培养基到无血清培养基的驯化按照细胞对无血清培养基的适应性可将培养方法分为直接适应法和连续适应法。
直接适应法即细胞从添加血清的培养基直接转换到无血清培养基中；连续适应法即分好几步把细胞从添加血清的培养基转换到无血清培养基中，与直接适应法相比，连续适应对细胞更加温和。
本次试验将含10%血清的DMEM/F12直接传代至StemProRMSC SFM，通过图3三条不同的生长曲线细胞对比显示StemProRMSC SFM生长和增殖都较慢，证明间充质干细胞转入到无血清培养基中需要一个适应性的过程，更适合于连续培养法，将血清浓度从10%逐步减少到5%，3%，1%直到无血清培养。
同时，无血清培养基对细胞的要求较高：必须是对数生长期的细胞，且活率不应低于90%，适应后应该以较高的起始细胞接种；在培养过程中应该对上一代的混合培养物备份，直到细胞适应新的混合培养基。
此外，在适应过程中，不要让细胞过度生长，这样将增加细胞选择亚群的可能性；需要注意的是无血清培养基中含有非常少的蛋白质，更易于受外界因素的影响。
间充质干细胞从有血清培养基到无血清培养基驯化的过程不仅仅是简单的降血清培养，还有很多需要探索的影响细胞生长的因素。
参考文献：[1]Bethois Y,Katzenellenbogen JA,Katzenellenbogen BS. Phenolred in tissueculture media is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen-responsive cells in culture[J]. ProcNalt Acad SCI USA,1986,83(8):2496-2500.[2]林世康,胡云龙,施国民.动物细胞无血清培养基的应用及研究发展[J].细胞生物学杂志，2000,22（3）:154-157.[3]Gassy MC, Tharakan JP,Chau PC.Serum-free media in hybriddo-ma culture and monocleonal antibody production[J].Biotech ＆Bioeng, 1998,32:1015-1028.。